用获得自活植物的成分减轻阳光的不利影响的制作方法

本申请要求2016年2月25日提交的美国临时专利申请系列号62/299,614的优先权权益，所述申请的公开内容在此以其整体通过引用并入本文。

本公开尤其涉及化妆品领域，且更具体地涉及用获得自活植物的成分减轻阳光的不利影响的领域。

背景技术：

阳光对人体皮肤的破坏作用是众所周知的。过高的暴露导致急性不良反应，包括刺激和炎症，诸如uv诱发的晒伤。然而，超过90％的完整太阳照射光谱在vis-ir范围内，并且其对皮肤损伤的潜在贡献正越来越多地被认可。在能量上不足以引起急性皮肤反应的太阳暴露仍可以触发炎症相关的过程；并且在称为光衰老的过程中，累积的炎性损伤显著地有助于皮肤弹性的降低和不希望的外观的发展。

本发明涉及克服本领域的这些和其它缺陷。

技术实现要素：

本文尤其公开了用获得自活植物的成分(包括局部应用获得自莲(nelumbonuciferagaertn.,sacredlotus)的新鲜(活)全植物和收集自母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)的新鲜(活)花的本发明的生物活性成分)美容护理以减轻阳光对身体或面部的至少一部分皮肤的不利影响的方法。

在一个方面，本公开提供了使用莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(serumfractions)改善与皮肤衰老相关的皮肤外观的方法。该方法包括以下步骤：将抗衰老生物活性组合物应用于具有至少一种衰老迹象的皮肤表面，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分。将抗衰老生物活性组合物应用足以改善至少一种衰老迹象的外观的时间段。在该方法的某些实施方案中，所述抗衰老生物活性组合物进一步包含皮肤病学上可接受的载体。

在另一个方面，本公开提供了使用母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分改善与皮肤衰老相关的皮肤外观的方法。该方法包括以下步骤：将抗衰老生物活性组合物应用于具有至少一种衰老迹象的皮肤表面，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分。将抗衰老生物活性组合物应用足以改善至少一种衰老迹象的外观的时间段。在该方法的某些实施方案中，所述抗衰老生物活性组合物进一步包含皮肤病学上可接受的载体。

根据本公开，出人意料地发现，本文所述的精华液级分各自具有与减轻皮肤衰老的不利影响相关的各种有利特性的组合。此类有利的特性包括，但不限于，以下：(i)uva-uvb区域中的有利光谱吸收特征；(ii)在全光谱模拟的太阳曝光后表明的高uva:uvb吸光度比率以及宽uva和uvb光谱吸收光稳定性(注意uva:uvb吸光度比率的计算可以产生从零(等于无uva吸光度))直至1.0(uva吸光度等于uvb))的值；(iii)当照射剂量增加时，uva1区域中的衰减增加，同时uva/uvb比率增加，这是一种不寻常的、期望的和未预期的特性；(iv)在与全光谱模拟的太阳暴露相关的各种基于体外细胞培养的生物测定和相关酶促模型中表明的有效生物活性(特性)；(v)在全光谱模拟的阳光提供的4med暴露后，维持超过95％的初始(照射前)dpph猝灭能力，从性能的角度来看，这证实了它们的光稳定性；和(vi)其组合。还发现本公开的精华液级分提供多功能活性，所述多功能活性共同作用以减轻全光谱阳光暴露对皮肤细胞的各种不利影响。

本公开的精华液级分和方法相对于现有皮肤衰老产品和方法的另一个优点是精华液级分使用自然界中未发现的分级分离(fractionation)方法源自活植物。此外，如本文所述，获得自活植物的精华液级分是水溶性/可混溶的，并且不需要使用无机颗粒材料，诸如氧化锌。另外，本公开的精华液级分是有利的，因为它们能够减轻阳光暴露的各种不利影响，其中此类无机颗粒材料如氧化锌可能无法做到这一点。

本公开的精华液级分和方法相对于现有皮肤衰老产品和方法的又另一个优点包括精华液级分的优异安全性和毒性概况。如本文所示，基于有利的安全性/毒性概况，可行的是，如果必要或需要，可以使用本公开的精华液级分，其浓度远高于本领域的皮肤衰老产品。尽管本领域已知的一些皮肤衰老产品的活性成分的上限可以为总重量的约15％，但本公开的精华液级分可以“原样”使用(即，以所供应的100％)用于一些应用。

从以下结合附图的本发明的各个方面的详述，本发明的这些和其它目标、特征和优点将变得显而易见。

附图说明

为了说明本发明的各方面的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确安排和手段。此外，如果提供的话，附图中含有的相似参考数字意在标识相似或相同的要素。

图1是表明用于制备本发明的生物活性抗衰老成分的方法的一个实施方案的示意图。

图2显示(在照射之前和之后)5％莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的归一化吸收光谱。

图3显示(在照射之前和之后)5％母菊(chamomillarecutita)(母菊属)(germanchamomile)花精华液级分的归一化吸收光谱。

图4是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的透明质酸荧光染色的定量结果的图。

图5是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的聚丝蛋白荧光染色的定量结果的图。

图6是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的aqp3荧光染色的定量结果的图。

图7是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的荧光染料渗透的定量结果的图。

图8是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的胶原蛋白i荧光染色的定量结果的图。

图9是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的分化的3t3-l1中的甘油释放的定量结果的图。

图10是关于本发明的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的一个实施方案的fontanamasson染色的定量结果的图。

具体实施方式

本公开尤其提供了用于减轻阳光对皮肤的不利影响的方法。本公开还涉及在身体或面部的至少一部分皮肤上美容护理，包括局部应用获得自莲(nelumbonuciferagaertn.,sacredlotus)的新鲜(活)全植物和收集自母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)的新鲜(活)花的本发明的生物活性成分的方法。本公开还涉及制备这些生物活性植物化妆品组合物的方法，以及这些组合物在各种制剂中和作为局部皮肤应用的用途。

本文描述的所有数值范围包括更窄的范围；描绘的范围上限和下限是可互换的，以产生未明确描绘的另外的范围。

在本公开中描述和使用的组合物可以包含基本组分以及本文所述的任选成分，基本上由其组成或由其组成。如本文所用，“基本上由...组成”意味着组合物或组分可以包括另外的成分，但仅当另外的成分不会实质性改变请求保护的组合物或方法的基本和新型特征。

关于组合物使用的术语“应用(apply)”或“应用(application)”意指将本发明的组合物应用或涂抹(spread)在人皮肤表面诸如表皮上。

如本文所用的术语“皮肤病学上可接受的”意味着所述组合物或组分适合用于与人皮肤组织接触而没有不当的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。

如本文所用的术语“有效量”意指化合物或组合物足以显著诱导阳性外观和/或感觉益处、但足够低以避免严重的副作用(即，在技术人员的合理判断范围内，提供合理的益处：风险比)的量。

在一个方面，本公开提供了改善与皮肤衰老相关的皮肤外观的方法。所述方法包括将抗衰老生物活性组合物应用于具有至少一种衰老迹象的皮肤表面的步骤。将抗衰老生物活性组合物应用足以改善至少一种衰老迹象的外观的时间段。

在一个具体方面，本公开提供了使用莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分改善与皮肤衰老相关的皮肤外观的方法。该方法包括将抗衰老生物活性组合物应用于具有至少一种衰老迹象的皮肤表面的步骤，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分。将抗衰老生物活性组合物应用足以改善至少一种衰老迹象的外观的时间段。

在一个实施方案中，所述莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的有效量在以总组合物的重量计0.001％-100％的范围内。

在一个实施方案中，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和皮肤病学上可接受的载体。在更具体实施方案中，抗衰老生物活性组合物包含以总组合物的重量计0.001％至99％的所述莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分。

在另一个方面，本公开提供了使用母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分改善与皮肤衰老相关的皮肤外观的方法。该方法包括将抗衰老生物活性组合物应用于具有至少一种衰老迹象的皮肤表面的步骤，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分。将抗衰老生物活性组合物应用足以改善至少一种衰老迹象的外观的时间段。

在一个实施方案中，所述母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的有效量在以总组合物的重量计0.001％-100％的范围内。

在一个实施方案中，其中所述抗衰老生物活性组合物包含有效量的母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分和皮肤病学上可接受的载体。在更具体实施方案中，抗衰老生物活性组合物包含以总组合物的重量计0.001％至99％的所述母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分。

根据本公开，所述抗衰老生物活性组合物减轻皮肤暴露于阳光的不利影响。

根据本公开，所述抗衰老生物活性组合物具有多功能活性，其协同作用以减轻全光谱阳光暴露对皮肤细胞的不利影响。

根据本公开，所述抗衰老生物活性组合物通过改善皮肤水合作用、皮肤屏障功能、皮肤松弛、皱纹的皮肤外观、排水和体型塑造、皮肤色素沉着和/或肤色(skintone)来有效地改善与皮肤衰老相关的皮肤外观属性。

根据本公开，所述抗衰老生物活性组合物具有选自以下的特性的协同组合：(i)uva-uvb区域中的有利光谱吸收特征；(ii)在全光谱模拟太阳暴露后表明的高uva：uvb吸光度比率以及宽uva和uvb光谱吸收光稳定性；(iii)当照射剂量增加时，uva1区域中的衰减增加，同时uva/uvb比率增加；(iv)在与全光谱模拟的太阳暴露相关的各种基于体外细胞培养的生物测定和相关酶促模型中表明的有效生物活性(特性)；(v)在全光谱模拟的阳光提供的4med暴露后，维持超过95％的初始(照射前)dpph猝灭能力；(vi)多功能活性，其共同作用以减轻全光谱阳光暴露对皮肤细胞的各种不利影响；和(vii)其组合。

根据本公开的方法的各个实施方案，所述皮肤表面选自身体皮肤表面和面部皮肤表面。

在本公开的方法的某些实施方案中，所述抗衰老生物活性组合物进一步包含选自防晒活性剂、抗炎剂和肤色剂的另外成分。

在本公开的方法的其它实施方案中，将所述抗衰老生物活性组合物应用于多种皮肤衰老迹象一段时间，该段时间足以改善多种皮肤衰老迹象的外观。

根据本公开的方法，使用自然界中未发现的分级分离方法分离莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分或母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分。在一个实施方案中，所述分级分离方法包括使源自莲(nelumbonucifera,sacredlotus)植物或母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花的新鲜植物生物质的植物细胞汁经受频率大于2.45ghz的电磁场一段时间，所述时间有效地使植物细胞汁不稳定，产生包含凝结的膜级分的凝结的细胞汁混合物，和从所述凝结的细胞汁混合物中分离所述凝结的膜级分，以得到包含基本上不含所述膜级分的细胞质/胞质溶胶级分的生物活性级分，随后进行另外处理，使细胞质级分与稳定的胞质溶胶级分分离，以得到精华液级分(图1)。

如上所述，一旦将植物细胞汁分离成膜级分和细胞汁上清液，即细胞质/胞质溶胶级分30，其进行另外的处理，使得细胞质级分与胞质溶胶级分分离。

评估胞质级分的完全分离的定量标准是在胞质溶胶级分中不存在可检测水平的高分子量蛋白和/或不存在核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶。

胞质溶胶级分含有溶解于细胞内水中的低分子量水溶性组分。胞质溶胶级分是透明液体，其具有黄色和轻微的特征性气味。在几个小时内，不稳定的胞质溶胶级分被不可逆地转化为深棕色悬浮液，其含有重沉淀和强烈的非特征性气味。作为结果，胞质溶胶级分不能用作化妆品成分。随后描述的程序允许精制胞质溶胶级分以得到稳定和活性的精华液级分。这通过从胞质溶胶级分中除去导致不可逆转化(其导致生成不希望的沉淀和颜色和气味的劣化)的主要组分而完成。该程序包括：如美国专利号7,442,391、8,101,212、8,277,852和8,318,220(其都通过引用并入本文)中所述的ph调节、热处理、冷却、真空过滤和稳定化。

在产生胞质溶胶级分之后，然后将其进行稳定化步骤以得到精华液级分(图1)。适用于本发明的稳定化步骤中的试剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯钠、edta四钠、戊二醇、偏亚硫酸氢钠。

根据本公开的生物活性成分可以根据美国专利号7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852；8,318,220；美国专利申请公开号us-2015/0258012a1和us-2016/0000851a1；和pct/ep2013/073565(其公开内容都通过引用并入本文)从莲(nelumbonuciferagaertn.,sacredlotus)的新鲜(活)全植物和收集自母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)的新鲜(活)花获得，并评估它们减轻阳光的各种不利影响的能力。

用于本发明的方法中的精华液级分不是天然存在的，而是使用人造制造方法产生。在一个实施方案中，该制造方法采用研磨和压榨新鲜活植物(也称为新鲜植物生物质)以获得植物细胞汁(细胞内胶体分散体)，并将其用电磁波以有效地起始从细胞汁分离膜级分的频率处理，以得到基本上不含膜级分的细胞胞质/胞质溶胶级分。在有效地将细胞质/胞质溶胶级分分离成其组分部分(例如，细胞质级分和胞质溶胶级分)的条件下进一步处理细胞质/胞质溶胶级分。用于本发明中的从新鲜植物生物质制备植物级分的方法包括研磨(或浸渍)和压榨新鲜植物生物质以获得含有膜级分的细胞内植物材料(在本文中称为植物细胞汁)，和用电磁波以有效地触发所述膜级分与所述细胞汁级分分离的频率处理所述细胞汁，以得到基本上不含膜级分的细胞胞质/胞质溶胶级分。有利地进行前述处理，使得在所述处理期间所述细胞汁的温度不超过40℃。然后可以利用膜级分以提供稳定的植物化妆品组合物，其表现出抗蛋白水解、细胞生长抑制活性和/或抗蛋白水解和细胞生长抑制活性两者，其中抗蛋白水解活性是由于至少一种蛋白酶的抑制且细胞生长抑制活性是由于至少一种类型细胞的细胞生长的抑制。可以利用细胞质/胞质溶胶级分以提供适合用作药物、化妆品、营养、治疗和/或个人护理制剂等中的组分的植物组合物。在有效地将细胞质/胞质溶胶级分分离成其组分部分(即细胞质级分和胞质溶胶级分)的条件下进一步处理细胞质/胞质溶胶级分。细胞质级分主要包括蛋白质。

通过实例的方式，下面参考图1描述用于制备本发明的生物活性植物化妆品组合物的整个方法。如图1中所描绘，收获、收集和洗涤新鲜活植物以得到新鲜植物生物质2。将该新鲜植物生物质进行研磨、浸渍和压榨4以得到细胞内植物材料(细胞汁)6和富含纤维的材料(压饼)8。然后将细胞汁6过滤通过尼龙网10，以得到过滤的植物细胞汁12。将过滤的细胞汁12以一定频率暴露于电磁波处理14，以触发其去稳定化。然后将去稳定化的细胞汁进行离心18，以得到沉淀的膜级分20和上清液(其为细胞质/胞质溶胶级分30)。膜级分20是可以添加至化妆品中的生物活性植物化妆品组合物，如例如美国专利号7,442,391、8,101,212、8,277,852和8,318,220中所述。植物细胞质/胞质溶胶级分30用于进一步过程，如下所述。

细胞质/胞质溶胶级分30进行如下所概述的另外的处理：i、ii、iii或iv。作为一个非限制性实例，处理(i)可以包括等电沉淀32和随后离心34，其使得能够将沉淀的细胞质级分36与含有胞质溶胶级分的上清液38分离，如例如美国专利号7,442,391、8,101,212和8,277,852中所述。或者，由于(ii)另外的电磁处理(频率>7ghz)，随后离心或过滤，或(iii)膜过滤，或(iv)超滤，或其组合(i、ii、iii、iv)，可以进一步分离细胞溶质/胞质溶胶级分。细胞质/胞质溶胶级分组分可以“原样”使用，或者可以进一步分离和利用。它们也可以用防腐剂和抗氧化剂稳定化，如例如在美国专利号7,442,391；7,473,435；7,537,791；8,043,635；8,101,212；8,277,852和8,318,220中所述。

如上所述，一旦将植物细胞汁分离成膜级分和细胞汁上清液，即细胞质/胞质溶胶级分30，对其进行另外的处理：i、ii、iii或iv(图1)，使得细胞质级分与胞质溶胶级分分离。

评估胞质级分的完全分离的定量标准是在胞质溶胶级分中不存在可检测水平的高分子量蛋白和/或不存在核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶。

胞质溶胶级分含有溶解于细胞内水中的低分子量水溶性组分。胞质溶胶级分是透明液体，其具有黄色和轻微的特征性气味。在几个小时内，不稳定的胞质溶胶级分被不可逆地转化为深棕色悬浮液，其含有重沉淀和强烈的非特征性气味。作为结果，胞质溶胶级分不能用作化妆品成分。随后描述的程序允许精制胞质溶胶级分以得到稳定和活性的精华液级分，其是稳定的化妆品成分。这通过从胞质溶胶级分中除去导致不可逆转化(其导致生成不希望的沉淀和颜色和气味的劣化)的主要组分而完成。该程序包括：如美国专利号7,442,391、8,101,212、8,277,852和8,318,220(其都通过引用并入本文)中所述的ph调节、热处理、冷却、真空过滤和稳定化。

在产生胞质溶胶级分之后，然后将其进行稳定化步骤以得到精华液级分(精华液来源的化妆品组合物)。适用于本发明的稳定化步骤中的试剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯钠、edta四钠、戊二醇、偏亚硫酸氢钠。

适用于本发明中的防腐剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠。

适用于本发明中的合适抗氧化剂的实例是偏亚硫酸氢钠。

合适的螯合剂的实例是edta四钠。

防腐剂增效剂的实例包括戊二醇。

在一个实施方案中，稳定化步骤涉及将细胞精华液级分在至少一种防腐剂、至少一种螯合剂、至少一种抗氧化剂和至少一种防腐剂功效增强剂的混合物中孵育，以得到稳定化的细胞精华液级分。

在另一个实施方案中，稳定化步骤涉及将细胞精华液级分在至少一种防腐剂和至少一种抗氧化剂的混合物中孵育，以得到稳定化的细胞精华液级分。

在本发明的一个实施方案中，精华液来源的化妆品组合物是莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(也称为莲(nelumbonucifera)提取物、莲精华液级分、nn和harmoniance^tm)。

在本发明的另一个实施方案中，精华液来源的化妆品组合物是母菊(chamomillarecutita)(母菊属)(germanchamomile)花精华液级分(也称为洋甘菊花精华液级分、cr-f、recentia母菊(chamomillarecutita)zeta级分)。

本发明还涉及化妆护理方法，其包括在身体或面部的至少一部分皮肤上局部应用含有生理学上可接受的介质的组合物中的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(其也称为莲精华液、harmoniance^tm和nn)，以减轻阳光对皮肤的不利影响。

本发明还涉及化妆护理方法，其包括在身体或面部的至少一部分皮肤上局部应用含有生理学上可接受的介质的组合物中的母菊(chamomillarecutita)(母菊属)(germanchamomile)花精华液级分(也称为洋甘菊花精华液级分、cr-f、母菊(chamomillarecutita)zeta级分)，以减轻阳光对皮肤的不利影响。

用于实施本发明的组合物尤其可以呈水溶液、水醇溶液或油性溶液；和水包油乳液、油包水乳液或多重乳液的形式；它们也可以呈适用于在皮肤、粘膜、嘴唇和/或毛发上应用的悬浮液或粉末的形式。

这些组合物可以或多或少是流体，并且具有霜剂、洗剂、乳、精华液、润发油、凝胶、糊剂或泡沫的外观。它们也可以呈固体形式，诸如棒，或者可以以气溶胶的形式应用于皮肤上。

这些组合物还可以包括在所设想的应用领域中常用的任何添加剂，以及它们的配制所必需的助剂，诸如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、自晒黑剂、颜料、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、化妆品或药物活性剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。

在每种情况下，本领域技术人员将确保选择所述助剂(赋形剂)以及其比例，以便不干扰本发明的组合物的期望的有利特性。这些助剂可以例如对应于组合物的总重量的0.01至20％。当本发明的组合物是乳液时，相对于组合物的总重量，脂肪相可以占5-80重量％，优选5-50重量％。用于组合物中的乳化剂和助乳化剂将选自在所考虑的领域中常规使用的那些。例如，相对于组合物的总重量，它们可以以范围为0.3至30重量％的比例使用。

有利地，除了根据本发明的活性剂之外，能够用于本发明的组合物还可以包括至少一种具有与本发明的那些类似和/或对其补充的作用的其它活性剂。根据本发明，该活性剂将被定义为“另外的活性剂”。

例如，另外的活性剂可以选自：防晒活性剂、抗uv剂、抗vis剂、抗ir剂、光稳定剂、抗衰老剂、调色剂、淡化剂、水化剂、排水剂和微循环-促进剂、药剂、去角质、擦洗剂、细胞外基质刺激剂、能量代谢活化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、镇静剂、抗自由基剂和抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、温热剂、冷却剂和减肥剂。

此类另外的试剂可以选自包括以下的组：维生素a且特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、维生素b3且更特别是烟酰胺、生育酚烟酸酯、维生素b5、维生素b6、维生素b12、维生素c、特别是抗坏血酸、抗坏血酸基葡糖苷、抗坏血酸基四棕榈酸酯、抗坏血酸基磷酸镁和抗坏血酸基磷酸钠、维生素e、f、h、k、pp、辅酶q10、金属蛋白酶抑制剂、timp活化剂、dhea、其前体和衍生物；氨基酸诸如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸酯、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、n-酰基氨基酸化合物、天然或合成肽、包括二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其亲脂性衍生物、异构体和与其它物质诸如金属离子(例如，铜、锌、锰、镁等)的络合物。例如，以商品名matrixyl^tm、argireline^tm、collaxyl^tm、peptidevinci02^tm、chronogen^tm、laminixylis^tm、peptideq10^tm、atpeptide^tm、survixylis^tm、neomatrix^tm商业已知的肽，基于植物的肽提取物，诸如大豆、斯佩耳特小麦、葡萄树、油菜籽、亚麻籽、稻米、玉米、豌豆的提取物，酵母提取物，卤虫藻提取物，脱氢乙酸(dha)，合成或天然来源的植物甾醇，水杨酸及其衍生物，α-和β-羟基酸，氨基糖，葡糖胺，d-葡萄糖胺，n-乙酰基-葡萄糖胺，n-乙酰基-d-葡萄糖胺，甘露糖胺，n-乙酰基甘露糖胺，半乳糖胺，多酚、异黄酮、类黄酮的n-乙酰基半乳糖胺提取物，诸如葡萄提取物、松树提取物和橄榄提取物，脂质诸如神经酰胺或磷脂，动物来源的油，诸如角鲨烯或角鲨烷；植物油，诸如甜杏仁油、椰子油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、油菜籽油、花生油、向日葵油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、大豆油、棉籽油、苜蓿油、罂粟花油、冬南瓜油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、百香果油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油和金盏花油；乙氧基化植物油和乳木果油、所有uv防晒剂和广谱防晒剂。

能够根据本发明使用的组合物可以通过任何合适的途径(特别是通过外部局部途径)应用，并且组合物的制剂将由本领域技术人员调整。

有利地，根据本发明的组合物呈适合于局部应用的形式。因此，这些组合物必须含有生理学上可接受的介质，即与皮肤和皮肤附属物相容，并覆盖所有化妆品形式。

显而易见的是，本发明一般涉及哺乳动物，更具体地涉及人类。

该美容治疗方法的具体实施方案也由以上描述得出。在阅读出于说明性和非限制性目的提供的实施例后，本发明的其它优点和特征将更加显而易见。

实施例

以下实施例旨在说明本发明的具体实施方案，但决非旨在限制本发明的范围。

实施例1莲(nelumbonucifera,sacredlotus)和母菊(chamomillarecutita)(母菊属)(germanchamomile)花精华液级分的测试

用于评估莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的分析、基于细胞培养的生物测定、酶促测定和体外测定和相关测试结果的描述在下文和表1-8和图2-3中描述。

用于测定莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的组成的分析方法如下。

总可溶性糖类：这些精华液级分中的总可溶性糖类分析基于以下中描述的比色法：“estimationofcarbohydratesinplantextracts”byanthrone,yemm和willis,biochemj.；57(3):508–514(1954).用以下方法进行样品分析：标准(双糖混合物)由每种～200ppm的果糖和葡萄糖的组合制成，总共414ppm的单糖。用水连续稀释该储备标准品，并使1ml各溶液与5ml冰冷的2000ppm蒽酮在72％硫酸中反应。将试剂加热至100℃持续10分钟，并由这些溶液在680nm处的吸光度值产生四点校准曲线。将测试样品在水中稀释至基于重量的0.5％溶液并进行相同的反应。使用针对校准曲线比较的这些溶液在680nm处的吸光度，以测定它们的总糖浓度。对于样品和标准品，使用石英1cm比色皿，并用纯水取空白吸光度值。

总酚类化合物含量：这些精华液级分中的总酚类化合物含量通过以下中描述的方法测定：“estimationoftotalphenoliccontentandotheroxidationsubstratesinplanttissuesusingfolin–ciocalteureagent”，ainsworth和gillespie,natureprotocols；2:875-877(2007)。该论文中描述的比色总酚类测定利用folin–ciocalteu(f–c)试剂。f-c测定依赖于碱性介质中的电子从酚类化合物转移至磷钼酸/磷钨酸络合物，其在765nm处光谱测定。根据该方法进行样品分析-从步骤5开始。将步骤5、6和7中的体积加倍，以得到足够体积用于一次性减小体积的比色皿。每种用于测量的样品在单独的比色皿中制备。在步骤6(f-c试剂添加)中，将样品和试剂混合并允许静置～10分钟，然后添加碳酸盐。在两小时结束时，样品和标准(氯原酸)溶液在765nm下相对于空气进行测量；使用氯原酸(标准)校准曲线计算样品中的总酚含量。

莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的分析数据和范围*显示于下表1中：

表1

*莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分“原样”分析。

母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)精华液级分的分析数据和范围*显示于下表2中：

表2

*母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分“原样”分析。

莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的安全性和毒理学概况使用充分描述的方法评价。莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分以最高达100％(未稀释)的浓度进行测试。发现其为：没有刺激性(在皮肤刺激研究(重构的人表皮)中得到证实)；耐受性非常良好(对10名志愿者的人体48小时贴剂测试中)；实际上没有刺激性(眼睛刺激性研究het-cam测试)；没有刺激性(重构的人角膜上皮(rhce)长暴露时间处理测试)；此外，其在光毒性研究中证明没有光毒性潜力(对3t3细胞的中性红摄取光毒性测试，3t3nrupt体外方法)；非致敏物(10％的人类重复损伤贴片，n>200)和非遗传毒性(“ames”细菌回复突变)。

母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的安全性和毒理学概况使用充分描述的方法评价。母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分以最高达100％(未稀释)的浓度进行测试。发现其为：没有刺激性(在皮肤刺激研究(重构的人表皮)中得到证实)；耐受性非常良好(对10名志愿者的人体48小时贴剂测试中)；实际上没有刺激性(眼睛刺激性研究het-cam测试)；没有刺激性(重构的人角膜上皮(rhce)长暴露时间处理测试)；此外，其在光毒性研究中证明没有光毒性潜力(对3t3细胞的中性红摄取光毒性测试，3t3nrupt体外方法)。

基于细胞培养的生物测定利用来自人皮肤(人表皮角质形成细胞，hek)的培养的表皮角质形成细胞，其响应于阳光释放许多信号传导物质，诸如细胞因子(il-6)、趋化因子(il-8)和前列腺素(pge2)。通过诸如酶联免疫吸附测定(elisa)的技术测量这些介体的量。已知能够减少这些炎症介体的hek释放的生物活性成分可以帮助控制由于阳光暴露导致的人体皮肤中的刺激和炎症的迹象。正常人成体表皮角质形成细胞(hek)和所有细胞培养物供应物获得自lifetechnologiesco.(carlsbad,ca,usa)。使细胞生长，且然后在具有添加的人角质形成细胞生长补充剂(hkgs)的角质形成细胞基础培养基154(m154)中在37℃下在5％co2的气氛中维持，并在第2代至第4代之间使用。对于实验，将hek细胞胰蛋白酶化，接种于96孔板中，并生长至～80％汇合度。将细胞洗涤一次，并用pbs替换m154。洗涤和替换两者均用pbs进行，以除去m154的光吸收组分。然后将含有hek的96孔板用uv透明的1mm石英片覆盖，置于白色基础顶控制的peltier冷却表面上(保持室温)，并用20j/cm²的剂量的人工产生的全光谱阳光以约1100w/m²的剂量率照射，如经由日射强度计通过相同的石英盖所测量。然后去除pbs并用m154替换，并将细胞与测试物品和/或对照一起孵育16小时。照射设备获得自solarlightcompany,glenside,pa，并包括使用平面镜的以airmass1.5配置的solarsimulatorls1000-6r-002；xps1000精密电流源，和pma2144日射强度计。除了存在阳光之外，用充当无应力对照的hek进行相同的操作。孵育之后，收集hek细胞上清液。使用elisa试剂盒(r&dsystemsinc,minneapolis,mn)来定量上清液中的白介素。通过人cxcl/il-8免疫测定试剂盒(目录号d8000c)定量il-8，通过人il-6免疫测定试剂盒(目录号d6050)定量il-6；且使用parameter^tm前列腺素e2测定(目录号kge004b)定量pge2。通过用sigmaplot10.0(systat软件)的s形曲线拟合计算ic50(将白介素或前列腺素水平降低至50％所需的测试物品的浓度，来自未照射细胞的样品被视为0％，且来自照射细胞的样品被视为100％)值。较低的ic50值表明较高的功效和效力程度。

orac(氧自由基吸收能力)通过orac测试使用来自biotek的“performingoxygenradicalabsorbancecapacity(orac)assayswithsynergyhtmulti-detectionmicroplatereader”应用注释中描述的方法[www.biotek.com/resources/docs/orac_assay_application_note.pdf](其经修改，用于与来自biotekinstrumentsinc(winooski,vt)的synergy2微孔板阅读器一起使用)来测定。在该测定中，aaph(2,2'-偶氮二-2-氨基-丙烷)生成活性氧物质，其损害荧光探针(荧光素钠)。抗氧化剂诸如(r)-trolox甲基醚防止或减缓这种损害，并且其效果可以通过荧光测量来定量。在37℃下连续拍摄荧光读数2小时，激发波长设定为485nm，且发射波长设定为528nm，其中反应体积为200μl，aaph浓度为55mm，荧光素钠浓度为1.33μm，且(r)-trolox甲基醚浓度范围在80μm和2μm之间。荧光素钠(fluka46960)、aaph(sigma440914)和(r)-trolox甲基醚(fluka93509)获得自sigma-aldrich(st.louis,mo)。将auc(曲线下面积)值计算为比例总和(孔的当前荧光读数除以孔的第一荧光读数)。从具有(r)-trolox甲基醚的孔和具有测试物品的孔的auc中减去具有去离子水的孔的auc值的平均值，以获得对应于通过抗氧化剂保持荧光的auc。生成校准曲线作为显示(r)-trolox甲基醚重量当量orac活性的孔的抗氧化剂相关auc的函数。然后将测试物品的orac活性计算为实现等于1mg(r)-trolox甲基醚产生的抗氧化效果的抗氧化效果所必需的1g测试物品，其中较低数字表明较高orac活性。

dpph(2,2-二苯基-1-苦基肼基)测定。自由基是具有一个或多个未配对的价壳层电子的分子或原子。此类物质是经常、但不总是不稳定、化学瞬态和高反应性的。自由基可以通过许多过程(包括燃烧、阳光照射和正常代谢-特别是涉及细胞呼吸、免疫反应和炎症过程)产生。在生物系统中，自由基最通常涉及氧代谢和活性氧物质。自由基的高反应性可以让它们损害生物分子。在此类反应的产物本身是自由基的情况下，这可以导致一系列的损害。这种损害可以触发炎症反应，可能导致有害的自我维持环。这在人体皮肤中特别相关，因为该器官最常暴露于生成自由基的环境应激。因此，测量物质猝灭或清除自由基的能力的方法可用于确定哪些物质是有效的抗氧化剂并且可以帮助减轻和预防与自由基和它们引发的过程相关的皮肤损伤迹象。一种常见的方法涉及使用稳定的自由基，其在自由基状态下的同时由于电子离域而强烈着色，并且如果猝灭则失去该颜色。dpph是一种非常适用于比色测定的稳定的有机自由基，因为其自由基形式是固体形式的紫黑色和甲醇溶液中的紫色，而猝灭形式在溶液中为淡黄色。该变化可以测量为515nm波长处吸光度的降低。这种降低的动力学还可以提供关于通过测试物品清除自由基的速度的定性判断。dpph(2,2-二苯基-1-苦基肼基)自由基清除活性通过动力学比色测定法测定，所述测定法适合与来自sun-sri(rockwood,tn)的玻璃涂覆的聚丙烯96孔微量滴定板(目录号400062)和来自biotekinstrumentsinc(winooski,vt)的synergy2微孔板阅读器一起使用。在515nm波长下测量吸光度。每个微孔板孔中的反应体积为200μl，其中dpph的初始浓度等于114μm。dpph(sigmad9132)获得自sigma-aldrich(st.louis,mo)。计算反应的化学计量并表示为猝灭1mgdpph所需的1g测试制品，其中较低数字表示较高活性。该方法改编自w.brand-williams等人出版于lwt-foodscienceandtechnology,volume28,issue1,1995,pp25-30的文章“useofafreeradicalmethodtoevaluateantioxidantactivity”中描述的程序。

在dpph测定中评估莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分。在临测试前在去离子水中制备莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的5％v/v稀释液。将这些稀释液中的70微升等分试样(足以在测试装置中形成弯月面的量)以及作为空白的去离子水置于石英96孔微量滴定板(透明底部，黑色侧面，获得自hellmaanalytics)的孔中。用1毫米厚的石英片覆盖该板。将覆盖的板置于白色基础顶peltier冷却的表面(具有微孔板支架附件的torreypinesscientific加热/冷却干浴/振荡器)上。珀耳帖冷却被设定为15摄氏度。用具有对应于空气质量1.5的滤光片和镜子配置的太阳模拟器(来自solarlight的ls-1000)照射板。在照射样品前，使用具有红斑检测器的数据记录照射计(均来自solarlight的pma2100和2101)测量对应于通过1毫米石英片的太阳模拟器光的1最小红斑剂量(med)的时间。将具有样品的石英板照射对应于暴露于4med的时间。

如上所述，在dpph猝灭测定中测试莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分-照射之前和之后，反应体积中的浓度范围为约10％v/v至约0.2％v/v，其中去离子水用作稀释剂。

在通过全光谱模拟阳光提供的4med暴露之后，莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液组分保持其初始dpph猝灭能力的超过95％-如表3和4中所示。

表3在照射之前和之后的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的dpph活性

表4在照射之前和之后的母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液组分的dpph活性

根据fda,finalrule2011测定临界波长(cw)，nm。在4med预照射之后，在290nm和400nm之间测量0.75mg/平方厘米膜的吸光度。cw定义为光谱吸光度曲线的积分达到290至400nm的积分的90％的波长。

莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的吸光度光谱和光稳定性评估：在临测试前在去离子水中制备莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的5％v/v稀释液。将这些稀释液中的70微升等分试样(足以在测试装置中形成弯月面的量)以及作为空白的去离子水置于石英96孔微量滴定板(透明底部，黑色侧面，获得自hellmaanalytics)的孔中。用1毫米厚的石英片覆盖该板。将覆盖的板置于白色基础顶peltier冷却的表面(具有微孔板支架附件的torreypinesscientific加热/冷却干浴/振荡器)上。珀耳帖冷却被设定为15摄氏度。板支架温度为18℃。用具有对应于空气质量1.5的滤光片和镜子配置的太阳模拟器(来自solarlight的ls-1000)照射板。在照射样品前，使用具有红斑检测器的数据记录照射计(均来自solarlight的pma2100和2101)测量对应于通过1毫米石英片的太阳模拟器光的1最小红斑剂量(med)的时间。将具有样品的石英板照射对应于1、4和8med的总暴露。对于该测试，1med为14分25秒。板顶在照射期间达到约36度的最大值。在照射前以及1、4和8med总体暴露后使用bioteksynergy2微孔板阅读器获得微孔板内容物在280纳米至500纳米的波长下的吸光度光谱。

对于稀释的精华液级分，从吸光度曲线减去用去离子水得到的孔的吸光度曲线。然后将这些空白减去的曲线进行归一化，用于更清晰地定性比较形状和比例。归一化是重新缩放，其将曲线的最大吸光度视为1，并将曲线的最小吸光度视为0。通过归一化吸光度曲线清楚地显示这些降低的不同性质。

莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的uva-uvb比率基于在290nm和400nm之间测量的归一化吸光度曲线-在照射之前和之后-进行测定。将曲线下面积在290-320(uvb区域)之间的比率与在320nm和400nm之间的曲线下面积(uva区域)进行比较。uva/uvb比率是行业用于测定各种成分、防晒活性剂和成品的保护潜力和光稳定性的所选参数。

5％莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的归一化吸收光谱(图2)显示，增加对模拟全光谱阳光的暴露导致约310nm至约380nm波长的成比例更高的衰减，其中最显著的差异是在约350纳米处的峰值。照射后uva/uvb比率的有益变化(表5中所示)主要对应于uva1(340nm-400nm)区域中的吸光度的增加。

表5在照射之前和之后的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的uva/uvb比率

5％母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的归一化吸收光谱(图3)显示暴露于1med引起约310nm至约340nm的成比例较低的吸光度。进一步照射不会引起吸收光谱的显著变化。因此，照射后uva/uvb比率的轻微降低(表6中所示)主要对应于uva2区域(320nm-340nm)和部分uvb区域(290nm-320nm)的吸光度降低。

表6在照射之前和之后的母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液组分的uva/uvb比率

出人意料地发现，莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分和母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分成分各自具有以下的协同组合：在与全光谱太阳暴露相关的各种基于体外细胞培养的生物测定和相关酶促模型中表明的uva-uvb区域中的有益光谱吸收特征以及有效的生物活性。在全光谱模拟的阳光提供的4med暴露后，两种成分均维持超过95％的初始(照射前)dpph猝灭能力。

随着照射剂量增加，莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分表明在uva1区域中增加的衰减，这是不寻常的、期望的和未预期的特性。

莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的活性概述下表7中。

表7

母菊(chamomillarecutita,germanchamomile)花精华液级分的活性概述于下表8中。

表8

实验结果表明，本发明的成分提供多功能活性，所述多功能活性共同作用以减轻全光谱阳光暴露对皮肤细胞的各种不利影响。

实施例2与配方中的安慰剂相比，莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分对皱纹外观的影响

目标：该实验的目标是研究莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(在本文中也称为harmoniance^tm)对皱纹外观的影响。

方法：这是在20名志愿者的脸上进行8周时段的针对安慰剂的比较性双盲研究。主要评价标准基于通过条纹投影3d成像(dermatop*)的皮肤形貌测量。

实验方案：面部的每一侧接受在皮肤护理配方中配制成0.5％的生物功能产品或其安慰剂。在那之前，进行调理阶段；该研究中的安慰剂乳膏用作调理产品，其在d0访问前8天分发给受试者。第一次应用在d0的测量后在实验室进行。以下由受试者完成，每天两次，早晨和晚上，直到测试结束。志愿者在访问日d56前一晚停止乳膏应用。

结果：应用四周后，与安慰剂处理侧相比，生物功能治疗侧的不同皱纹参数(体积和面积)以及皮肤微缓解(rz)显著降低，并且在应用八周后保持降低。

此外，在应用八周后，我们观察到与安慰剂处理侧相比，用含有0.5％harmoniance的乳膏处理侧的皱纹数量显著减少。

下面在表9-12中提供了与安慰剂相比的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的皱纹外观处理效率的数据。

皱纹测量的数量

表9说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧，通过条纹投影的皱纹数量的测量值，dx和d0之间的差异。

表9

dx是d28或d56。ns：不显著；**：用student’st-检验或wilcoxon检验，非常显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-semn＝18。变化的％＝100*[(d56harmoniance-d0harmoniance)-(d56安慰剂-d0安慰剂)]/((d0harmoniance+d0安慰剂)/2)。

皱纹测量的体积

表10说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧，通过条纹投影的皱纹体积(mm³)的测量值，dx和d0之间的差异。

表10

dx是d28或d56。*：用student’st-检验或wilcoxon检验，显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-semn＝18。变化的％＝100*[(dxharmoniance-d0harmoniance)-(dx安慰剂-d0安慰剂)]/((d0harmoniance+d0安慰剂)/2)。

皱纹测量的面积

表11说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧，通过条纹投影的皱纹面积(mm²)的测量值，dx和d0之间的差异。

表11

dx是d28或d56。*：用student’st-检验或wilcoxon检验，显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-semn＝18。变化的％＝100*[(dxharmoniance-d0harmoniance)-(dx安慰剂-d0安慰剂)]/((d0harmoniance+d0安慰剂)/2)。

rz测量

表12说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧，通过条纹投影的rz参数(mm)的测量值，dx和d0之间的差异。

表12

dx是d28或d56。*：用student’st-检验或wilcoxon检验，显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-semn＝18。变化的％＝100*[(dxharmoniance-d0harmoniance)-(dx安慰剂-d0安慰剂)]/((d0harmoniance+d0安慰剂)/2)。

一般结论：双盲研究的目的是与安慰剂乳膏相比，体内评估用含有harmoniance的乳膏处理对皱纹外观的影响。

首先通过皱纹数量以及它们的体积和面积的显著减少来证实该效果。

此外，皮肤微缓解(rz)在用0.5％harmoniance应用四周后显著减少，表明皮肤更光滑。

在鱼尾纹的彩色图片和皮肤形貌图片上观察到皮肤的平滑和皱纹的减少。

在目前条件下，这些结果证实0.5％harmoniance减少皱纹外观的效力。

实施例3与配方中的安慰剂相比，莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分对皮肤水合作用的影响

目标：该实验的目标是研究莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(在本文中也称为harmoniance^tm)对皮肤水合作用的影响。

方法：这是在20名志愿者的前臂上进行6小时时段的针对安慰剂的比较性双盲研究。主要评价标准基于皮肤水合作用测量。

实验方案：在前臂上测定两个彼此相对的30cm²的区域，用于测量和应用在皮肤护理配方中配制成0.5％的生物功能产品或其安慰剂。对于未处理的条件，在这些区域之一下确定第三区域。唯一应用在t0的测量后在实验室进行。

结果：我们注意到，与安慰剂乳膏相比，在应用含有harmoniance的乳膏后3小时和6小时的皮肤水合作用的高度显著改善。

下面在表13-15中提供了与安慰剂相比的莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分的皮肤水合作用处理效率的数据。

皮肤水合作用测量

使用电容方法用corneometer*cm825(courage&khazaka*)进行水合作用测量。

表13说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧的水合作用测量值(电容，au)，tx和t0之间的差异。

表13

tx是t3h或t6h。***：用student’st-检验或wilcoxon检验，高度显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-sem，n＝20。变化的％＝100*[(txharmoniance-t0harmoniance)-(tx安慰剂-t0安慰剂)]/((t0harmoniance+t0安慰剂)/2)。

我们注意到，与安慰剂乳膏相比，在用含有harmoniance的乳膏应用后3小时和6小时的皮肤水合作用的高度显著改善。

经表皮水损失

用aquaflux*af200(biox*)(其为冷凝室(封闭室)测量方法)测量经表皮水损失(tewl)。该封闭室设计消除了通过外部空气运动对测量的干扰。

由于测量期间的技术问题，在t6h，此时对16名志愿者给出结果。

表14说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧的tewl测量值(g/m²h)，tx和t0之间的差异。

表14

tx是t3h或t6h。***：用student’st-检验或wilcoxon检验，高度显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-sem，在t3h时，n＝20，且在t6h时，n＝16。变化的％＝100*[(txharmoniance-t0harmoniance)-(tx安慰剂-t0安慰剂)]/((t0harmoniance+t0安慰剂)/2)。

在应用后3小时和6小时观察到tewl的高度显著降低。

皮肤柔软度测量

用frictiometer*fr700(courage&khazaka*)进行柔软度测量。

表15说明对于0.5％harmoniance处理侧和安慰剂处理侧的柔软度测量值(au)，tx和t0之间的差异。

表15

tx是t3h或t6h。***:用student’st-检验或wilcoxon检验，高度显著，这取决于数据是否遵循正态分布；平均值+/-sem，n＝20。变化的％＝100*[(txharmoniance-t0harmoniance)-(tx安慰剂-t0安慰剂)]/((t0harmoniance+t0安慰剂)/2)。

在应用后3小时和6小时观察到皮肤柔软度的高度显著改善。

一般结论：双盲研究的目的是体内评估用含有harmoniance的乳膏处理对皮肤水合作用的影响。

首先通过一次单一应用后皮肤水合作用的显著增加来证实该影响。

此外，该改善的特征在于tewl的显著降低，表明0.5％的harmoniance可以恢复皮肤屏障功能。

用摩擦计的测量指出在应用含有harmoniance的乳膏后皮肤柔软度的增强。

在目前条件下，这些结果证实0.5％harmoniance促进皮肤水合作用的效力。

实施例4莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分对培养细胞和正常人皮肤活检组织的影响

目标：在该研究中，我们在体外和离体评估莲(nelumbonucifera,sacredlotus)精华液级分(在本文中也称为harmoniance^tm)对4种不同轴中牵涉的参数的影响：皮肤水合作用和屏障功能、皮肤松弛、排水和皮肤色素沉着。

a.皮肤活检组织中的透明质酸荧光染色

皮肤活检组织：正常人皮肤来自对26岁女性的乳房的整形手术干预。用6mm直径冲头(pfmmedical)获得皮肤活检组织。将它们在补充有10％fbs(lonza)、2mm谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的含有50％dmem1g/l葡萄糖(lonza)和50％ham’s-f12(lonza)的培养基中培养。将皮肤活检组织在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

对53岁女性供体的乳房皮肤和64岁女性供体的手臂皮肤进行另外的实验。

试剂：生物素化的透明质酸结合蛋白(bhabp)购自coger且链霉抗生物素蛋白-alexafluor*488缀合物购自invitrogen。

原理：使用特异性生物素化的结合蛋白：bhabp检测透明质酸糖胺聚糖。通过与荧光染料缀合的链霉抗生物素蛋白识别生物素允许在荧光显微镜下检查。

处理：将皮肤活检组织一式两份处理，用安慰剂条件下的pbs(lonza)或0.5％或1％的harmoniance处理，每天两次，持续48小时。在活检组织的顶部应用20μl溶液。

活检组织制备：为了允许保存皮肤并切片，将组织在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的皮肤活检组织用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于superfrostplus*载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。在pbs洗涤后，应用以1/400稀释的bhabp，并将载片在室温下在潮湿室中在搅拌下孵育2小时。在用pbs冲洗载片后，在黑暗中在搅拌下在室温下在潮湿室中应用以1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白alexafluor*488缀合物1小时。最后，将切片用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,molecularprobes*)以0.3μm染色5分钟，并封固于fluoromount-g*(electronmicroscopysciences)中。使用具有20x物镜的zeissaxiovert200m显微镜管理和检查检测。用与volocity*采集软件偶联的qimaging*exi蓝色相机(improvision)拍摄照片。

图像定量：用volocity*图像分析软件(improvision)分析每个条件三张照片，其允许由于荧光强度而选择感兴趣的区域。获得的结果是所选区域中绿色像素强度的总和。最后，对于每张照片，通过考虑检查的表皮和真皮区域的面积来调整获得的总和。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：透明质酸荧光染色的定量显示于图4中。用volocity*图像分析软件。相比于安慰剂表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝3；*：显著；**非常显著；***：高度显著)。对两名其他供体证实该实验。

结论：当用1％的harmoniance处理皮肤活检组织48小时时，离体结果表明透明质酸荧光染色增加。

b.皮肤活检组织中的聚丝蛋白免疫荧光染色

皮肤活检组织：正常人皮肤来自对53岁女性的乳房的整形手术干预。用6mm直径冲头(pfmmedical)获得皮肤活检组织。将它们在补充有10％fbs(lonza)、2mm谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的含有50％dmem1g/l葡萄糖(lonza)和50％ham’s-f12(lonza)的培养基中培养。将皮肤活检组织在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

对64岁女性供体的手臂皮肤进行另外的实验。

抗体：用于该研究的一抗是：以1/100稀释的抗丝聚蛋白(santacruz)小鼠单克隆抗体，持续一个半小时。使用的二抗是：以1/1000稀释的alexafluor*488驴抗小鼠(invitrogen)，持续一小时。

原理：免疫荧光是一种允许通过结合特异性一抗使组织切片中的特定蛋白可视化的技术。用荧光染料标记的二抗用于识别一抗。然后在荧光显微镜下检查免疫荧光染色的样品。用dapi的复染允许使细胞核可视化并定位表皮。

处理：将皮肤活检组织一式两份处理，用安慰剂条件下的pbs(lonza)或1％的harmoniance处理，每天两次，持续48小时。在活检组织的顶部应用20μl溶液。

活检组织制备：为了允许保存皮肤并切片，将组织在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的皮肤活检组织用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于polysine*载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。然后，进行去掩蔽方案，包括在37℃下0.25％胃蛋白酶(zymed,invitrogen)/消化15分钟。在pbs洗涤并用5％bsa(sigma)的溶液在30分钟内饱和非特异性位点之后，应用一抗并将载片在搅拌下在室温下在潮湿室中孵育。用pbs冲洗载片后，在黑暗中在搅拌下在室温下在潮湿室中应用二抗。最后，将细胞核用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,molecularprobes*)以0.3μm染色5分钟，并将切片封固于fluoromount-g*(electronmicroscopysciences)中。使用具有20x物镜的zeissaxiovert200m显微镜管理和检查检测。用与volocity*采集软件偶联的qimaging*exi蓝色相机(improvision)拍摄照片。

图像定量：用volocity*图像分析软件(improvision)分析每个条件三张照片，其允许由于荧光强度而选择感兴趣的区域。获得的结果是所选区域中绿色像素强度的总和。最后，对于每张照片，通过考虑检查的表皮区域的长度来调整获得的总和。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：聚丝蛋白荧光染色的定量显示于图5中。用volocity*图像分析软件。相比于安慰剂表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝3；***：高度显著)。对另一名供体证实该实验。

结论：我们观察到，与安慰剂处理的相比，用1％harmoniance处理48小时的皮肤活检组织中聚丝蛋白荧光强度的增强。

c.皮肤活检组织中的aqp3免疫荧光染色

皮肤活检组织：正常人皮肤来自对53岁女性的乳房的整形手术干预。用6mm直径冲头(pfmmedical)获得皮肤活检组织。将它们在补充有10％fbs(lonza)、2mm谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的含有50％dmem1g/l葡萄糖(lonza)和50％ham’s-f12(lonza)的培养基中培养。将皮肤活检组织在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

对64岁女性供体的手臂皮肤进行另外的实验。

抗体：用于该研究的一抗是：以1/100稀释的抗aqp3(santacruz)山羊多克隆抗体，持续一个半小时。使用的二抗是：以1/1000稀释的alexafluor*488驴抗山羊(invitrogen)，持续一小时。

原理：免疫荧光是一种允许通过结合特异性一抗使组织切片中的特定蛋白可视化的技术。用荧光染料标记的二抗用于识别一抗。然后在荧光显微镜下检查免疫荧光染色的样品。

处理：将皮肤活检组织一式两份处理，用安慰剂条件下的pbs(lonza)或1％的harmoniance处理，每天两次，持续48小时。在活检组织的顶部应用20μl溶液。

活检组织制备：为了允许保存皮肤并切片，将组织在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的皮肤活检组织用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于polysine*载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。然后，进行去掩蔽方案，包括在柠檬酸盐缓冲液0.01mph6(sigma)中以600w微波暴露，直至沸腾。在pbs洗涤并用5％bsa(sigma)的溶液在30分钟内饱和非特异性位点之后，应用一抗并将载片在搅拌下在室温下在潮湿室中孵育。用pbs冲洗载片后，在黑暗中在搅拌下在室温下在潮湿室中应用二抗。最后，将切片封固于fluoromount-g*(electronmicroscopysciences)中。使用具有20x物镜的zeissaxiovert200m显微镜管理和检查检测。用与volocity*采集软件偶联的qimaging*exi蓝色相机(improvision)拍摄照片。

图像定量：用volocity*图像分析软件(improvision)分析每个条件八张照片，其允许由于荧光强度而选择感兴趣的区域。获得的结果是所选区域中绿色像素强度的总和。最后，对于每张照片，通过考虑检查的表皮区域的面积来调整获得的总和。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：aqp3荧光染色的定量显示于图6中。用volocity*图像分析软件。相比于安慰剂表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝8；***：高度显著)。对另一名供体证实该实验。

结论：我们观察到，与安慰剂处理的相比，用1％harmoniance处理48小时的皮肤活检组织中aqp3荧光强度的增强。

d.重构表皮中的皮肤屏障功能的评估

重构的人表皮(rhe)：用于该研究的角质形成细胞是从3岁供体的包皮中分级分离的精华液。将它们在无血清且具有100μg/mlprimocin*(invivogen)的培养基中生长。将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。然后，将细胞接种在惰性聚碳酸酯膜(0.5cm²插入物，nunc)上，并在化学确定的培养基(rosdym.和claussl.c.,1990；rosdym.等人,1993)上在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中在12天期间空气提升。

用从3岁供体的包皮和24岁供体的腹部皮肤分级分离的角质形成细胞精华液获得另外的数据。

试剂：用于该研究的荧光染料是荧光黄(santacruz)。

原理：荧光黄染料允许评估皮肤屏障完整性，染料在表皮层中的渗透与皮肤屏障的渗透性相关。

处理：在重构17天后，将rhe用0.15％sds(sigma)局部应激3小时或不局部应激，然后用安慰剂条件下用pbs(lonza)或用0.5％或1％的harmoniance处理，每天两次，持续48小时。pbs-冲洗后，添加1mm荧光黄荧光染料并孵育1小时。将rhe用pbs再次洗涤并从其插入物中取出。

rhe制备：为了允许保存rhe，将它们在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的rhe用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。最后，将细胞核用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,molecularprobes*)以0.3μm染色5分钟，并将切片封固于fluoromount-g*(electronmicroscopysciences)中用于成像。使用具有20x物镜的zeissaxiovert200m显微镜管理和检查检测。用与volocity*采集软件偶联的qimaging*exi蓝色相机(improvision)拍摄照片。

图像定量：用volocity*图像分析软件(improvision)分析每个条件三张照片，其允许由于荧光强度而选择感兴趣的区域。获得的结果是荧光的面积最后，对于每张照片，通过考虑总体表皮区域的面积来调整获得的结果。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：荧光染料渗透的定量显示于图7中。用volocity*图像分析软件。相比于0.15％sds表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝3；***：高度显著)。对两名其他供体证实该实验。

结论：我们观察到，在对重构表皮sds应激后，用1％harmoniance处理的皮肤屏障恢复的改善。

f.成纤维细胞上的胶原蛋白i免疫荧光染色

成纤维细胞：用于该研究的成纤维细胞从53岁女性供体的正常人皮肤提取。使它们在补充有10％offbs(lonza)、2mml-谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的dmem1g/l葡萄糖(lonza)中生长。将细胞在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

抗体：用于该研究的一抗是：以1/100稀释的抗胶原蛋白i(rockland)兔多克隆抗体，持续一个半小时。使用的二抗是：以1/1000稀释的alexafluor*488驴抗兔(invitrogen)，持续一小时。

原理：免疫荧光是一种允许通过结合特异性一抗使细胞中的特定蛋白可视化的技术。用荧光染料标记的二抗用于识别一抗。然后在荧光显微镜下检查免疫荧光染色的样品。用dapi的复染允许使细胞核可视化。

细胞制备：将细胞接种于8孔玻璃室载片(falcon)中。每种条件分析两个孔。

处理：将细胞用直接稀释于培养基中的0.01％的harmoniance一式两份每天两次处理48小时，或不处理。

方案：在处理后，将细胞用pbs冲洗，并在4℃下用冷甲醇固定4分钟。然后将细胞在搅拌下在室温下与一抗一起孵育。在三次pbs-洗涤后，在黑暗中在搅拌下在室温下应用二抗。用pbs另外洗涤三次后，将细胞核用4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(dapi,molecularprobes*)以0.3μm染色5分钟，并将载片封固于fluoromount-g*(electronmicroscopysciences)中。使用具有20x物镜的zeissaxiovert200m显微镜管理和检查检测。用与volocity*采集软件偶联的qimaging*exi蓝色相机(improvision)拍摄照片。

图像定量：用volocity*图像分析软件(improvision)分析每个条件三张照片，其允许由于胶原蛋白i荧光强度而选择细胞。获得的结果是所选区域中绿色像素强度的总和。最后，对于每张照片，通过考虑细胞的面积来调整获得的总和。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：胶原蛋白i荧光染色的定量显示于图8中。用volocity*图像分析软件。相比于未处理者表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝3；***：高度显著)。

结论：我们观察到，用0.01％harmoniance处理48小时的成纤维细胞上的胶原蛋白i荧光强度的统计学显著的体外增强。

g.皮肤活检组织中uv应激后的弹性纤维

皮肤活检组织：正常人皮肤来自对30岁女性的乳房的整形手术干预。用6mm直径冲头(pfmmedical)获得皮肤活检组织。将它们在补充有10％fbs(lonza)、2mm谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的含有50％dmem1g/l葡萄糖(lonza)和50％ham’s-f12(lonza)的培养基中培养。将皮肤活检组织在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

试剂：elasticavangieson染色试剂盒(merck)用于染色弹性纤维。

原理：根据weigert的间苯二酚-品红溶液与vangieson的picrofuchsin溶液的组合允许弹性纤维(呈黑-紫色)和胶原蛋白(呈红-粉红色)的可视化。

处理：将皮肤活检组织用1％的harmoniance一式两份每天两次处理48小时，或不处理。在活检组织的顶部应用20μl溶液。然后将皮肤活检组织用单剂量的5j/cm²uva和200mj/cm²uvb进行应激，并再孵育10小时，然后染色。使用uva烘箱型blx-e365和uvb烘箱型blx-e312(fisherbioblockscientific)。

活检组织制备：为了允许保存皮肤并切片，将组织在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的皮肤活检组织用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于polysine*载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。在pbs洗涤后，将切片在根据weigert的间苯二酚-品红溶液中孵育15分钟。将切片在水中洗涤5分钟。在切片上应用根据vangieson的picrofuchinin溶液2分钟。在几次连续的水、乙醇和二甲苯浴后，将载片封固于eukitt*(o.kindler)中，并使用具有40x物镜的eclipsee600显微镜(nikon)进行检查。用qimaging*exi蓝色相机拍摄照片，并使用q-capturepro7软件(qimaging*)进行处理。

结论：当皮肤用1％的harmoniance预处理时，观察到更好的弹性纤维的组织。

h.3t3-l1脂肪细胞中的甘油释放测定

3t3-l1脂肪细胞：使3t3-l1前脂肪细胞(atcc)(px+8)在补充有10％fbs(lonza)、2mml-谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的dmem4.5g/l葡萄糖(lonza)中生长。

在细胞汇合后2天，通过在培养基中添加0.5mmibmx、1μm地塞米松和10μg/ml胰岛素(sigma)来诱导分化成脂肪细胞3天。其后，除去ibmx和地塞米松，并仅维持胰岛素3至4天；然后，还除去胰岛素，并将细胞在培养基中再维持3天。

试剂：使用脂肪分解测定试剂盒(caymanchemical)测量甘油释放。

原理：脂肪分解是甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油释放的量将与储存的甘油三酯的量和脂肪分解程度成比例。

细胞制备：将细胞接种于24孔板(thermofisherscientific)中。

处理：将分化的细胞用直接稀释于培养基中的0.01％的harmoniance或用2mm的咖啡因一式两份每天一次处理48小时，或不处理。

方案：使用供应商推荐进行测定。

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：分化的3t3-l1中甘油释放的定量显示于图9中。相比于未处理者表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝2；～：几乎显著；*：显著)。对两名其他供体证实该实验。

结论：我们观察到用0.01％harmoniance处理48小时的3t3-l1的甘油释放的统计学显著的体外增强。

i.皮肤活检组织中的黑色素染色

皮肤活检组织：正常人皮肤来自对52岁女性的乳房的整形手术干预。用6mm直径冲头(pfmmedical)获得皮肤活检组织。将它们在补充有10％fbs(lonza)、2mm谷氨酰胺(lonza)和100μg/mlprimocin*(invivogen)的含有50％dmem1g/l葡萄糖(lonza)和50％ham’s-f12(lonza)的培养基中培养。将皮肤活检组织在37℃下在含有5％co2的潮湿气氛中维持。

对60岁女性供体的腹部皮肤进行另外的实验。

试剂：fontana-masson染色需要储备溶液制备，其通过将氢氧化铵(acrosorganics)添加至硝酸银的溶液(sigma)中而形成。在使用前将该溶液静置24小时。

原理：黑色素是一组与蛋白结合的棕-黑色素。黑色素由黑色素体中的黑色素细胞合成，且然后传递至基底表皮的角质形成细胞，在那里它们在细胞核上形成帽。

fontana-masson染色基于黑色素在不使用外部还原剂的情况下将氨性硝酸银溶液还原成金属银(棕色)的能力。

处理：将皮肤活检组织用0.5％-1％-3％的harmoniance或用20mm曲酸一式两份每天两次处理48小时或不处理。在活检组织的顶部应用20μl溶液。

活检组织制备：为了允许保存皮肤并切片，将组织在缓冲的10％福尔马林中固定4小时。将样品转移至具有逐渐浓缩以除去水的乙醇的浴中，然后随后用两个二甲苯浴除去醇，且最后包埋在熔融的石蜡中。然后将包埋的皮肤活检组织用超薄切片机(shandon)切成4μm厚切片，并置于polysine*载片(thermoscientific)上。

方案：将切片脱石蜡并用几个连续的二甲苯、醇和水浴再水化。然后，在每个切片上添加100μl储备溶液，并将载片在60℃下孵育10分钟。在3分钟期间蒸馏水洗涤后，在2分钟期间将活检组织与100μl5％硫代硫酸钠(sigma)一起孵育。将载片在3分钟期间在蒸馏水浴中洗涤，且最终在几个醇和二甲苯浴中脱水。将它们封固于eukitt*(o.kindler)中，并使用具有20x物镜的eclipsee600显微镜(nikon)进行检查。用qimaging*exi蓝色相机拍摄照片，并使用q-capturepro7软件(qimaging*)进行处理。

图像定量：每种条件分析三个图像。imagej软件允许选择感兴趣的区域并生成表示该区域中每个强度的像素数的柱状图。因此，计算所有暗像素(具有0和175之间的强度)的总和，并将获得的总和针对检查的表皮区域的长度进行调整。(mcmullenr.l.等人,2010)

统计学分析：使用jmp*11软件(sas)和student’st检验对具有单尾排斥方向的独立样品进行统计学分析。p≤0.05被视为显著的，p≤0.01被视为非常显著的，且p≤0.005被视为高度显著的。

结果：fontanamasson染色的定量显示于图10中。用imagej分析软件。相比于安慰剂表示统计学分析。(用student’st-检验，平均值±sem；n＝3；ns：不显著；***：高度显著)。对另一名供体证实该实验。

结论：1％和3％的harmoniance显著有助于降低黑色素含量。

j.一般结论

本实施例概述了harmoniance在体外(对培养的成纤维细胞和3t3-l1脂肪细胞)对重构的人表皮和离体(对正常人皮肤)的效力测试。研究了水合作用和屏障功能、皮肤松弛、排水和色素沉着的标记物。

在第一部分中，观察到1％的harmoniance对离体皮肤中的透明质酸、聚丝蛋白和aqp3蛋白的表达的影响。在harmoniance应用48小时后，这些皮肤水合作用标记物的表达增加。

然后，在sds应激后用1％harmoniance处理的重构表皮上评估皮肤屏障功能。用harmoniance处理48小时允许抵消sds应激效应。

接下来，研究harmoniance对胶原蛋白和弹性蛋白(皮肤松弛的标记物)的影响。我们观察到用0.01％harmoniance处理48小时后成纤维细胞中胶原蛋白i表达的增加。此外，在离体皮肤上组合uva和uvb应激后，当皮肤用1％的harmoniance预处理48小时时，显示更好的弹性纤维组织。

在第三部分中，研究harmoniance对甘油释放(排水能力的指标)的影响。为此，在3t3-l1前脂肪细胞上检查甘油释放。在分化细胞上0.01％harmoniance处理48小时后，检测到甘油释放的增强。

在最后部分中，在harmoniance处理48小时后评估皮肤色素沉着。以剂量依赖性方式观察到黑色素含量的降低。

harmoniance靶向与皮肤衰老相关的皮肤外观的最重要属性，包括水合作用和屏障功能、皮肤松弛和皱纹的外观、排水和体型塑造、皮肤色素沉着和色调。

以上实施例是本发明的生物活性制剂的某些实施方案的非限制性实例。给出实施例仅用于说明的目的，而不应解释为对本发明的限制，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行许多变化，本发明的精神和范围将为本领域普通技术人员所认识。在实施例中，除非另有说明，否则所有浓度均以重量百分比列出，并且可以排除少量材料，诸如稀释剂、填料等。因此，所列制剂包含所列组分和与此类组分相关的任何次要材料。如本领域普通技术人员所显而易见，这些次要材料的选择将根据选择用于制备如本文所述的本发明的特定成分的物理和化学特性而变化。

尽管本发明已经通过其具体实施方案进行描述，但本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的真正精神和范围的情况下进行各种改变并且可以替换等效物。此外，可以进行许多修改以采用具体情况、材料、物质的组成、方法、一个或多个方法步骤以达到本发明的客观精神和范围。所有此类修改都意欲在所附权利要求的范围内。

本文参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。本文引用的所有参考文献都在此以其整体通过引用并入。