双膦酸/盐的骨骼去除的制作方法
本发明是在美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的r01de022552、sbir1r43de025524-01和sbir2r44de025524-02的政府支持下完成。政府在本发明中拥有某些权利。
发明背景
1.技术领域
本发明涉及治疗骨坏死和其它骨骼疾患及症状的方法，包括双膦酸/盐相关的颌骨坏死(bronj)。
2.
背景技术：
颌骨坏死(onj)是一种罕见但严重的口腔并发症，其特点在于症状包括几个月至几年都无法消退的疼痛的骨外露或成瘘。最初它被描述为双膦酸/盐相关的onj(bronj)是在用有效抗吸收的双膦酸/盐(bp)药物(特别是含氮的bp(n-bp)诸如唑来膦酸/盐(zoledronate，zol)、帕米膦酸/盐(pamidronate)和阿仑膦酸/盐(alendronate))治疗的患者中确定时，且后来也在一些使用其它抗吸收的或抗血管生成的药物诸如地诺单抗(denosumab)的患者中发现。在一些病例中，需要对坏死的口腔和颌面骨进行切除手术，严重影响了患者的生活质量，然而，目前的预防和治疗方式是有限的。临床报告和患者调查已经表明，牙科手术诸如常规拔牙和义齿佩戴等明显增加了患onj的风险，从而导致近年来牙科医疗保健专业人员和患者之间的不确定性和忧虑。
美国口腔和颌面部外科医师协会(aaoms)最新发布的立场文件将onj重新定义为药物相关的颌骨坏死(mronj)，扩大了其先前立场文件在bronj上的范围。mronj反映出由于给药除了活性bp之外的药物(例如，核因子κb受体活化因子配体(rankl)抑制剂(例如地诺单抗)和抗血管生成疗法可能的相关药剂)而导致的onj或与给药这些药物相关的onj也包括在内。
本领域技术人员认为活性bp和地诺单抗的作用机制是不同的。活性bp的药理机制是基于其与焦磷酸/盐的相似性。由于活性bp对骨中的钙离子有高亲和性，所以活性bp在骨上聚集并靶向破骨细胞。在骨吸收过程中，活性bp被破骨细胞内吞，并抑制甲羟戊酸途径中的重要的酶——法尼基焦磷酸合成酶。因此，降低了破骨细胞的活性，导致骨流失减少。相比之下，地诺单抗抑制rankl——一种与前破骨细胞上的rank受体结合的蛋白质。地诺单抗可以防止rankl与rank受体结合，从而损害破骨细胞的形成。
aaoms已经推荐“休药期”作为用于患者的可能的预防措施，并且在使用地诺单抗治疗的患者中已显示出一些有希望的结果；然而，其对使用活性bp治疗的患者的效果尚未完善，这可能部分是由于它们的作用机制不同以及活性bp在骨中的延长的半衰期而导致的。在给药之后，多达约50％的活性bp被吸收到骨中，且其余的通过肾脏迅速排出体外。活性bp无全身性代谢，导致了它们延长的半衰期，根据所给bp，半衰期可能达数月至10年以上。事实上，美国fda认定，“无法得到足够的数据来指导有关休药期的开始或持续时间的决定”。
由于活性bp已经销售了近15年，因此有众多的患者都接受过活性bp的治疗，且他们的骨骼系统中可能还保留有活性bp。因此，bronj对许多曾经和正在接受活性bp治疗的人仍然构成医疗保健方面的威胁。
因此，需要治疗、预防和/或抑制bronj，以及由使用活性bp治疗引起的或与使用活性bp治疗相关的其它骨和骨骼问题的方法。
技术实现要素：
在一些实施方式中，本发明提供了用于去除或替代骨骼组织(诸如骨组织)中的活性bp的方法，其包括向骨骼组织给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，在受试者骨骼组织(诸如骨组织)中的活性bp被体内去除或替代。在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗、减少、预防或抑制受试者中的bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的方法，其包括向受试者给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，本发明涉及一种或多种非活性bp用于去除或替代骨骼组织(诸如骨组织)中的活性bp的用途。在一些实施方式中，本发明涉及用于治疗bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的药物，其包括治疗有效量的一种或多种非活性bp。
适用于本发明的各种实施方式的非活性bp的实例包括段落[0044]至[0050]中所描述的那些以及其药学上可接受的盐、溶剂化物及其前体药物，且活性bp的实例包括段落[0043]中所描述的那些。在一些实施方式中，被去除或替代的活性bp是活性含氮双膦酸/盐。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐(ibandronate)、米诺膦酸/盐(minodronate)、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐(risedronate)或唑来膦酸/盐。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp是低活性双膦酸/盐。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp缺乏α-羟基基团、有对位取代的吡啶基侧链和/或包括与荧光化合物共价连接的双膦酸/盐。在一些实施方式中，被去除或替代的活性bp是活性含氮双膦酸/盐，且一种或多种非活性bp是低活性双膦酸/盐。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐或唑来膦酸/盐，且一种或多种非活性bp是低活性双膦酸/盐。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐或唑来膦酸/盐，且一种或多种非活性bp缺乏α-羟基基团。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐或唑来膦酸/盐，且一种或多种非活性bp有对位取代的吡啶基侧链。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐或唑来膦酸/盐，且一种或多种非活性bp缺乏α-羟基基团和/或有对位取代的吡啶基侧链。在一些实施方式中，活性含氮双膦酸/盐是阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐或唑来膦酸/盐，且一种或多种非活性bp包括与荧光化合物共价连接的双膦酸/盐。在给药模式为全身给药的实施方式中，一种或多种非活性bp不是依替膦酸/盐(etidronate)。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp具有以下结构：
其中，x是h、羟基、氨基、卤素、烷基或芳基；y是羟基、氨基、烷基、芳基或杂环；以及z是可检测的标记物，诸如荧光团，其可以存在或不存在。在一些实施方式中，x是羟基或h，且y是对位取代的吡啶基基团。在一些实施方式中，存在z。在一些实施方式中，不存在z。
在本发明方法的一些实施方式中，向受试者全身给药一种或多种非活性bp，但条件是一种或多种非活性bp不是依替膦酸/盐。在一些实施方式中，向待去除或替代活性bp的部位局部(locally)给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，向受试者口服给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，向受试者的牙龈组织和/或腭组织给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，在待去除或替代活性bp的部位通过注射给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，在待去除或替代活性bp的部位外用(topically)给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，向受试者进行牙槽手术的部位通过口腔内施用给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，在牙槽手术之前、期间和/或之后给药一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，通过直接注射到位于或靠近牙槽手术部位的粘膜中来给药一种或多种非活性bp。在所给药的一种或多种非活性bp是依替膦酸/盐的实施方式中，给药的模式是局部给药。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp是作为药物组合物来给药的。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp是以药物组合物的形式提供的。在一些实施方式中，药物组合物是如段落[0064]至[0067]中所描述的组合物或制剂。在一些实施方式中，药物组合物是可变形的纳米囊泡制剂。在一些实施方式中，药物组合物是基于磷脂的可变形纳米囊泡制剂。在一些实施方式中，给药有效量的一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，向受试者给药治疗有效量的一种或多种非活性bp。在一些实施方式中，被给药一种或多种非活性bp的受试者曾接受过活性bp的治疗。在一些实施方式中，被给药一种或多种非活性bp的受试者正在接受活性bp的治疗。在一些实施方式中，被给药一种或多种非活性bp的受试者将要接受活性bp的治疗。
以上的一般性描述和下面的详细描述都是示例性的和解释性的，并旨在对所要求保护的发明提供进一步的解释。为了更进一步地理解本发明，还包括了附图，该附图并入此说明书并构成此说明书的一部分，它说明了本发明的几个实施方式并与其描述一起来说明本发明的原理。
附图说明
参考附图进一步理解本发明，其中：
图1，子图a-c，说明了用不同的荧光标记的bp从模拟骨的羟基磷灰石表面替代吸附的荧光标记的bp(fl-bp)。用rox-ris或5-fam-ris(50μm)预处理合成骨/牙本质(磷酸钙，cap)涂覆的培养孔。在分别通过一系列不同稀释剂量的5-fam-ris或rox-ris(从0至50μm)攻击(challenge)之后，测量cap-涂覆的孔的羧基-x-罗丹明(rox)和羧基荧光素(fam)荧光强度。子图a：cap中的rox-ris(每组的第一个柱)仍然在预吸附的50μm水平附近直至用5μm或更高浓度的5-fam-ris攻击。相比之下，5-fam-ris(每组的第二个柱)迅速地被浓度低至1μm的rox-ris替代。子图b：预吸附的fam-ris被10μm至50μm之间的rox-ris替代。子图c：通过标准化荧光生物光子和专用程序(las3000，fujifilm，东京，日本)进行fam和rox荧光信号的定量测量。
图2a、图2b、图2c和图2d示意性地示出了各种fl-bp的合成。
图3是荧光标记的利塞膦酸/盐(ris)吸附在牙本质表面上的图像(上图中圆内的绿点，和下图中半圆下面的绿点和线)。可以看到附着在表面的破骨细胞(上图中的蓝色圆和下图中的半圆)由于形成了局部吸收窝(白色虚线)而摄入了所释放的药物。上部图像：在牙本质表面上方8μm的1μmxy图像；下部图像：同一破骨细胞的zx图像。
图4示出了ris、2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双膦酸(p-pyrebp)和1-羟基-2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双(膦酸)(p-ris)的结构。
图5a和图5b示意性地示出了一些fl-bp的合成。
图6示出了几种fl-bp的结构式。
图7为示出了唑来膦酸/盐(zol)、rox-ris、5-fam-zol和af647-zol的羟基磷灰石(hap)结合亲和性的柱状图。相对保留时间归一化至ris。
图8a至图8d示出了ph为6.8时四种fl-bp结合到羟基磷灰石(hap)的吸附等温线(上图)和相同数据的scatchard图(下图)，数据是平均值±sd(n＝3)。图8a示出了5(6)-rox-ris的吸附等温线，图8b示出了5(6)-rox-rispc的吸附等温线，图8c示出了af647-ris的吸附等温线，以及图8d示出了af647-rispc的吸附等温线。
图9示出了3种不同的fl-bp(rox-ris、af647-zol和5-fam-zol)的发射波长。曲线从左到右为5-fam-zol、rox-ris和af647-zol。5-fam和af647之间的重叠是最小的。
图10是小鼠上颌的代表性图像。将af647-zol经口注射到预注射了5-fam-zol的小鼠上颌中。在注射部位(箭处)及其周围观察到了af647-zol的剂量依赖性吸附。定性地观察到fam-zol信号降低(虚线)。股骨的荧光成像显示，与静脉给药不同，口内注射af647-zol不会导致全身分布至远处骨骼系统。
图11示出了静脉注射5-fam-zol(左子图)或口内注射rox-ris(中子图和右子图)之后小鼠上颌的荧光生物光子图像。
图12a至图12c示出了af647-zol和5-fam-zol的替代和替换。图12a是头盖骨的荧光图像。通过静脉注射使af647-zol(50μm)预吸附在头盖骨上。将5-fam-zol以指示剂量直接注射到骨膜下间隙。图12b为示出了随注射剂量增加5-fam-zol信号增大而af647-zol信号减小的图。每组第一个柱为af647-zol，且每组第二个柱为5-fam-zol。*，p<0.05vs溶媒，通过dunnett’s检验。图12c是头盖骨冷冻切片的图像，其显示了af647-zol的局部替代并被5-fam-zol替换。
图13示出了小鼠股骨骨小梁结构的显微ct评估的结果。在缺乏维生素d的(vitd(-))大鼠(每组n＝3)中检验5-fam-zol的药理学作用。5-fam-zol有效地阻断了导致骨小梁结构增加的分解代谢骨重建。柱为1.0mm。*：p<0.05，通过学生的t-检验
图14示出了小鼠股骨骨小梁结构的显微ct评估的结果。静脉注射zol，而非af647-zol，骨结构参数显著增大。
图15是表明小鼠onj模型是合适的bronj模型的图像。在注射了zol的小鼠中拔牙创口的愈合被延缓(箭头处)。口腔上皮增生(箭处)导致坏死的牙槽骨外露(红色虚线，基本是水平的，在右下子图中)。
图16a至图16c证明了在bronj小鼠模型中对bronj的预防或抑制。图16a示意性地示出了涉及静脉注射zol然后拔牙的小鼠模型研究。在拔牙前1天，通过口内注射或静脉注射施用af647-zol。图16b为小鼠上颌和口腔黏膜炎症和肿胀(白色虚线，左子图和右子图)并在zol处理后的小鼠(bronj对照：n-4)的拔牙部位有不同程度的颌骨外露(箭处)的图。在口内注射af647-zol组(n＝4)(中间子图)中，所有小鼠均表现出极好的拔牙创口愈合而无慢性炎症或肿胀。静脉注射af647-zol组(n＝4)(右子图)显示出减弱的bronj样病变。图16c展示了小鼠股骨的标准荧光生物光子图像，显示出在静脉注射af647-zol之后可以在股骨中清楚地观察到af647-zol信号。相比之下，口内注射不会导致股骨中有可检测的荧光信号。
图17示出了几种亚烷基双膦酸/盐的结构式，包括亚甲基羟基双膦酸/盐(mhdp)、亚乙基羟基双膦酸/盐(ehdp)、亚甲基双膦酸/盐(mbp)、氯膦酸/盐、替鲁膦酸/盐(tiludronate)、2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双膦酸(p-pyrebp)和1-羟基-2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双(膦酸)(p-ris)。
图18a1至图18a4示意性地展示了icg类似物的制备，icg类似物用于合成可用于替代活性bp的近红外fl-bp(icg-bp)。图18a1示出了一般示意性合成路线a，图18a2示出了合成路线b，图18a3为合成路线c，以及图18a4示出了合成路线d。图18b展示了几个这样的icg-bp的结构。
图19a至图19c提供了某些亚烷基双膦酸/盐可用于在小鼠模型中体内替代活性bp的证据。图19a示出了小鼠股骨骨小梁结构的显微ct评估的结果，证明mhdp缺乏抗吸收作用，其仍处于基线水平，如同生理盐水(0.9％nacl)溶媒组。唑来膦酸/盐(zol)表现出显著的抗吸收作用，如骨小梁中骨体积比组织体积(bv/tv)的增加和连接密度(connd)的降低所示。图19b概括了使用mhdp治疗c57bl6小鼠的实验方案。通过向小鼠静脉注射zol产生onj-样病变，然后拔除上颌的第一磨牙。在拔牙前一天，一组老鼠接受口内注射2μgmhdp，且另一组接受静脉注射100μgmhdp。图19c展示了小鼠上颌的图像。左子图显示注射了zol而未进行mhdp治疗的小鼠发生了onj-样病变：口腔黏膜的广泛性炎症和颌骨外露。口内注射(中间子图)和静脉注射(右子图)mhdp预防了onj-样病变的发生。
图20示出了在拔牙部位小鼠上颌的代表性组织结构。注射了zol的小鼠在拔除上颌的磨牙2周之后显示发生onj-样病变，突出表现为暴露的创口(exp)，两侧为口腔上皮增生(箭处)。拔牙窝(黑色虚线)未表现出骨创面愈合，且腭骨表面(红色虚线)没有活性(骨坏死)，其与局部且强烈的炎症反应(箭头处)相连。经一次性口内注射af647-zol或mhdp治疗的zol-小鼠没有发生onj-样病变。拔牙窝(黑色虚线)被再生骨填充，且口腔黏膜炎症被大大减弱。未观察到上颌骨的骨坏死。
图21，子图a和b，示出了在小鼠中通过口内注射非活性bp来预防onj。子图a是实验时间线的图。经静脉注射zol(500μg/kg)处理的小鼠在拔除上颌的第一磨牙的前一天接受口内注射af647-zol、mhdp或eti(依替膦酸/盐)。在拔牙后14天对onj的进展进行评估。子图b示出了疾病对照组小鼠(zol-nacl)在拔牙部位发生onj-样病变，其显示为被口内注射af647-zol、mhdp或eti而预防。
发明的具体实施方式
药物相关的颌骨坏死(mronj)在临床上的特点为口腔中部分坏死的颌骨的未解决的外露或与其连通的瘘，且常常与牙槽手术相关。在抗吸收和抗血管生成药物中，用抗吸收双膦酸/盐进行治疗与所报道的mronj临床病例显著相关。反复给药抗吸收双膦酸/盐会导致骨中积累高水平的抗吸收双膦酸/盐，其通常与颌骨坏死(onj)相关。因此，通常将已经或正在接受活性bp治疗的受试者中的onj称为双膦酸/盐相关的颌骨坏死(bronj)。
如本文所用，“活性双膦酸/盐(活性bp)”是指表现出有效的抗吸收活性并用于抗吸收治疗的双膦酸/盐。如本文所用，“双膦酸/盐”通常是指有两个膦酸基团共价连接到一个碳的化合物。活性双膦酸/盐包括“活性含氮双膦酸/盐(活性n-bp)”，是指具有包含氮的化学结构的双膦酸/盐，其与人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的lys200的羰基和thr201形成氢键。活性n-bp的实例包括阿仑膦酸/盐、伊班膦酸/盐、米诺膦酸/盐、帕米膦酸/盐、利塞膦酸/盐和唑来膦酸/盐。
如本文所用，“非活性双膦酸/盐(非活性bp)”是指与已经和/或正在用于抗吸收治疗的活性bp相比，作为抗吸收剂完全无活性或作为抗吸收剂部分无活性的双膦酸/盐。部分无活性的bp在本文中是指“低活性的双膦酸/盐(低活性bp)”。换句话说，非活性bp包括低活性bp。在一些实施方式中，非活性bp具有的缺乏α-羟基基团的化学结构。在一些实施方式中，非活性bp具有的化学结构具有对位取代的吡啶基侧链。在一些实施方式中，非活性bp缺乏α-羟基基团且具有对位取代的吡啶基侧链。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp具有以下结构：
其中，x是h、羟基、氨基、卤素、烷基或芳基；y是羟基、氨基、烷基、芳基或杂环；以及z是可检测的标记物，诸如荧光团，其可以存在或不存在。在一些实施方式中，x是羟基或h，且y是对位取代的吡啶基基团。在一些实施方式中，存在z。在一些实施方式中，不存在z。
根据本发明，非活性bp对羟基磷灰石(hap)表现出结合亲和性。在一些实施方式中，非活性bp对羟基磷灰石表现出的结合亲和性高于活性bp。在一些实施方式中，非活性bp竞争性地抑制了活性bp与羟基磷灰石的结合。在一些实施方式中，当向其给药非活性bp时，非活性bp会替代与羟基磷灰石结合的活性bp。在一些实施方式中，非活性bp表现出与活性n-bp相同或基本相似的骨亲和性，而表现出很少的至没有抗破骨细胞活性。在一些实施方式中，非活性bp表现出高于活性n-bp的骨亲和性，而表现出很少的或没有活性n-bp的抗破骨细胞活性。
在一些实施方式中，只要非活性bp抑制人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的程度低于被替代或替换的活性n-bp，非活性bp就可以在其化学结构中包含氮。在一些实施方式中，只要氮与人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的lys200的羰基以及与thr201之间形成的任何氢键的强度小于被替代或替换的活性n-bp和fpps的lys200的羰基和thr201之间形成的氢键的强度，非活性bp就可以在其化学结构中包含氮。在一些实施方式中，只要氮不与人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的lys200的羰基和thr201形成氢键，非活性bp就可以在其化学结构中包含氮。本领域中的酶结合活性测定和蛋白质建模方法可以用于筛查不具有与人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的lys200的羰基和thr201形成氢键的氮的双膦酸/盐。参见，例如，ebetino,etal.(2011)bone49(1):20-33；和kavanagh,etal.(2006)pnas,103(20):7829-7834。在一些实施方式中，如根据dunford,etal.(2008)jmedicinalchemistry51(7):2187-2195中的程序所测量的，非活性bp具有的人法尼基焦磷酸合成酶(fpps)的抑制ic50大于4.1nm，优选地为10nm以上，更优选地为100nm以上，甚至更优选地为500nm以上，且最优选地为1000nm以上。在一些实施方式中，如根据sun,etal.(2016)bioconjugatechem27(2):329-340中的程序所测量的，非活性bp在浓度低于100μm时不抑制蛋白质异戊二烯化。在一些实施方式中，非活性bp在浓度低于活性bp的浓度时在骨代谢的体内模型中不抑制骨吸收，诸如在schenk或生长大鼠模型(seitsema,etal.(1989)drugsexptl.clin.res.xv(9):389-396)中。非活性bp的实例包括2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双膦酸(p-pyrebp)、1-羟基-2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双(膦酸)(p-ris)、亚甲基双膦酸/盐(mbp)、亚甲基羟基双膦酸/盐(mhdp)、依替膦酸/盐(ehdp)、氯膦酸/盐、二氯膦酸/盐(isclodronate)、替鲁膦酸/盐、2-羟基-2-膦酰基-3-(吡啶-3-基)丙酸(3-pehpc)和2-羟基-3-(咪唑并[1,2-α]吡啶-3-基)-2-膦酰基丙酸(3-ipehpc)。
在一些实施方式中，非活性bp具有附接在其上的可检测的标记物，诸如荧光化合物。在一些实施方式中，非活性bp包括与荧光化合物(诸如rox、fam、af647、icg、cy5、磺基-cy5、cy7和irdye800cw)共价连接的双膦酸/盐(其可以是活性bp或非活性bp)。缀合有荧光化合物的非活性bp的实例包括图2a至图2d的化合物7a1-7f2，荧光p-pyrebp缀合物诸如图5a的那些，荧光p-ris缀合物诸如图5b的那些，根据图18a1至图18a4合成的igc化合物，以及图18b中所列的igc化合物。在一些实施方式中，缀合有荧光化合物的非活性bp为5-fam-dris、5(6)-fam-dris、5(6)-fam-ris、5(6)-fam-rispc、5(6)-rhr-ris、5(6)-rhr-dris、5(6)-rhr-rispc、5(6)-rox-ris、5(6)-rox-rispc、5-fam-ris、5-fam-zol、6-fam-ris、800cw-zol、af647-ris、af647-rispc、af647-zol、800cw-ris、800cw-zol、800cw-rispc、icg-ris、icg-zol、icg-rispc和icg-p-pyrebp。
非活性bp还包括双膦酸/盐的药学上可接受的溶剂化物、盐和前体药物，其与已经和/或正在用于抗吸收治疗的活性bp相比，作为抗吸收剂完全无活性或作为抗吸收剂部分无活性。“药学上可接受的溶剂化物”是指特定化合物的溶剂化物形式，其保留了给定化合物的生物活性，例如，具备(或缺乏)抗吸收活性。溶剂化物的实例包括与水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺或丙酮结合的本发明的化合物。有机化学领域的技术人员将会理解，许多有机化合物可以与溶剂形成复合物，它们在其中发生反应或从其中沉淀或结晶。这些复合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的复合物被称为“水合物”。许多有机化合物可以以多于一种的结晶形式存在。例如，结晶形式可以因溶剂化物的不同而不同。因此，非活性bp的所有结晶形式及其溶剂化物都在本发明的范围内。
术语“药学上可接受的盐”是指在药理学上可接受的且对正在使用本发明的化合物进行治疗的受试者基本上无毒的盐形式。药学上可接受的盐包括由合适的无毒有机或无机酸或无机碱形成的常规的酸加成盐或碱加成盐。示例性酸加成盐包括源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸)的盐，以及源自有机酸(诸如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、羟乙基磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、苯乙酸、丙酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、谷氨酸、水杨酸、磺胺酸和富马酸)的盐。示例性碱加成盐包括源自氢氧化铵(例如，诸如四甲基氢氧化铵的氢氧化季铵)的盐，源自无机碱(诸如碱金属或碱土金属(例如钠、钾、锂、钙或镁)氢氧化物)的盐，以及源自无毒的有机碱(诸如碱性氨基酸)的盐。
“药学上可接受的前体药物”是可以在生理条件下或通过溶剂分解转化为特定化合物或该化合物的药学上可接受的盐的化合物。“药学活性代谢物”是指通过特定化合物或其盐在体内的代谢而产生的药理学活性产物。化合物的前体药物和活性代谢物可以用本领域已知的技术来确定。参见，例如，bertolini,g.etal.,(1997)j.med.chem.40:2011-2016；shan,d.etal.,j.pharm.sci.,86(7):765-767；bagshawek.,(1995)drugdev.res.34:220-230；bodor,n.,(1984)advancesindrugres.13:224-331；bundgaard,h.,designofprodrugs(elsevierpress,1985)和larsen,i.k.,designandapplicationofprodrugs,drugdesignanddevelopment(krogsgaard-larsenetal.,eds.,harwoodacademicpublishers,1991)。
如本文所公开的，先前吸附在骨骼组织(诸如骨)中的活性bp可以被新给药的非活性bp替代或去除。因此，在一些实施方式中，本发明涉及通过向骨骼组织给药一种或多种非活性bp来去除或替代骨骼组织中的双膦酸/盐的方法。在一些实施方式中，本发明涉及通过向有需要的受试者给药一种或多种非活性bp来治疗、抑制或减少bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的方法。如本文所用，“双膦酸/盐相关的症状”包括由使用活性bp进行治疗引起的或与使用活性bp进行治疗相关的症状，诸如疼痛性骨外露和成瘘、不正常的骨骼断裂等。在已接受活性n-bp治疗的受试者中不正常的骨骼断裂的实例包括非典型股骨断裂和髋骨断裂。参见，例如，paziana,etal.(2011)bone43:103-110。
局部给药非活性bp能够与给药部位处的骨结合，而不会以显著的浓度全身分布。在一些实施方式中，将一种或多种非活性bp局部给药，例如注射到骨组织中的待替代或去除活性bp的部位，在例如外科手术期间暴露的骨组织部位外用给药，或施用(例如注射)在待治疗的骨组织的部位的附近，以减少、抑制或阻止一种或多种非活性bp的全身分布的药物制剂的形式，例如，在药物递送颗粒诸如脂质体或纳米囊泡上或在其中。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp以纳米囊泡的形式递送。在一些实施方式中，纳米囊泡是不可变形的纳米囊泡。在一些实施方式中，纳米囊泡是可变形的纳米囊泡。参见，例如wo2017/087685和subbiah,etal.(2017)jdrugdelivery,articleid4759839。在一些实施方式中，在已经或正在接受活性bp治疗作为对发生bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的预防措施的受试者中，在bronj和/或双膦酸/盐相关的症状很可能发生的部位，向受试者局部给药一种或多种非活性bp。
在一些实施方式中，待治疗的受试者不是休药期的候选者。在一些实施方式中，待治疗的受试者是患有骨质疏松症或与骨有关的癌症或转移(例如，转移到骨的恶性肿瘤或多发性骨髓瘤)并接受活性bp治疗的人。在一些实施方式中，当受试者不是休药期的候选者并且由于正在接受活性n-bp的治疗而有发生bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的风险时，可以在活性n-bp将被去除或替代的部位局部施用一种或多种非活性bp。
在向受试者给药依替膦酸/盐作为非活性bp的实施方式中，将依替膦酸/盐局部给药至待替代或去除活性n-bp的部位。在一些实施方式中，局部给药依替膦酸/盐作为对发生bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的预防措施。
bronj预防/治疗模式：本文所公开的是基于用非活性bp替代活性bp的用于bronj的首个预防和/或治疗程序。如本文所公开，给药一种或多种非活性bp很可能导致基于“竞争平衡”的对活性bp的替代。在bp吸附于骨的背景下，“bp替代”是指用后给药的bp替代先前吸附的bp。bp替代已经在体外(图1)和体内(图10，图12a-图12c)得到证实。如本文所公开，bp替代可以用作对bronj的预防模式。例如，预吸附的活性bp可以通过例如静脉或口服给药来全身给药的，或通过局部给药至给定的治疗部位(例如，直接口内注射到颌骨或外用施用到口腔粘膜)的一种或多种非活性bp有效地替代。
口内方法：向牙槽手术(诸如拔牙)的部位局部给药的一种或多种非活性bp可以替代骨中存在的一种或多种活性bp，并从而治疗或降低发生bronj的风险。重要的是，向牙槽手术(诸如拔牙)的部位口内施用一种或多种非活性bp可以替代存在于该部位的一种或多种活性bp，并从而降低受试者发生bronj的风险，而不会明显干扰受试者内其它组织和/或其它部位中的活性bp的治疗活性。因此，在一些实施方式中，通过向颌骨口内注射一种或多种非活性bp可以有效地替代或去除预吸附的活性bp。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp可以以施用到待治疗部位的溶液、凝胶或膏的形式给药。作为根据本发明的治疗方法的实例，可以通过口内施用至牙槽手术(例如拔牙)的部位来向受试者给药有效量的一种或多种非活性bp，以治疗或抑制bronj和/或双膦酸/盐相关的症状或降低受试者发生bronj和/或双膦酸/盐相关的症状的风险。在一些实施方式中，在牙槽手术之前、期间和/或之后将一种或多种非活性bp施用至受试者的牙龈/腭组织。
荧光标记的双膦酸/盐(fl-bp)：非活性bp可以通过将活性bp(诸如ris或zol及相关的类似物)与可检测的标记物(例如荧光化合物)缀合而产生。合适的荧光化合物的实例包括荧光素及其衍生物(包括羧基荧光素(fam)、羧基-x-罗丹明(rox)、alexafluor647(af647)、罗丹明红-x(rhr-x)、irdye800cw(800cw)、磺基-cy5、吲哚菁绿(indocyaninegreen，icg)及其类似物，包括应用于图18a1至图18a4的合成方法的那些，以及图18b中描绘的那些。合适的fl-bp的实例在图2a-图2d、图5a、图5b、图6、图18a1-图18a4和图18b中公开。fl-bp可用于监测体内双膦酸/盐定位和相互作用，包括通过将吸附在骨矿物表面的合并有双磷酸盐的破骨细胞直接可视化(图3)。fl-bp，其是非活性bp并包括icg-bp，可用于如本文所公开去除或替代骨骼组织中的活性bp。
可以使用具有不同的矿物结合亲和性、抗吸收活性(从无活性至有部分活性)和/或功能的一种或多种非活性bp。例如，可以使用一系列不同的fl-bp来表征吸附在受试者(例如动物模型)中的程度和量，或监测这样的治疗。
诸如ris或zol的现代的bp的特征是，它们的抗吸收作用取决于它们的含氮取代基的结构，与它们强烈的骨亲和性不同，其主要是由于两个膦酸基团。在一些实施方式中，根据本发明的非活性bp具有基于含n双膦酸/盐的骨架，例如利塞膦酸/盐(ris)和唑来膦酸/盐(zol)，表现出与含n双膦酸/盐相同或基本相似的骨亲和性，但表现出很少的至没有抗破骨细胞活性。在一些实施方式中，根据本发明的非活性bp具有缺乏α-羟基基团、有对位取代的吡啶基基团(图4)或两种情况兼具的骨架，其与相应的活性bp相比将显著降低抗吸收活性而不明显影响骨亲和力。在一些实施方式中，根据本发明的非活性bp包括与荧光化合物缀合的活性bp，其中通过与荧光化合物的缀合使得双膦酸/盐作为抗吸收剂失活或活性降低。这些荧光标记的双膦酸/盐(fl-bp)能够强烈地吸附在羟基磷灰石的表面，但基本上或完全缺乏相应的未缀合双膦酸/盐的抗吸收活性。
在一些实施方式中，待治疗的受试者是动物模型。在一些实施方式中，待治疗的受试者是人类。在一些实施方式中，待治疗的受试者有发生bronj的风险。在一些实施方式中，待治疗的受试者已经接受了一种或多种活性bp的治疗。
在一些实施方式中，本发明涉及替代受试者骨中预吸附的活性bp药物，其包括向受试者的骨给药一种或多种非活性bp。
在一些实施方式中，向受试者给药的一种或多种非活性bp的量是治疗有效量或有效量。如本文所用，“有效量”是与无效对照剂相比导致可观察到差异的剂量。在一些实施方式中，一种或多种非活性bp的有效量是当向其给药时可替代组织(诸如骨)中大于50％的活性bp的量。“治疗有效量”是指本发明的一种或多种化合物的量，当以这样的量向受试者给药时，与对照组相比，(i)治疗或抑制特定疾病、病症或疾患，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，和/或(iii)抑制或延缓特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。本发明的一种或多种化合物的治疗有效量将根据以下因素的不同而变化，诸如给定的(一种或多种)化合物、药物制剂、给药途径、疾病或疾患的类型、疾病或疾患的程度和接受治疗的受试者的特性，但可以由本领域技术人员容易地确定。例如，一种或多种非活性bp的“治疗有效量”是与阴性对照相比可以治疗、抑制、预防或减少bronj的体征或症状的量。可以根据动物模型确定治疗有效量。例如，可以根据在动物模型中得到的治疗有效量来配制用于人类的治疗有效量。
在一些实施方式中，将一种或多种非活性bp的治疗有效量作为约5-20、约10-15或约11-12毫克每千克受试者体重的单次剂量在诸如牙槽手术、拔牙、植入手术、牙周炎的建立等事件之前、期间或之后给药。在一些实施方式中，将一种或多种非活性bp在事件期间给药或在事件之后立即给药。熟练的技术人员将明白，某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或疾患的严重程度、以前的治疗、受试者的总体健康情况和/或年龄，以及现有的其它疾病。
在一些实施方式中，本发明涉及包括、基本上组成为或组成为一种或多种非活性bp的组合物。本发明的组合物，包括药物组合物，包括一种或多种非活性bp和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药物组合物”和“药物制剂”可互换地用于指适合在受试者中用于药物用途的组合物。药物组合物通常包括活性剂，例如一种或多种非活性bp，和药学上可接受的载体，例如缓冲剂、佐剂、稀释剂等。
待向受试者给药的一种或多种非活性bp可以作为药物制剂提供。药物制剂可以以适合所需给药模式的单位剂型制备。本发明的药物制剂可以通过任何合适的途径给药，包括口服、直肠、鼻腔、外用(包括颊和舌下)、阴道、粘膜和肠胃外(包括皮下、肌肉、静脉和皮内)。应认识到，给药的途径可能会因接受者的病症和年龄、待治疗的病症的性质以及本发明的给定(一种或多种)化合物而变化。在一些实施方式中，给药途径是口服给药。在一些实施方式中，给药途径是粘膜给药。在一些实施方式中，将一种或多种非活性bp递送至受试者的口腔黏膜。在一些实施方式中，根据本发明的药物制剂是一种或多种非活性bp的水溶液。在一些实施方式中，根据本发明的药物制剂是例如在亲脂性凝胶中的包括一种或多种非活性bp的悬浮液。在一些实施方式中，根据本发明的药物制剂是脂质体或纳米囊泡制剂，包括一种或多种非活性bp封装在脂质体或纳米囊泡中。在一些实施方式中，纳米囊泡是不可变形的纳米囊泡。在一些实施方式中，纳米囊泡是可变形的纳米囊泡。参见，例如wo2017/087685和subbiah,etal.(2017)jdrugdelivery,articleid4759839。在一些实施方式中，根据本发明的药物制剂是包括一种或多种非活性bp的经口腔粘膜的凝胶制剂。在一些实施方式中，根据本发明的药物制剂是包括一种或多种非活性bp的口腔牙齿粘膜粘附非离子表面活性剂囊泡前体(proniosomal)凝胶制剂。
应认识到，药物制剂中使用的非活性bp的实际剂量将根据所使用的(一种或多种)特定化合物、所配制的特定组合物、给药模式和所治疗的特定部位、受试者以及疾病而变化。对于给定的一组条件下的最佳剂量，可以由本领域技术人员基于给定化合物的实验数据使用剂量测定试验来确定。前体药物的给药剂量可以为与全活性形式的重量水平在化学上等同的重量水平。
根据本发明的药物组合物和制剂包括治疗有效量的一种或多种非活性bp和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的溶媒(vehicle)”和“药学上可接受的载体(carrier)”可互换地使用，并且是指并包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸附延缓剂、赋形剂、稀释剂等，其与药品给药模式兼容，并符合适用于药品管理的标准和法规，例如，美国药典-国家处方集(usp-nf)手册中列出的药典标准。因此，例如，未消毒的水被排除在作为药学上可接受的载体之外，至少不能用于静脉给药。药学上可接受的溶媒包括本领域已知的那些。参见，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy.20thed.(2000)lippincottwilliams&wilkins.baltimore,md，其通过引用并入本文。所使用的药学上可接受的载体可以是固体或液体。示例性固体载体为乳糖、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体为糖浆、花生油、橄榄油、药用级水等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域已知的时滞或延时释放材料，诸如单独的或含蜡的单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等。在一些实施方式中，药学上可接受的载体是脂质体。在一些实施方式中，药学上可接受的载体是纳米囊泡，其可以是可变形的或不可变形的。在一些实施方式中，药学上可接受的载体是非离子表面活性剂囊泡前体(proniosome)。
非活性bp的毒性和治疗效能可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，测定ld50(对总体的50％致死的剂量)和ed50(对总体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，且它可以表示为比率ld50/ed50。具有高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用具有毒副作用的化合物，但应谨慎设计将这样的化合物靶向到受影响组织部位的递送系统，以便最小化对未受感染细胞的潜在损害，并从而减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人类使用的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括毒性很小或没有毒性的ed50的循环浓度的范围内。剂量可以根据所使用的剂型和所使用的给药途径而确定的范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，均可以从细胞培养试验初步估计治疗有效的剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到包括如细胞培养中所确定的ic50(即达到对症状的最大半数抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定对人类有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法来测定。
实施例
以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
动物
小鼠颌骨坏死(onj)模型
使用onj的c57bl/6j(b6)小鼠模型。本研究中一致的组织来源是拔牙后的或没有拔牙的小鼠上颌骨，以及股骨、下颌骨和l4/l5腰椎骨。我们和其它实验室已经建立了完善的用于研究小鼠创口愈合的拔牙动物模型。全身性双膦酸/盐治疗通过静脉注射来完成，且所提出的fl-bp的局部施用通过口内注射至小鼠上颌的牙龈/腭组织来完成。对小鼠进行上颌磨牙拔除。在麻醉并检查生命体征之后，将动物放在配有异氟烷管的床上，同时保持嘴张开。施用眼膏(温和的，例如lacrilube)。用0.12％的葡萄糖酸氯己定溶液(peridex，口腔冲洗剂)擦拭上颌磨牙区域。在颈部黏膜的仔细反射之后，使用高压灭菌的牙科探针作为拔牙器，以最小化拔牙后的不适。将高压灭菌的棉棒放在拔牙窝上，直到开始凝血。然后将单侧上颌第1磨牙拔除，使得剩余未处理侧可用于咀嚼。在我们之前的实验中，整个手术需要约5-15分钟。
onj在口腔中发生。牙科手术(通常是拔牙)已经被认为是双膦酸/盐相关的onj发作的诱因。有必要使用动物来进行拟议的研究，因为没有合适的可替代口腔创口愈合模型。如果使用其它模型，将不可能研究创口愈合的生物学和分子机制。不使用动物就不可能将未来的创口愈合治疗外推到人类患者。使用小鼠是因为它们在伤口愈合过程中与人类相似；以及与我们的假设直接相关的转基因菌株的即时可用性。本研究所需动物的数量是基于实现对双膦酸/盐治疗创口愈合的综合研究的考虑进行估计的。
兽医护理通过ucla医疗中心的实验动物医学部(departmentoflaboratoryanimalmedicine)提供。手术之后对动物受试者进行检查；获得对诸如感染的并发症的兽医会诊。不使用表现出呼吸疾病或呼吸窘迫或肠道疾病的体征的动物。ucla是经美国实验动物护理认证委员会(americanassociationofaccreditationoflaboratoryanimalcare，aaalac)完全认可的。
为了防止对任何动物造成任何痛苦、不适或疼痛，手术是在使用异氟烷吸入剂(1-2％)的全身麻醉下进行的。在存活手术之后，将动物放在水循环加热垫上。对动物进行心血管和呼吸功能监测并持续照料直到动物形成胸骨位置。为了防止术后不适向其给药止痛剂。虽然没有考虑对这些突变小鼠的饲养进行特殊治疗，但对任何可能的感染都进行了监测。
在实验结束时将动物安乐死。安乐死是通过100％二氧化碳吸入来完成的。该方法符合美国兽医协会安乐死委员会(panelofeuthanasiaoftheamericanveterinarymedicalassociation)的建议。
实施例1
具有不同矿物结合亲和性的fl-bp的合成与表征
合成了与荧光化合物缀合的双膦酸/盐(fl-bp)，其具有低的或不可检测的生物活性，但具有高的骨矿物亲和力。使用“magiclinker”技术将不同的荧光团与双膦酸/盐缀合(参见，例如us8,431,714)。进行结合亲和性/药理活性的体外表征。
实验1-1：fl-bp的合成
使用“magiclinker”技术(参见，例如us8,431,714)将例如ris、zol和其它相关类似物(例如图4)的bp化合物与如图5a中示意性示出的荧光团缀合来合成fl-bp。缀合物fl-bp以50-77％的产率(>98％的纯度)获得，并通过uv-vis、荧光发射、1hnmr、31pnmr和hrms进行表征。图6示出了所合成的三种fl-bp的结构式。在一些实施方式中，根据本发明使用的bp是us8,431,714中所列出的那些，其全部内容通过引用并入本文。低活性bp的实例是1-羟基-2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双膦酸(p-ris)；另一非活性bp的实例是2-(吡啶-4-基)乙烷-1,1-二基双膦酸(p-pyrebp)。
实验1-2：fl-bp的体外表征
a)矿物结合亲和性测定
羟基磷灰石测定表明，fl-bp通常基本上保留了对骨矿物的亲和性，其反映了bp组分的亲和性和在较小程度上的缀合的荧光团的亲和性。羟基磷灰石(
羟基磷灰石测定证实，fl-bp通常基本上保留了骨矿物亲和力。荧光团组分对亲合性有一定影响：5-fam-zol和af647-zol表现为小幅下降，而rox-ris表现为增强(图7)。因此，当与不同的荧光团缀合时，双膦酸/盐的骨亲和力基本上得到了保留。
使用基于朗缪尔吸附等温线的方法测量代表性荧光bp探针的结合亲和性测量；结果与从羟基磷灰石柱测定(图8a-图8d)得出的结果有良好的一致性。
b)生物活性体外测定
体外活性测定通过使用骨髓巨噬细胞并将它们与m-csf一起在牛骨片上培养2天以富集破骨细胞前体细胞(ocp)，然后用rankl再处理3天以发育并分离多核的破骨细胞来进行。在骨片上预吸附fl-bp，并在其上培养连续稀释的一些ocps。测量吸收窝面积。分别收集破骨细胞及制备总蛋白样本。通过蛋白质印迹检查rap1a的异戊二烯化。在原型实验中，将每个实验组(n＝5)与对照组(n＝5)进行比较。实验1-2-b的效力计算与实验1-2-a相同。
在初步研究中，为了确定荧光zol类似物对细胞活力的影响，将j774.2小鼠巨噬细胞以2×105个细胞/ml铺在96-孔板上并放置过夜以粘附。然后，用10、100或500μm的荧光zol类似物、zol或溶媒处理细胞48小时，在温育期结束时，将培养基移除并用pbs清洗细胞两次。然后加入有阿尔玛蓝(alamarblue)试剂的培养基，并将细胞再温育3小时。蛋白质印迹和细胞活力测定表明fam缀合物有显著的生物效应。这些结果表明，5-荧光素-zol缀合物(和类似的ris缀合物)保留了母体bp药物的可观察到的抗异戊二烯化和抗吸收性性质。
可替代的方法
虽然已经完善建立的大多数体外系统和测定均是用于荧光bp探针的，但也可以使用羟基磷灰石柱测定进行结合亲和力测定。也可以使用牙本质片层代替牛骨片。该方法可以应用于在bp分子结构上用适当修饰生成的其它fl-bp，诸如p-ris，以获得所需的亲和力。
实施例2
口服施用fl-bp用于局部吸附至颌骨以及通过静脉注射竞争性替代预吸附的fl-bp
进行此实验是为了证明体内bp替代。通过使用携带不同荧光团的fl-bp局部施用至上颌的牙龈/腭组织来攻击通过尾静脉注射的全身给药导致的小鼠中预吸附的fl-bp。局部施用可以包括：a)注射至牙龈/腭组织；b)漱口；和c)经粘膜递送的外用施用。可以将fl-bp施用至颌骨的骨膜间隙。通过定量荧光成像分析确立口内注射的剂量和时间点以实现最大的替代效率。还考虑了可能的远距离毒性作用。检查了股骨、下颌骨和l4/l5腰椎骨。
实验2-1
此实验建立了口内注射方案，并确定了注射剂量与上颌骨吸收荧光信号之间的关系。将总共30只雌性b6小鼠分为5组(n＝6)。在每组中，进行了将在25μl的0.9％nacl溶液中的0、1、5、10或50μm的rox-bp单次口内注射至牙龈/腭组织。口内注射一周后，收取颅骨(包含上颌注射部位)、下颌骨、股骨和l4/l5腰椎骨，并去除软组织。通过标准荧光生物光子法对pbs中保存的骨试样进行评估，并使用专用程序(las3000，fujifilm)对信号进行量化。
实验结果
如图9所示，rox和fam具有重叠的发射光谱，导致次优的荧光信号分离(数据未显示)。因此，选择af647-zol作为候选fl-bp来测试fam-zol的替代，反之亦然。使用来自原始bp和替代的标记bp的互补荧光信号允许对原始bp负载和其对替代的bp负载的响应进行监测。
通过使用带33-号针头的hamilton注射器建立小鼠口内注射方案。在手术显微镜下，将2μl溶液注射到小鼠上颌左侧第一磨牙的腭牙龈。缓慢注射之后，将针头留在组织内3分钟，然后再轻轻取出。
使用这种方法，在眼眶后(retro-orbital)静脉注射100μl的50μmfam-zol6天后，向小鼠注射2μl的0μm、0.5μm或5.0μm的af647-zol到小鼠上颌口腔黏膜。在口内注射1天后收取小鼠组织，并对上颌骨进行使用460nm的激发波长和515nm的滤波器(las3000，fujifilmcorp)来获得的标准荧光生物光子成像。
如图10所示，此方法一致且有效地将fl-bp递送到了小鼠上颌口腔黏膜组织。af647-zol口内注射在腭骨上的注射部位处及周围引起了剂量依赖性af647信号增高。此外，有迹象表明预吸附的fam-zol被af647-zol去除。然而，这种替代的定量评估存在一些困难，主要是由于小鼠上颌复杂的解剖结构。
实验2-2
此实验检查了在口内注射部位假设的bp替代。将总共30只雌性小鼠分为5组(n＝6)。所有组接受单次静脉注射200μl的350μmfam-bp。一周之后，每组中的小鼠接受口内注射25μl的0、1、5、10或50μmrox-bp至牙龈/腭组织。口内注射1周之后将小鼠安乐死，并收取颅骨、下颌骨、股骨和l4/l5腰椎骨。对骨试样进行2种颜色荧光生物光子评估，并对每种信号进行量化。
在初步研究中，雌性c57bl6/j(b6)小鼠(8周龄)接受通过尾静脉的单次静脉注射200μl的350μm5-fam-zol(5-fam-zol，#bv111001，biovincllc，culvercity，ca)或单次口内注射25μl的50μmrox-ris(5(6)-rox-ris，#bv150101，biovincllc，ca)至上颌左侧第一磨牙处的牙龈/腭组织(图11中的白色箭处)。一周之后，在静脉注射5-fam-zol3周后或口内注射rox-ris2天后将小鼠安乐死。收取颅骨(包含上颌)并使用460nm激发波长和515nm滤波器(las3000，fujifilmcorp)获得标准荧光生物光子图像。静脉注射fam-zol之后，在整个上颌和颧弓可检测到强且相对均匀的绿色荧光信号。相比之下，rox-ris的口内注射部位周围的腭骨显示出局部红色荧光信号(图11)。
实验结果
通过眼眶后静脉注射100μl的50μmaf647-zol对小鼠进行预治疗。六天后，小鼠接受骨膜下注射10μl的0μm、1μm、10μm或50μmfam-zol至头盖骨。收取头盖骨并去除软组织。通过标准荧光生物光子法测量af647和fam的荧光信号。然后准备头盖骨用于冷冻切片。用胶带法(tapemethod)制作横切片，并用共聚焦激光扫描显微镜进行评估。
在头盖骨上的注射部位，骨膜下注射的fam-zol的fam信号显示出剂量依赖性增加。如图12a所示，在相应部位的af647信号显示为随fam-zol剂量的增加而逐渐减小。如图12b所示，在10μm和50μm中达到统计学意义。
如图12c所示，头盖骨冷冻切片揭示了标记在外和内骨表面以及骨小梁表面的af647-zol。在接受了fam-zol骨膜下注射的头盖骨试样中，主要在外骨表面以及偶尔在骨髓空隙中观察到fam-zol信号。与内骨表面相比，外骨表面上的af647-zol信号不成比例地降低(图12c)。
可替代的方法
如果需要，以上研究的数据可以用于进行效力分析并调整动物的数量。除了所提出的荧光生物光子成像方法之外，还可以使用非脱钙骨冷冻切片，其可以提供骨中所吸附的fl-bp的深度。可替代地，骨块可以在体外制样并脱钙以释放所吸附的fl-bp。释放的fl-bp可以通过2色板读数器或hplc来量化。
实施例3
用于预防bronj的体内bp替代疗法
此研究检验了所提出的bp替代在预防bronj发生中的有效性。将在拔牙之前口内给药非活性和/或低活性的fl-bp应用到已建立的zol诱导的小鼠bronj模型中。所假设的疾病修饰是由bronj以及组织学口腔黏膜异常和骨坏死发生的广泛程度决定的。此研究为所提出的bp替代疗法建立了概念验证。
实验3-1
此研究确定了fl-bp相比于zol的体内抗吸收功能。经尾静脉向雌性b6小鼠注射50μmzol(n＝6)、50μmfl-bp(n＝6)或0.9％nacl溶媒溶液(对照组：n＝6)。三周后，将小鼠安乐死并收取股骨和l4/l5。在固定于10％缓冲福尔马林中之后，对骨样本进行显微ct分析。通过小梁骨三维形态测量(例如bv/tv、tb.n、tb.th、tbsp)定量建立抗吸收功能。由biovinc公司开发的5-fam-zol表现出如图13所示的药理学功能。使用有最小的或没有药理学bp功能的fl-bp。如本文所用，具有有最小的或没有药理学bp功能的化合物意指通过蛋白质抗异戊二烯化试验(参见kashemirov(2008)bioconjugatechem.19(12):2308-2310；sun(2016)bioconjugatechem.27(2):329-340)测量，表现出很少的至没有抗吸收活性的化合物。
实验结果
对小鼠静脉注射0.9％nacl(溶媒溶液)、zol(184μmx100μl＝5.0μg/动物)或af647-zol(184μmx100μl＝22.0μg/动物)，并在注射2周之后收取股骨。对显微ct数据进行比较。
注射zol几乎使股骨小梁骨(bv/tv)的体积以及连接密度增加一倍。相比之下，如图14所示，af647-zol没有改变任何骨结构参数。此研究表明af647-zol不具有zol的抗吸收药理学作用。
实验3-2
经尾静脉对雌性b6小鼠静脉注射200μl的350μmzol。用于小鼠的zol剂量通过用于癌症患者的人体剂量的代谢比例来计算。一周之后，在牙龈/腭组织的上颌第一磨牙区域进行口内注射fl-bp。此实验中使用的fl-bp具有与zol相当的骨亲和力；但具有显著降低的bp功能。口内注射一周之后，拔除上颌左侧第一磨牙。在第2周(每组n＝6)和第4周(每组n＝6)将每组中的小鼠安乐死。收取包括拔牙部位的上颌组织、下颌骨、股骨和l4/l5腰椎骨。将所有骨样本固定在10％缓冲福尔马林中，并通过显微ct进行分析。在用10％edta脱钙之后，使用石蜡切片进行组织病理学检查。有细胞角蛋白14免疫组织学的切片用于检查上皮细胞病理学，以及有trap的用于破骨细胞。
在初步研究中，经尾静脉向雌性b6小鼠注射500μg/kgzol(相当于200μl的350μmzol)，并在一周后，将上颌左侧第一磨牙拔除。注射了溶媒溶液的对照组小鼠的拔牙创口在2至4周内闭合，而注射了100％和50％的zol的小鼠分别在拔牙的第2周和第4周时显示出开放性口腔创口(图15)。
实验结果
从眼眶后静脉丛向小鼠弹丸静脉注射zol(440μg/kg；294μmx100μl＝8.0μg/动物)。如图16a所示，十一(11)天后，小鼠接受af647-zol口内注射(250μmx2μl＝0.59μg/动物)或af647-zol静脉注射(500μmx100μl＝59.2μg/动物)，并然后在af647-zol注射一天之后，对小鼠进行左侧上颌第一磨牙的拔除，且在拔牙之后2周对口腔创口愈合进行评估。在股骨中评定远距离骨中的af647-zol信号。
图16b示出了注射了zol的疾病对照组小鼠显示出有牙龈肿胀和颌骨外露的延迟的创口愈合，与bronj-样病变的发生一致。在拔牙前1天口内注射af647-zol导致在本组所有个体(n＝4)中完全预防了bronj，而没有口腔黏膜炎症/肿胀。相比之下，接受af647-zol静脉注射的一些小鼠尽管颌骨外露明显减弱，但却显示出口腔黏膜炎症/肿胀的体征(图16b)。对股骨的评估显示，在通过静脉注射接受af647-zol的小鼠中有清晰的af647-zol信号，但在通过口内注射接受af647-zol的小鼠中则没有，如图16c所示。结果表明，口内施用和在颌骨局部的bp替代是有利的。
可替代的方法
人类onj病例是当口腔创口8周之后仍不愈合才确诊的。由于小鼠新陈代谢较快且创口愈合快，所以此研究可以观察拔牙创面4周。此时，对照组小鼠的创口已经完全愈合。然而，可能需要对fl-bp治疗干预的作用监测更长的时间段。
用af647-zol进行的实验结果表明1)基于平衡的bp替代在体内发生，并从而支持非活性bp用于预防、抑制和/或治疗bronj的治疗用途，2)荧光化合物，诸如af647，可以与bp缀合，且当与其缀合时，bp的抗吸收活性被减少至最小，而矿物结合效率被保留，以及3)非活性bp的口内施用在预防、抑制或治疗bronj中是有效的。
实施例4
烷基双膦酸/盐
烷基双膦酸/盐，诸如亚甲基羟基双膦酸/盐(mhdp或mhbp)、亚乙基羟基双膦酸/盐(ehdp)、亚甲基双膦酸/盐(mbp)、氯膦酸盐等(图17)，可以替代足够数量的n-bp，以预防、减少或抑制n-bp在颌骨和其它骨骼部位的有害作用。烷基bp可以具有与其缀合的荧光化合物，其中一些在图18中说明。
图19a中所示的结果记录了缺乏抗吸收活性的mhdp，从而表明这样的烷基bp可以用于治疗、抑制、减少或防止由活性bp引起的bronj和其它骨和骨骼问题。蛋白质印迹分析证实了这些结果，并表明是以10μm和100μm剂量的zol抑制了在j774巨噬细胞中的rap1a异戊二烯化(积累的未异戊二烯化的rap1a(urap1a))，而不是mhdp和eti(依替膦酸/盐)。
因此，如图19b中示意性所示，用zol处理小鼠上颌，并然后口内注射2μg的mhdp至待拔除磨牙的部位，或静脉注射100μg的mhdp，并将处理后的小鼠上颌的磨牙拔除部位与对照组进行比较。如图19c所示，与未处理的对照组相比，口内注射和静脉注射mhdp预防了onj-样病变的发生。
实施例5
近红外fl-bp
合成近红外(nir)fl-bp作为新型诊疗剂(图18)：具体地是吲哚菁绿-bp(icg-bp)缀合物：荧光团icg连接到p-pyrebp或p-ris上(图4)。与有效抗吸收的n-bpris或zol不同，p-pyrebp和p-ris的bp骨架缺乏α-羟基基团和/或其吡啶基侧链是对位取代的，其将使抗吸收活性降低至可忽略的水平，而只对骨亲和力有轻微的影响。因此，该设计允许fl-bp缀合物强烈地吸附在羟基磷灰石的表面，而不表现母体n-bp的生物活性。
icg是唯一临床批准用于人体用途的nir荧光染料，在800nm附近吸附并在nir区域(600-1200nm)中发出高荧光强度的荧光，并已广泛用于涉及心脏、肝脏、肺、血液循环和淋巴结的成像研究。成像系统(xiralitex4，miveniongmbh，柏林，德国)最近被批准在美国使用，且手持式仪器(例如，kavodiagnocam)目前正用于使用nir波长光来鉴定牙齿中的龋病，其很容易适用于这里的icg-bp。因此，这种物质的新型组合物允许bp的可视化容易进行，而不会在骨中产生抗吸收作用。
然而，icg不具有任何允许键合的天然功能。因此，将羧基部分引入分子中，使得在三种可替代的位置与bp缀合成为可能。这些骨架被设计成对荧光团核心具有最小的影响，保持icg荧光团的光学性质(图18)。
这些新型icg-bp可以用于允许在接受用于骨质疏松的bp治疗(包括在癌症相关的骨疾病中使用高剂量的n-bp)的任何患者中进行安全的牙科手术。理想地，该产品可以使fl-bp的全身性吸附最小化，同时允许牙医使用廉价的手持光来明显地确定颌骨部位的有效剂量，并然后开始牙科手术。nir荧光缀合物的使用是关键的创新，因为它允许透过覆盖的筋膜和组织实现颌面骨的可视化，以允许监测患者在缀合物摄取上的变化，诸如可能是由于差异化的颌骨转换水平，取决于年龄、性别、种族这样的个体专有特征(个性化并精确用药)。这提高了易用性并增加了成本效益，同时由于能够直接观察到诊疗药剂的负载，所以增加了牙科医生对手术结果的信心。
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