断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒株的有效疫苗接种的制作方法

文档序号：18299735发布日期：2019-07-31 09:55阅读：656来源：国知局

本发明提供保护包括雄性和雌性的所有年龄的猪的对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的疫苗。本发明特别提供仔猪在包括从出生之后即刻(即，仅约1天龄或更小)到三周龄的断奶前的安全且早期的疫苗接种，在所有时间任选地与多价组合猪疫苗如二价prrsv/猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae,m.hyo)疫苗、二价prrsv/2型猪圆环病毒(pcv2)疫苗以及三价prrsv/猪肺炎支原体/pcv2疫苗组合，或简单地单价prrsv疫苗，其中prrs疫苗组分通常对应于其被认为是在包括西欧、地中海地区、斯堪的纳维亚地区，和东欧如俄罗斯、土耳其和乌克兰的欧洲大陆上传播(circulating)的基因型(和所述基因型的亚型)。

本发明广泛涉及新类别的减毒欧洲prrs病毒株，其以修饰的活体形式，即使作为疫苗给予最小的动物也是非常安全且有效的，并且提供非常久的免疫期。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(prrs)的特征在于大母猪和小母猪中的流产、死产以及其他繁殖问题，以及幼猪中的呼吸道疾病。致病物是prrs病毒(prrsv)，动脉炎病毒(arteriviridae)科和巢状病毒(nidovirales)目的一个成员。巢状病毒是具有由单链正极性rna组成的基因组的包膜病毒。正链rna病毒的基因组rna实现了在遗传信息的储存和表达两方面的双重作用。没有dna参与巢状病毒的复制或转录。非结构蛋白从巢状病毒的基因组rna直接转译为大多蛋白并且随后被病毒蛋白酶裂解成朴素的功能蛋白。由所述基因组合成3'-同末端成套次基因组rna(sgrna)并将其用作用于转译结构蛋白的信使rna。因此，巢状病毒基因组rna的复制是基因组复制与sgrna合成的一个组合过程。

在1980年代后期，几乎同时出现了所述病毒的两种不同基因型，一种在北美洲，而另一种在欧洲。prrs病毒现在是几乎所有产猪国家的地方性病毒，并且被认为是影响全球猪肉行业的经济上最重要的疾病之一。另外，已经在中国和周边国家分离出毒性极强的基因型，并且所述基因型通常与北美洲基因型密切相关。

尽管在了解prrsv的生物学方面取得了显著进展，但是所述病毒的控制仍然困难。已经证实本领域中动物的疫苗接种在很大程度上是无效的。prrs通常在经免疫的畜群中重新出现，并且大部分农场上prrsv疫苗接种运动最终未能控制所述疾病。

不受理论限制，使猪感染野生型prrsv或用该病原体的活减毒形式对其进行疫苗接种不幸地仅仅引发非中和抗体的大量产生。在该时间间隔期间，例如，仅产生有限量的干扰素(ifn)-γ分泌细胞。因此，prrsv似乎固有地刺激以一贯丰富的体液(基于抗体)免疫和可变且有限但潜在保护性的t辅助细胞(th)1-样ifn-γ反应区分的不平衡的免疫反应。最可能有助于适应性免疫的不平衡发展的prrsv感染的一个特征是缺乏足够的先天性免疫反应。通常，病毒感染的细胞分泌i型干扰素“ifn”(包括ifn-α和ifn-β)，其保护邻近细胞不被感染。另外，释放的i型ifn与稚t细胞亚组相互作用以促进其转化成病毒特异性ii型ifn(ifn-γ)分泌细胞。相比之下，猪对prrsv暴露的ifn-α反应几乎不存在。病原体对ifn-α产生的如此低效的刺激预计将对宿主的适应性免疫反应的性质具有显著影响，因为ifn-α上调ifn-γ基因表达。因此，前一种细胞因子很可能控制促进适应性免疫(即，t细胞介导的ifn-γ反应和峰值抗病毒免疫防御)的发展的主要路径。

就此而言，显然病毒感染中的先天性免疫与适应性免疫之间的可能联系通过一种特殊类型的树突状细胞发生，这种细胞具有产生大量i型干扰素的能力，并且其在t细胞功能的极化中起关键作用。具体地讲，一种稀少但显著类型的树突状细胞，浆细胞样树突状细胞(pdc)，也称为天然的ifn-α/β产生细胞，借助于其引起稚t细胞分化成ifn-γ分泌细胞的能力而在抗病毒免疫中起关键作用。虽然罕见，但是pdc是ifn-α的强有力的生产者，每个细胞都能够响应病毒产生3-10pg的ifn-α。相比之下，基于每个细胞计，单核细胞产生低5至10倍的ifn-α。已经描述了猪pdc的表型和一些生物性质(summerfield等，2003,immunology110:440)。最新的研究已经确定，prrsv不刺激猪pdc分泌ifn-α(calzada等，2010,veterinaryimmunologyandimmunopathology135:20)。

已经发现这个事实与在疫苗接种时外源添加的ifn-α的观察相组合改善prrsv特异性ifn-γ反应的强度(w.a.meier等，vet.immunol.immunopath.102，第299页至第314页，2004)，突出了ifn-α在猪感染这种病毒期间所起到的关键作用。鉴于ifn-α对保护性免疫的发展的明显关键作用，重要的是确定不同prrs病毒储备液刺激和/或抑制ifn-α产生的能力。因此，存在对用于保护不被prrs影响的新型且改善的修饰的活疫苗的迫切需要。

欧洲prrs通常被命名为“1型”以将其与远亲关系的北美洲或“2型”prrs相区分，并且这两种类型在总核苷酸水平上仅约60％相同。第一种明确定义的欧洲prrsv分离株被wensvoort等公开为莱利斯塔德剂(lelystadagent)(参见institutpasteurisolate1102和美国专利5,620,691和6,197,310以及其国际对应案)。各种亚型的欧洲prrs(所有这些都可以在本发明的所有方面得到保护)在m.p.murtaugh等，virusresearch，第154卷，第18页至第30页，2010；和m.shi等，virusresearch，第154卷，第7页至第17页，2010中进一步阐述。早期北美洲prrs分离株公开于美国专利5,476,778和5,840,563中。

本发明人已经发现，可以提供减毒形式的欧洲prrs病毒株，在给予最小的动物时其也是安全且有效的，并且与许多其他的目前可用的prrs疫苗不同，其没有禁用动物免疫反应机制的许多方面，诸如上述的那些，从而进一步有助于安全性和功效。如本领域熟知的，已证明培养prrs病毒非常困难。历史上，猴肾细胞系ma-104及其衍生物几乎专门用于商业化修饰的活prrsv疫苗的繁殖和减毒，尽管并不知道此类细胞为什么可用于此目的(参见美国专利5,476,778)。

哺乳动物细胞表面蛋白“cd163”被prrs病毒天然地使用以进入哺乳动物细胞的发现(参见，例如美国专利9,102,912)已经被允许开发新的prrsv允许细胞系。令人惊讶的是，这些较新细胞系的减毒产生具有与现有疫苗不同的性质的疫苗病毒(参见，美国专利9,566,324和美国申请公开2013-0309263)。

因此，已经令人惊讶地发现，适于在(1)猪细胞或(2)并入猪cd163受体的非猪细胞(参见，美国专利7,754,464)上培养的欧洲prrs病毒保持比由通过传统方法培养的疫苗病毒所提供的对猪科动物的安全性和功效概况更有意义的安全性和功效概况，并且，另外，即使在早期进行疫苗接种，也可以实现保护性免疫。由此看来prrs常规适应以在猴肾细胞系ma-104(其奇怪地表达可能与血红蛋白清除功能相关的猿cd163，并且其中所述猿cd163与猪cd163仅约85％相同)中培养产生将总是不那么生物学相关且并非最佳的安全性/功效概况。猪cd163的代表性实例描述于美国专利7,754,464及其相关家族成员，美国专利8,058,050；8,486,685；和9,102,912(参见，例如，其中的seqid:no:14和seqidno:2)中。如该专利族中进一步描述，适用于本发明的实践，重组表达细胞不必表达全长cd163，只要cd163多肽具有跨膜结构域以锚定在膜中并表达其表面暴露的结构域即可，因此c末端结构域可能不存在或减少。

另外，预计本发明的疫苗不会下调宿主干扰素反应，而适于在猿细胞(仅提供猿cd163作为受体)中培养的现有技术疫苗如ingelvacmlv(参见，us5,476,778和5,846,805)通常显示对宿主ifn-α反应的强烈抑制作用(一般参见实施例5，以及u.s.9,566,324中的图4)。

prrs病毒通常在最小的动物身上产生最严重的症状，并且能够为仅一天大的仔猪提供安全且有效的疫苗接种，例如，不仅通过降低幼仔的死亡率，而且允许断奶后尽早地在设施之间移动动物而明显有助于业内饲养。

本发明的另一方面提供如下认识：当前的基于欧洲猿细胞的疫苗可以通过重新适应潜在病毒以在适当的猪细胞(参见，例如下面的pk-9细胞的讨论)或表达猪cd163的非猪细胞中生长来改善，其结果是这些疫苗通常更安全，并且可以在更早的年龄安全地引发强烈且持久的免疫反应。因此，与已经在猿细胞中制备的传统疫苗相关的典型安全性和功效要求(即，仅在约3周龄或更晚时间给予此类疫苗)可以通过改善性能来避免，并且早在生命的第1天也实现有效性。因此，鉴于prrsv的多种类型、亚型和病毒株，本发明的方法也可以用于改善许多预先存在的活prrs疫苗的当前相关性和有效性。

对于北美洲/亚洲prrs病毒株(例如，参见wo2013/173443，实施例9和10)，特别参考北美洲prrs病毒的“p129病毒株”(例如，参见其中的seqidno:6，以及pct/ib2011/055003和us6,500,662)的减毒，先前报道在断奶前施用2型(北美洲)prrs疫苗可以是安全且有效的。然而，欧洲和北美洲prrs病毒在核苷酸水平上仅约60％相同，并且在不同类别的动物(年龄、性别等)中关于所观察的病理的类型以稍微不同的方式表现。

在这里，我们描述表达猪cd163的细胞系减毒并选择具有作为疫苗的优异性质的基因型1(欧洲)prrsv病毒株的用途。

技术实现要素：

在第一实施方案中，本发明提供一种包含编码感染性rna分子的dna序列的分离的多核苷酸分子，所述感染性rna分子编码prrs病毒，所述prrs病毒经遗传修饰，使得作为疫苗，其在猪科动物中引发对抗prrs病毒的有效免疫保护性反应。在某些方面，本发明提供一种如本文中所述的dna序列，其包括seqidno.:5。与seqidno:5至少80％相同(且更优选与其具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的编码序列也可用于实践本发明，只要它们提供如下所述的各种关键突变，这些突变将所述分离株与其他或前体病毒株相区分。

本发明的另一个实施方案包括对应于上述dna多核苷酸并且可以由其表达的rna序列，以及可以由此类表达组装的实际病毒。可用于实践本发明的额外减毒欧洲prrs病毒包括由在高度严格条件下与seqidno:5的dna序列的互补序列杂交的dna序列编码的那些，所述条件包括在65℃下在0.5mnahpo4、7％sds、1mmedta中与过滤器结合的dna杂交，并且在68℃下在0.1ssc/0/1％sds中洗涤。

出于本发明的目的，“对应”意指可以使用如在henikoff等，procnatl.acad.sci.,usa,89，第10915页至第10919页，1992中所述的blosum算法最佳地比对的相对序列。

在某些实施方案中，本发明提供一种质粒，所述质粒包含如本文所述的分离的多核苷酸分子和能够在合适的宿主细胞中转录所述多核苷酸分子的启动子。在另一个实施方案中，编码本文质粒的序列的欧洲prrs还编码一种或多种可检测的异源抗原表位。本发明提供一种包含本文所述的质粒的转染的宿主细胞。

另一方面，本发明提供一种用于保护猪科动物免受prrs病毒感染的疫苗。所述疫苗可以包含由感染性rna分子编码的欧洲prrs病毒、所述感染性rna分子，其中每一者都由本文所述的分离的多核苷酸分子编码。在又一方面，所述疫苗包含含有本文的多核苷酸的质粒或病毒载体。本文所述的疫苗可以任选地包含兽用可接受的疫苗载剂。在一个重要方面，与野生型欧洲病毒和其他可用的疫苗相比，所述疫苗具有降低的干扰素-α抑制作用。

在一个实施方案中，本发明提供包含多核苷酸分子的诊断试剂盒，所述多核苷酸分子区分(所谓的diva测试)天然感染有prrs病毒的野外毒株的猪科动物与用本文所述的修饰的活疫苗进行疫苗接种的猪科动物。

在其他实施方案中，本发明提供一种保护猪科动物免受prrs病毒株感染的方法，其包括向所述动物施用免疫原保护量的本文所述的权利要求的疫苗。

本发明还提供了一种能够直接转染合适的宿主细胞并从如此转染的合适宿主细胞中表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs)的质粒，所述质粒包含：(a)编码编码prrs病毒的感染性rna分子的dna序列，和(b)能够转录所述感染性rna分子的启动子。

在进一步优选的实施方案中，所述质粒含有启动子，所述启动子是能够允许在靶向的真核细胞中dna启动的真核启动子，或者是能够引导质粒的体外转录的原核或噬菌体启动子。类似地，本发明提供一种产生prrs病毒的方法，所述方法包括用适当的质粒转染合适的宿主细胞和获得由转染的细胞产生的prrs病毒。

本发明还提供用多核苷酸分子转染的宿主细胞，并提供用于保护猪科动物免受prrs病毒感染的疫苗，所述疫苗包含：(a)由上述多核苷酸分子编码的遗传修饰的欧洲prrs病毒，或(b)所述感染性分子，或(c)呈质粒形式的所述多核苷酸分子，或(d)包含所述多核苷酸分子的病毒载体，其中prrs病毒能够引发针对prrs病毒感染的有效免疫保护性反应，其量有效产生对抗感染的免疫保护，以及适于兽用的载剂。

特别地讲，本发明包括一种用于产生欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒的方法，所述方法包括用选自由以下组成的组的组合物转染合适的真核宿主细胞：

(a)质粒，其包含(1)编码编码欧洲prrs病毒的感染性rna分子的dna序列，其中所述编码dna序列是seqid:5，或与seqidno:5至少85％相同的编码dna序列，和(2)能够驱动在所述合适的宿主细胞中编码所述感染性rna分子的所述dna序列的转录的启动子；和

(b)由质粒的体外转录产生的感染性prrsrna分子，所述质粒包含编码所述编码欧洲prrs病毒的感染性prrsrna分子的dna序列，其中所述编码dna序列是seqid:no:5，或与seqidno:5至少85％相同的编码dna序列，

其中，对于(a)和(b)例，使用与seqidno:5至少85％相同并且与参考序列相比含有一个或多个特定突变的编码序列。

在优选的实施例中，考虑到仔猪可能在从约两周至三周龄的任何时间断奶，可以在不到一天龄，诸如在出生后8至16小时，至两周龄或三周龄，以单剂量向仔猪(雄性或雌性)提供保护性且安全性的疫苗接种。因此，本发明通常适用于单剂量早期疫苗接种，意指在生命的第一天的任何时间(从出生到24小时龄)，类似地在第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第1天至第10天、第1天至第14天和第1天至第21天，或者简单地在大约断奶日之前进行疫苗接种。可以任选地使用两种或更多种剂量。

在此类条件下对抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的早期疫苗接种(通常通过肌内或鼻内途径)也提供保护性免疫的早期起始，诸如约一至八周龄；或疫苗接种后约两周至六周；以及通常在疫苗接种后约28天。

根据本发明的实践的疫苗接种通常提供对仔猪的免疫期，其为约23周至28周，通常至少约26周，这是市场猪的完整预期寿命。因此，可以通过本发明实现的疫苗程序在仔猪最易受感染并且最容易处理时保护仔猪。此类疫苗接种还允许免疫的起始与断奶仔猪从大母猪移出时一致，并且可以被运输到可能存在被prrsv感染的另外风险的其他设施中。本发明的疫苗在保护公猪；以及大母猪和小母猪方面也非常有效，从而间接保护未出生的后代。尽管优选预期肌内和鼻内疫苗接种，但其他途径也是适用的。

在本发明的另一个实施例中，虽然不太优选，但是由培养欧洲prrs病毒的重组细胞表达的cd163多肽(并且因此预先适应以猪科动物中的感染和生长)不是猪cd163，而相反是哺乳动物cd163，哺乳动物cd163具有与猪序列相对接近的氨基酸序列，诸如与u.s.7,754,464的seqidnos2或14至少90％相同。更优选地，该氨基酸同一性，92％、95％、96％、97％、98％或99％。

本发明还提供包含多核苷酸分子的诊断试剂盒，所述多核苷酸分子区分天然感染有prrs病毒的野外毒株的猪科动物与用本发明的疫苗进行疫苗接种的猪科动物，所述疫苗(病毒)优选证明与野生型相比降低的干扰素-α抑制作用。

本发明还提供衍生自欧洲(比利时)prrsv分离株96v198的prrsv的代表性全基因组序列。分离株96v198本身是由比利时根特大学的hansnauwynck教授于1996年从具有呼吸征象的幼猪的肺中获得的(因此从感染的猪的血清中回收第0代(seqidno:1)。

第1代(seqidno:2)是在原代猪肺泡巨噬细胞(pam)上单次传代的结果。所有后续传代均在bhk21-c12-26细胞系上执行。第9代(seqidno:3)就在通过三轮有限稀释进行病毒的生物克隆之前。第14代(seqidno:4)是克隆1(检查并评价的6个克隆)。克隆1在第44代继续成为主种子病毒，并且msv+5次传代成为第49代的prrsmlv产物(seqidno:5)。所有基因组均为15,092nt长。所有基因组彼此至少99.5％相同，并且与莱利斯塔德病毒约92％相同。

附图说明

图1提供prrsmlv产物的第49代分离株的全长核苷酸序列(15,092个碱基)，seqidno:5。

序列表的简述

seqidno:1提供prrsv分离株96v198的第0代。

seqidno:2提供prrsv分离株96v198的第1代。

seqidno:3提供prrsv分离株96v198的第9代。

seqidno:4提供prrsv分离株96v198的第14代。

seqidno:5提供prrsv分离株96v198的第49代。

seqidno:6-8提供pcr引物序列。

具体实施方式

除非上下文另外明确规定，否则在本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，举例来说，提到“所述方法”包括一种或多种方法，和/或本领域的普通技术人员在阅读本发明时将显而易见的本文中所述类型的步骤等。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文中所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。

除非具体地指出相反情况，否则本发明的实践将采用本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组dna技术的常规方法，其中的许多在下文中出于说明的目的而描述。此类技术在文献中充分地说明。参见，例如sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，1989)；maniatis等，molecularcloning:alaboratorymanual(1982)；dnacloning:apracticalapproach,第i卷和第ii卷(d.glover编)；oligonucleotidesynthesis(n.gait编，1984)；nucleicacidhybridization(b.hames和s.higgins编，1985)；transcriptionandtranslation(b.hames和s.higgins编，1984)；animalcellculture(r.freshney编，1986)；perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)。

“北美洲prrs病毒”意指具有与北美洲prrs病毒分离株相关的遗传特性的任何prrs病毒，诸如但不限于最初在美国在约1990年代初期分离的prrs病毒(参见，例如collins,j.e.等，1992,j.vet.diagn.invest.4:117-126)；北美洲prrs病毒分离株mn-1b(kwang,j.等，1994,j.vet.diagn.invest.6:293-296)；prrs的quebeclaf-exp91病毒株(mardassi,h.等，1995,arch.virol.140:1405-1418)；和北美洲prrs病毒分离株vr2385(meng,x.-j等，1994,j.gen.virol.75:1795-1801)。遗传特性是指由北美洲prrs病毒株所共享的基因组核苷酸序列类似性和氨基酸序列类似性。亚洲prrs病毒株通常证明与北美洲病毒株具有约80-95％的核苷酸序列同一性(参见lasergene软件套件中的clustalw算法的默认值，dnastar,inc.)，并且北美洲病毒株类似地彼此约85％至100％相同。

“欧洲prrs病毒”(prrsv-1，或原来1型prrsv)是指具有与最初在欧洲在约1991年分离的prrs病毒相关的遗传特性的prrs病毒的任何病毒株(参见，例如wensvoort,g.等，1991,vet.q.13:121-130，莱利斯塔德病毒，还参见美国专利5,620,691和6,197,310)。欧洲prrs病毒通常也指具有与莱利斯塔德分离株约80％或更高百分比相同的全长核苷酸序列的病毒。值得注意的是，在prrsv-1内，已经鉴定了亚型，因此莱利斯塔德病毒已被命名为亚型1的原型，并且莉娜病毒(lenavirus)(u.karniychuk等，bmcveterinaryresearch,2010，第6卷，第30期)已被命名为亚型3的原型。这两种病毒大约跨越prrsv-1的最大当前散度，并且因此，例如，使用orf5、莱利斯塔德和莉娜在核苷酸水平上约82.8％相同，并且使用全基因组、莱利斯塔德和莉娜在核苷酸水平约80.7％相同。基于算法参数，比对的优化略有不同，但读者通常参考lasergene软件套件(dnastar，inc.)中的clustalw算法的默认值。

欧洲prrs病毒株与北美洲和亚洲(中国)病毒株通常仅约60％相同。例如，使用orf5核苷酸序列(当整个基因组未知时，其倾向于给出整个基因组的合理估计)，prrsv-1原型莱利斯塔德病毒和北美洲原型vr2332病毒株在核苷酸水平下约65.0％相同。使用全基因组核苷酸序列，再次使用引用的clustalw算法的默认值，原型莱利斯塔德病毒和原型vr2332病毒在核苷酸水平上约58.6％相同。

出于本发明的目的，“有效免疫保护性反应”、“免疫保护”等术语意指在接种疫苗的动物中针对病原体的一个或多个抗原表位从而保护其不被所述病原体感染的免疫反应。出于本发明的目的，保护不被病原体感染不仅包括感染的绝对预防，而且包括与未接种疫苗的感染动物相比，在接种疫苗的动物中，被病原体感染的程度或比率的任何可检测的降低，或由被病原体感染产生的疾病或任何症状或病状的严重程度的任何可检测的降低。可以在先前尚未感染病原体和/或在疫苗接种时未感染病原体的动物中诱导有效的免疫保护性反应。还可以在疫苗接种时已经感染了病原体的动物中诱导有效免疫保护性反应。

如果遗传修饰的prrs病毒的毒性低于其未修饰的亲本病毒株，则其是“减毒的”。如果病毒株显示出决定疾病严重程度的一个或多个参数的统计显著减少，则其“毒性较低”。此类参数可以包括病毒血症的程度、发烧、呼吸窘迫的严重程度、繁殖症状的严重程度或肺病变的数量或严重程度等。

“能够支持prrs病毒复制的宿主细胞”意指能够在感染了本发明的病毒时产生感染性prrs的细胞。此类细胞包括单核细胞/巨噬细胞系的猪细胞，诸如猪肺泡巨噬细胞和衍生物；ma-104猴肾细胞和衍生物，诸如marc-145细胞；以及用编码prrs病毒受体的基因转染的细胞(参见，美国专利9,102,912，其提到将哺乳动物cd163表面蛋白指定为正常prrs病毒细胞受体)。术语“能够支持prrs病毒复制的宿主细胞”还可以包括在活猪内的细胞。

如本文所用的“开放阅读框”或“orf”意指编码特定prrs病毒蛋白所需的不含中间终止密码子的最小核苷酸序列。

“猪(porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换使用并且是指作为猪科的成员的任何动物，诸如猪(pig)。本发明的疫苗和方法协议适用于所有猪，无论是任何年龄的雄性，还是任何年龄的雌性，包括大母猪和小母猪，并且此类方法还能够通过对大母猪施用保护间接地保护雄性和雌性仔猪。除非另外指出，否则如本文所用的术语“prrs病毒”意指北美洲、亚洲或欧洲prrs病毒的任何病毒株。

“prrs”涵盖猪中由prrs病毒(prrsv)感染所引起的疾病症状。此类症状的实例包括但不限于发烧、妊娠母畜的流产、呼吸窘迫、肺病变、食欲不振以及幼猪的死亡率。如本文所用的“不能产生prrs”的prrs病毒是指可以感染猪，但是在猪中不产生通常与prrs感染相关的任何疾病症状的病毒。

“转染的宿主细胞”实际上意指任何宿主细胞，当用prrs病毒rna转染时，其可以产生至少第一轮prrs病毒粒子。

出于本发明的目的，“感染性dna分子”是编码用于支持从合适的宿主细胞复制、转录以及转译成功能性病毒粒子所需要素的dna分子。

同样地，“分离的多核苷酸分子”是指包含从其天然存在状态(如果存在的话)纯化或控制到任何可检测程度的本发明的多核苷酸分子的物质组合物。

出于本发明的目的，第二多核苷酸分子(rna或dna)的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列是“同源的”，或与所述第一多核苷酸分子具有“同一性”，其中如基于遗传密码的简并，或当第二多核苷酸分子的核苷酸序列编码足够类似于由第一多核苷酸分子的核苷酸序列编码的聚氨基酸的聚氨基酸以便可用于实践本发明时，其编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列相同的聚氨基酸。同源多核苷酸序列也是指有义链和反义链，并且在所有情况下是指任何此类链的互补序列。出于本发明的目的，多核苷酸分子可用于实践本发明，并且因此是同源的或具有同一性，其中它可以用作用于例如通过标准杂交或扩增技术检测被感染的猪的体液或组织样品中prrs病毒或病毒多核苷酸的存在的诊断探针。一般来讲，如基于blastn算法(美国国立卫生研究院(unitedstatesnationalinstituteofhealth)的美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)，另被称为ncbi，(bethesda,maryland,usa)，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列具有至少约70％核苷酸序列同一性，则其与第一多核苷酸分子的核苷酸序列同源。在用于根据本发明实践计算的一个具体实例中，提到了blastp2.2.6[tatusovata和tlmadden,“blast2序列-一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具。”(1999)femsmicrobiollett.174:247-250.]。简而言之，使用空位开放罚分10、空位延伸罚分0.1以及henikoff和henikoff的“blosum62”评分矩阵(proc.nat.acad.sci.usa89:10915-10919.1992)比对两个氨基酸序列以优化比对分数。然后如下计算同一性百分比：一致匹配的总数×100/较长序列的长度+为了比对两个序列而引入较长序列中的空位的数量。

优选地，同源核苷酸序列具有至少约75％核苷酸序列同一性，甚至更优选地至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性。由于遗传密码是简并的，所以同源核苷酸序列可以包括任何数量的“沉默”碱基改变，即仍然编码相同氨基酸的核苷酸取代。

同源核苷酸序列还可以含有非沉默突变，即在编码的聚氨基酸中产生氨基酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要所述序列保持与由第一核苷酸序列编码的聚氨基酸至少约70％相同或以其他方式适用于实践本发明即可。

就此而言，可以进行通常认为不使整体蛋白质功能失活的某些保守氨基酸取代：诸如关于带正电荷的氨基酸(且反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；关于带负电荷的氨基酸(且反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；以及关于某些不带电氨基酸的群组(并且在所有情况下，也反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。可以根据物理性质和对二级与三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。保守取代在本领域中被认为是一种氨基酸被具有类似性质的另一种氨基酸取代。例示性保守取代可见于1997年3月13日公开的wo97/09433，第10页(pct/gb96/02197，1996年9月6日提交中。可替代地，保守氨基酸可以如lehninger，(biochemistry，第二版；worthpublishers,inc.ny:ny(1975)，第71页至第77页)中所述进行分组。额外合适的保守改变及其应用如下所述。

可以通过比较核苷酸序列，例如通过使用上面的blastn来确定同源核苷酸序列。可替代地，可以通过在选定条件下杂交来确定同源核苷酸序列。举例来说，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与seqidno:5的互补序列在适当严格的条件下杂交，例如在65℃下在0.5mnahpo4、7％十二烷基硫酸钠(sds)、1mmedta中与过滤器结合的dna杂交，并且在42℃下在0.2×ssc/0.1％sds中洗涤(参见ausubel等编，protocolsinmolecularbiology,wileyandsons，1994，第6.0.3页至第6.4.10页)，或将以其他方式引起如下文所定义的编码prrs病毒的序列的杂交的条件，则其与seqidno:5(或任何其他特定多核苷酸序列)同源。可以凭经验确定或基于探针的鸟苷/胞嘧啶(gc)碱基配对的长度和百分比准确计算杂交条件的修改。可以如sambrook等(编)，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress:coldspringharbor,newyork(1989)，第9.47页至第9.51页中所述来计算杂交条件。

在另一个实施方案中，如果第二核苷酸序列与seqidno:5的互补序列在非常严格的条件下杂交，例如在65℃下在0.5mnahpo4、7％sds、1mmedta中与过滤器结合的dna杂交，并且在68℃下在0.1×ssc/0.1％sds中洗涤，如本领域中已知(ausebel等，currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyinterscience,newyork,1989，则其与seqidno:5(或本发明的任何其他序列)同源。

此外应了解，本发明的分离的多核苷酸分子和分离的rna分子包括合成分子和通过重组技术，诸如通过体外克隆和转录获得的分子两者。

多核苷酸分子可以使用本领域普通技术人员已知的重组技术进行基因突变，包括通过定点诱变，或通过随机诱变，诸如通过暴露于化学诱变剂或辐射，如本领域中已知。”突变可以通过本领域中已知的标准方法，例如如(例如meulenberg等，adv.exp.med.biol.,1998,440:199-206)所述的感染性拷贝的定点诱变(参见，例如sambrook等，(1989)molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)进行。

与提供施用到断奶前仔猪时安全且有效的优选欧洲prrs病毒序列相关，以下是可以修饰的氨基酸位置。在鉴定这些特定突变时，当然要注意的是，也可以使用如上文刚定义的这些优选氨基酸残基的保守取代。在鉴定优选的编码的氨基酸时，病毒株96v198的野生分离株的对应/原始氨基酸也通过括号显示，因此将第0代(seqidno:1)与第49代(优选的疫苗材料，seqidno:5)进行比较。因此，对于由orf1a编码的氨基酸序列，s位于氨基酸位置19(n)；y位于氨基酸位置24(f)；a位于氨基酸位置156(t)；y位于氨基酸位置157(h)；d位于氨基酸位置268(n)；h位于氨基酸位置294(y)；y位于氨基酸位置416(c)；s位于氨基酸位置742(p)；l位于氨基酸位置884(f)；p位于氨基酸位置908(s)；k位于氨基酸位置916(e)；k位于氨基酸位置977(e)；s位于氨基酸位置1138(p)；f位于氨基酸位置1160(l)；s位于氨基酸位置1500(p)；r位于氨基酸位置2094(q)；p位于氨基酸位置2254(s)；并且l位于氨基酸位置2290(f)。对于由orf1b编码的氨基酸序列，s位于氨基酸位置567(n)；且h位于氨基酸位置912(q)。对于由orf2a编码的氨基酸序列，l位于氨基酸位置22(s)；f位于氨基酸位置88(v)；m位于氨基酸位置94(i)；且f位于氨基酸位置95(l)。对于由orf2b编码的氨基酸序列，l位于氨基酸位置47(f)。对于由orf3编码的氨基酸序列，s位于氨基酸位置52(t)。对于由orf4编码的氨基酸序列，t位于氨基酸位置151(i)。对于由orf5编码的氨基酸序列，f位于氨基酸位置20(l)；且d位于氨基酸位置37(n)。对于由orf5a编码的氨基酸序列，v位于氨基酸位置18(a)；且r位于氨基酸位置35(q)。

因此，本发明还提供一种用于制备遗传修饰的欧洲prrs病毒的方法，所述方法包括突变编码如上所述编码prrs病毒的感染性rna分子的dna序列，和使用合适的表达系统来表达所述遗传修饰的prrs病毒。可以使用本领域通常已知的合适表达系统由分离的多核苷酸分子表达遗传修饰的prrs病毒，其实例描述于本申请中。例如，分离的多核苷酸分子可以是能够在体外在合适的宿主细胞中表达编码的病毒的质粒形式，如下面进一步详细描述的。

北美洲prrsvn蛋白序列是高度保守的并且所报告的序列彼此具有约93-100％同一性。北美洲prrsvn蛋白和欧洲prrsvn蛋白是约57-59％相同的并且共享共同的结构基元。通常，当比较prrs编码序列和分离株(其可以与特定核苷酸或编码的氨基酸以不同方式编号)时，易于通过鉴定相关prrs病毒株中所保存的特征氨基酸并且将其与参考病毒株进行比对来实现恰当区域的鉴定。

重组dna技术包括旨在以dna水平修饰核酸的极其多变且强大的分子生物学技术，并且使得可以在分子水平下分析并修饰基因组。在这方面，诸如prrs病毒的病毒由于其基因组的适度大小而特别能够经受此类操作。然而，重组dna技术并不可立即应用于非反转录病毒rna病毒，因为这些病毒在其复制过程中不涵盖dna中间步骤。关于此类病毒，必须在重组dna技术可以应用于其基因组以产生修饰的病毒之前发展感染性cdna克隆。感染性克隆可以通过构造在研究中的病毒的全长(基因组长度)cdna(这里是在rna的dna拷贝的广泛意义上并且不仅在mrna的dna拷贝的严格意义上使用)得到，之后在用全长cdna转染的细胞中体内合成感染性转录物，但是感染性转录物还可以通过在具有原核启动子的质粒中在存在转录混合液的情况下从全长cdna体外转录获得，或同样使用包含全病毒基因组的接合的部分长度cdna片段体外获得。在所有情况下，转录的rna携带已被引入cdna中的所有修饰并且可以用以使如此修饰的病毒进一步传代。

欧洲prrs病毒分离株或莱利斯塔德病毒的感染性克隆的制备描述在美国专利号6,268,199中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。命名为p129(lee等，2005；yoo等，2004)的北美洲prrs病毒分离株的感染性cdna克隆的制备描述在美国专利号6,500,662中，所述专利以引用的方式完全并入本文中。p129cdna的序列公开在基因库寄存编号af494042中和美国专利号6,500,662中。我们以下的工作利用此类感染性克隆，其在质粒的情况下通过cmv即刻早期启动子表达并且已被命名为pcmv-s-p129并且也公开在美国专利号6,500,662内。如美国专利号6,500,662中所述，存在适用于此的其他质粒和启动子。

鉴于任何相关开放阅读框的完全序列和相关氨基酸残基的位置，普通技术人员仅仅需要查询密码子表来设计在所需特定位置的改变。

密码子构成mrna及其对应cdna分子中核苷酸的三重序列。密码子在存在于mrna分子中时以碱基尿嘧啶(u)为特征，但是在存在于dna中时以碱基胸苷(t)为特征。多核苷酸内相同氨基酸残基的密码子的简单改变将不改变所编码的多肽的序列或结构。显然当短语陈述特定3核苷酸序列“编码”任何特定氨基酸时，普通熟练的技术人员将认识到上表提供所讨论中的鉴定特定核苷酸的手段。举例来说，如果特定三核苷酸序列编码赖氨酸，则上表公开两种可能的三重序列是aaa和aag。甘氨酸由gga、ggc、ggt(如果在rna中，则ggu)以及ggg编码。为了将所编码蛋白质中的赖氨酸残基变成甘氨酸残基，可以用gga和ggc、ggt或ggg中的任一者置换编码核酸中的aaa或aag三联体。

对prrs病毒免疫生物学的研究表明，prrs病毒与pdc的相互作用值得进行检查。该细胞类型代表人、小鼠、大鼠、猪和猴中0.2％至0.8％的外周血单核细胞。尽管其很稀缺，但这种细胞是先天免疫系统的重要组分，并且能够在病毒刺激后分泌大量的ifn-α。通过ifn-α的分泌，pdc在调节抗病毒先天性和适应性免疫中起主要作用，因为它们促进天然杀伤细胞、b细胞和t细胞的功能。此外，猪单核细胞衍生的树突细胞(modc)的成熟受到pdc分泌的ifn-α的辅助，导致modc提供抗原和活化t细胞的能力增强。在病毒感染的后期，pdc分化成独特类型的成熟树突状细胞，其直接调节t细胞的功能并引导t细胞分化成能够分泌ifn-γ的细胞，ifn-γ是对抗包括prrs病毒的病毒的抗病毒免疫的主要介体。毫不奇怪，存在人类病毒，诸如呼吸道合胞病毒和麻疹病毒，已知它们抑制pdc分泌ifn-γ的能力。这种抑制作用被认为在体液免疫反应的优势和由于这些病毒感染而观察到的相关免疫病理学以及宿主对继发细菌和病毒感染的易感性增加中起作用。

如前所述，存在许多已知的欧洲、北美洲和中国prrs病毒株和分离株，并且新的病毒株继续进化或将被分离。尽管在所有这些病毒株之间存在高水平的氨基酸序列同源性，但是本领域技术人员将立即认识到确实存在一些变化形式，并且实际上可以利用这些差异和相似性来进一步改善所有疫苗病毒株的表型性质。

首先，关于如下指明的由seqidno定义的所有氨基酸基序，通常可以检查来自任何其他欧洲prrs的对应表达的蛋白质序列，以找到对应的氨基酸基序，即使额外的变化由于进化而在此类其他病毒株中发生，导致取代和/或缺失或添加。因此，如果例如其中的缬氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或任何其他残基置换，或者如果残基简单地缺失或添加额外的残基，则应该可以容易地鉴定另一种prrs病毒株中的可相比较的基序。存在用于鉴定比对并且由此确定多肽序列基元是否对应于例如所谓的blosum表(基于指定的百分比同一性水平)的许多计算机程序，参见s.henikoff等，“aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks”,procnatlacadsci,usa,89(22)，第10915页至第10919页，1992年11月15日，并且还参见a.l.lehninger等，principlesofbiochemistry,2005,macmillanandcompany，第4版。保守氨基酸改变也基于分成以下总共5组来识别：巯基(cys)；芳族(phe、tyr和trp)；碱性(lys、arg、his)；脂族(val、ileu、leu、met)以及亲水性(ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser和thr)。因此，在适当且对应的位置并入关于由seqidno:5提供的氨基酸改变中的任一者来修饰任何欧洲prrs编码核苷酸序列在本发明的实践内，即使与所指定位置相邻的其他氨基酸中的一者或多者已经被添加、缺失或取代。当然，此类氨基酸变化可以通过定点诱变、pcr和本领域熟知的其他技术引入病毒的对应编码核苷酸序列中。

减毒的一般测量

为了证明特定遗传修饰的病毒株被减毒，可以使用如下所述的实验。

在每一个试验中每组包括至少10头小母猪，它们来源于无prrsv的农场。动物经测试没有prrs病毒特异性血清抗体并且是prrsv阴性的。试验中所包括的所有动物具有相同的来源和品种。将动物随机分成数组。

在妊娠第90天以每鼻孔10⁵tcid50鼻内施加1mlprrsv执行攻击。每一种测试设置存在至少三组：一组关于野生型病毒；一个测试组用可能减毒的病毒攻击；以及一个严格的对照组。

当严格对照组在研究的时间过程内保持prrsv阴性并且与严格对照组相比，野生型攻击组中生出少至少25％的健康活仔猪时，认为所述研究是有效的。

减毒(换句话说，毒性更小)定义为决定繁殖性能或其他症候学的一个或多个参数的统计显著改变：

与未修饰的亲本病毒株感染组相比，测试组的以下参数中的至少一者的显著降低(可能减毒的病毒)将是一种减毒指示：

a)死产频率

b)在妊娠第112天或在这之前流产

c)木乃伊化仔猪的数量

d)较不活跃并且虚弱的仔猪的数量

e)断奶前死亡率。

此外，与未修饰的亲本病毒株感染组相比，测试组的以下参数之一显著增加是优选的：

f)每头大母猪的断奶仔猪的数量

g)每头大母猪生出的健康活仔猪的数量。

在替代例中，可以检查prrsv感染的呼吸道症状和其他症状以确立减毒。

减毒的病毒株对于配制疫苗来说是有价值的。如果本发明的疫苗保护猪不被prrs病毒感染，则其是有效的。如果在向一头或多头未感染的猪施用疫苗之后，用生物学纯的病毒分离株(例如，任何欧洲野生型)的随后攻击引起疾病的任何总体或组织病理学改变(例如，肺病变)和/或症状的严重程度与未保护的类似猪(即，相对于适当的对照)中通常由分离株引起的那些改变或症状相比有所减弱，则所述疫苗保护猪不被prrs病毒感染。更具体地讲，通过向一头或多头有需要的合适猪施用疫苗，然后在适当的时长(例如，4周)之后，用生物学纯的prrsv分离株的大样品(10^(3-7)tcid(50))攻击，可以显示出本发明疫苗是有效的。然后在约一周之后从被攻击的猪抽取血液样品，并且然后尝试从所述血液样品中分离出病毒。大量病毒的分离指示所述疫苗可能不是有效的，而降低量的病毒(或无病毒)的分离指示所述疫苗可以是有效的。

因此，可以在数量上(即，实变肺组织的百分比与适当的对照组相比减小)或质量上(例如，从血液中分离prrsv，通过免疫测定检测肺、扁桃体或淋巴结组织样品中的prrsv抗原)评价本发明疫苗的有效性。可以在数量上(例如，温度/热度)或半数量上(例如，一种或多种症状的存在或不存在或一种或多种症状的严重程度的降低，所述症状诸如为发绀、肺炎、肺病变等)评价猪繁殖与呼吸疾病的症状。

未感染的猪是尚未暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂，或已经暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂但是未显示出所述疾病的症状的猪。被感染的猪是显示出prrs的症状或可以从中分离出prrsv的猪。

本发明的疫苗可以遵循公认惯例来配制，以包含用于包括人类(如果适用的话)的动物的可接受载剂，诸如标准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂；并且也可以经配制以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其他合适的疫苗媒剂和添加剂，包括尤其适用于配制修饰的活疫苗的那些，为本领域的普通技术人员所知或将是显而易见的。参见，例如remington'spharmaceuticalscience，第18版，1990,mackpublishing，其以引用的方式并入本文中。

本发明的疫苗还可以包含一种或多种额外的免疫调节组分，尤其诸如佐剂或细胞因子。可以用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括ribi佐剂系统(ribiinc.,hamilton,mont.)、明矾、矿物凝胶如氢氧化铝凝胶、水包油型乳液、油包水型乳液如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(cytrx,atlanta,ga.)、qs-21(cambridgebiotechinc.,cambridgemass.)、saf-m(chiron,emeryvillecalif.)、amphigen.rtm.佐剂、皂苷、quila或其他皂苷部分、单磷酰基脂质a以及阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂。适用于本发明疫苗的水包油型乳液的非限制性实例包括修饰的seam62和seam1/2制剂。修饰的seam62是一种水包油型乳液，其含有5％(v/v)角鲨烯(sigma)、1％(v/v)span.rtm.85清洁剂(ici表面活性剂)、0.7％(v/v)tween.rtm.80清洁剂(ici表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200pg/mlquila、100[mgr]g/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂。修饰的seam1/2是一种水包油型乳液，其包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)span.rtm.85清洁剂、0.7％(v/v)吐温80清洁剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/mlquila以及50μg/ml胆固醇。可以包含在疫苗中的其他免疫调节剂包括例如一种或多种介白素、干扰素或其他已知细胞因子。

本发明的疫苗可以任选地配制用于持续释放本发明的病毒、感染性rna分子、质粒或病毒载体。此类持续释放制剂的实例包括与生物相容性聚合物的复合物组合的病毒、感染性rna分子、质粒或病毒载体，所述生物相容性聚合物诸如为聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。药物递送媒剂中可降解聚合物的结构、选择和使用已经在若干出版物中有所综述，这些出版物包括a.domb等，1992,polymersforadvancedtechnologies3:279-292，其以引用的方式并入本文中。关于药物制剂中聚合物的选择和使用的额外指导可见于本领域中已知的文本中，例如m.chasin和r.langer(编)，1990,“biodegradablepolymersasdrugdeliverysystems”，在药物与制药科学(drugsandthepharmaceuticalsciences)中，第45卷，m.dekker,n.y.，其也以引用的方式并入本文中。可替代地或另外，可以对病毒、质粒或病毒载体进行微封装以改善施用和功效。用于微封装抗原的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如在以下各者中所述的技术：美国专利号3,137,631；美国专利号3,959,457；美国专利号4,205,060；美国专利号4,606,940；美国专利号4,744,933；美国专利号5,132,117；以及国际专利公开wo95/28227，所有这些都以引用的方式并入本文中。

还可以使用脂质体来提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。关于如何制造并使用脂质体制剂的细节尤其可见于美国专利号4,016,100；美国专利号4,452,747；美国专利号4,921,706；美国专利号4,927,637；美国专利号4,944,948；美国专利号5,008,050；和美国专利号5,009,956中，其全部内容以引用的方式并入本文。

上述疫苗中的任一者的有效量可以通过常规手段确定，以低剂量的病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体开始，并且然后增加剂量，同时监测作用。可以在单次施用疫苗之后或在多次施用疫苗之后获得有效量。当确定每种动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括所述动物的物种、大小、年龄以及一般情况、所述动物中其他药物的存在等。优选地在考虑来自其他动物研究(参见，下面的实施例3-7)的结果之后选择实际剂量。

是否已经实现了足够的免疫反应的一种检测方法是确定在疫苗接种之后动物中的血清转化和抗体滴度。疫苗接种的时间安排和加强剂(如果存在的话)的数量优选地将基于所有相关因素的分析由医生或兽医确定，所述因素中的一些在上文已有描述。

本发明的病毒、蛋白质、感染性dna分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已知技术，考虑可以由本领域的技术人员确定的因素如待接种疫苗的动物的体重来确定。本发明疫苗中本发明病毒的剂量优选在约10¹至约10⁹pfu(空斑形成单位)，更优选约10²至约10⁸pfu，并且最优选约10³至约10⁷pfu的范围内。本发明疫苗中本发明质粒的剂量优选在约0.1mg至约100mg，更优选约1mg至约10mg，甚至更优选约10mg至约1mg的范围内。本发明疫苗中本发明感染性dna分子的剂量优选在约0.1mg至约100mg，更优选约1mg至约10mg，甚至更优选约10mg至约1mg的范围内。本发明疫苗中本发明病毒载体的剂量优选在约10¹pfu至约10⁹pfu，更优选地约10²pfu至约10⁸pfu，并且甚至更优选地约10³pfu至约10⁷pfu的范围内。合适的剂量大小在约0.5ml至约10ml，并且更优选约1ml至约5ml的范围内。

根据本发明的实践，病毒蛋白或肽疫苗的合适剂量通常在1至50微克/剂量或更高的量范围内，如可以通过标准方法确定，其中关于每种此类物质，佐剂的量通过公认的方法确定。在一个关于猪的疫苗接种的本发明优选实施例中，动物的最佳年龄目标是在约1天与21天之间，在断奶前，还可以与安排的其他疫苗接种如对抗猪肺炎支原体或pcv一致。另外，育种大母猪的疫苗接种的优选安排将包括与每年再接种疫苗安排类似的剂量。

本发明的病毒、感染性rna分子、质粒或病毒载体的有效剂量可以使用已知技术，考虑可以由本领域的技术人员确定的因素如待接种疫苗的动物的体重来确定。举例来说，可以经口、非经肠、皮内、皮下、肌内、鼻内或静脉内递送疫苗。经口递送可以涵盖例如向动物的饲料或饮料中添加组合物。与疫苗剂量有关的因素包括例如猪的体重和年龄。

本发明还提供一种制备包含本文所述的prrs病毒、感染性rna分子、质粒或病毒载体的疫苗的方法，所述方法包含将有效量的本发明的prrs病毒、感染性rna分子、质粒或病毒载体中的一种与药用或兽用可接受的载剂组合。

另外，如美国专利号6,500,662中所述，可以对本发明的活减毒疫苗进行修饰以编码使用已知的重组技术插入prrs病毒基因组中的异源抗原表位。还参见美国专利7,132,106，其全文以引用的方式并入本文中。适用作本发明异源抗原表位的抗原表位包括来自除prrs病毒以外的猪病原体的抗原表位，包括(但不限于)来自选自由以下组成的群组的猪病原体的抗原表位：猪细小病毒、猪圆环病毒、猪轮状病毒、猪流感病毒、假狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、古典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、脑心肌炎病毒、猪副粘病毒、细环病毒、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)、猪放线杆菌(actinobacillussuis)、炭疽杆菌(bacillusanthraci)、支气管炎博德特菌(bordetellabronchiseptica)、溶血梭状芽胞杆菌(clostridiumhaemolyticum)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、大肠杆菌(escherichiacoli)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)、副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)、钩端螺旋体属(leptospiraspp.)、猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumoniae)、猪鼻支原体(mycoplasmahyorhinis)、猪滑液支原体(mycoplasmahyosynovia)、出血败血性巴斯德氏菌(pasteurellamultocida)、猪霍乱沙门氏菌(salmonellacholeraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、类马链球菌(streptococcusequismilis)以及猪链球菌(streptococcussuis)。编码来自上述猪病原体的抗原表位的核苷酸序列是本领域中已知的并且可以在万维网上从公共基因数据库如(美国)国家生物技术信息中心的基因库获得。

本领域的普通技术人员将从本申请的全部内容(包括具体实施方式)显而易见本发明的额外特征和变化形式，并且所有此类特征都旨在作为本发明的方面。类似地，本文中所述的本发明特征可以重新组合成额外实施方案，这些额外实施方案也旨在作为本发明的方面，这与上文是否具体提到特征组合作为本发明的方面或实施方案无关。此外，只有本文中描述为对本发明至关重要的此类限制才应该如此看待；缺乏本文中尚未描述为至关重要的限制的本发明变化形式旨在作为本发明的方面。应该清楚，本发明可以与以上描述和实施例中具体描述的不同的方式来实践。

因此，基于seqidno:5病毒的prrs疫苗将被视为具有安全性和功效概况的那些疫苗的代表，其提供允许尽早地，甚至在生命的第一天成功接种疫苗仔猪的显著改善，并且持久免疫力可达约6月龄，通过在使与猪生物学的相关性最大化的细胞培养环境中培养并减弱病毒，包括通过允许在猪宿主中适当且安全地复制病毒，而不是下调所需的宿主免疫反应，令人惊讶地提供了疫苗性能的此类前所未有的改善。此类益处提供给仔猪、公猪、大母猪和小母猪(妊娠前和妊娠期间)；并且在所有情况下，在疫苗接种时动物是血清反应阳性还是血清反应阴性。

同样显而易见的是，本发明的培养改善同样适用于欧洲prrs病毒，无论它们现在、过去，还是将要通过重组方法操作，或者仅通过主要是非重组手段分离、供养或培养和适应；在所有情况下，包括使用的任何培养细胞是重组细胞或者其本身是重组细胞。

鉴于以上教导，本发明的许多修改和变化形式是可能的，并且因此在本发明的范围内。

以下实施例旨在说明但不限制本发明。

实施例1--bhk21-c12-26细胞系的产生

bhk21-c12细胞系(这些研究中使用的bhk21-c12-26细胞系的亲本)的产生先前描述于us9,102,912中。在该专利中，bhk21-c12细胞系在实施例14和图6中称为bhk/cmv/v1#12。简而言之，在cmv启动子的控制下用质粒pcmv-suscd163v1转染常用的幼仓鼠肾细胞系bhk-21，所述质粒含有猪(sus)cd163prrsv受体基因的截短变体(v1)。所述质粒还含有在双原核/真核启动子的控制下用于分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行选择的卡那霉素/新霉素抗性基因。转染后，在96孔板中用g418(遗传霉素，新霉素类似物)和单细胞克隆对细胞进行同时选择。选择所得克隆之一(#12或“c12”)以进一步使用并命名为bhk21-c12。

bhk21-c12细胞系在g418选择下连续传代65次并保留prrsv允许表型。通过第64代，观察到少数细胞在prrs病毒感染后存活，指示表型不稳定的早期阶段。执行额外的单细胞克隆，并对于prrsv允许表型和一般生长特征评价许多新克隆。其中，选择优于其他克隆和亲本bhk21-c12细胞系的克隆#26。克隆#26命名为bhk21-c12-26，并且用于prrs病毒96v198的减毒。

实施例2-适合于适应和培养在很小的年龄如对于在出生后第1天接种疫苗安全且有效的病毒的额外细胞

pk-9细胞是通过用编码缺失形式的猪cd163基因和新霉素抗性基因的质粒稳定转染pk0809猪肾细胞系而衍生的转基因细胞系。先前已经描述了pk-9细胞系的构建和表征的细节(参见，美国专利9,102,912)。

应该注意的是，第一代病毒从pam细胞适应以在pk-9细胞上生长可能是困难的，并且需要用多个平行谱系进行的多次尝试。在这种情况下，可以使用对病毒核衣壳蛋白(ruraltechnologiesinc，brookingssouthdakota)具有特异性的fitc-缀合的单克隆抗体sdow17，通过重复孔的免疫荧光监测感染。早期传代可能会导致少许小病灶，并且不会产生足够的无细胞病毒粒子来引发新鲜单层的感染。尽管如此，这些传代可以通过用accutase(胰蛋白酶替代物)处理感染的单层并用新鲜培养基在添加或不添加未感染的pk-9细胞的情况下在多个孔中重新接种细胞来实现。在几次此类传代之后，一些谱系应该显示出荧光灶的频率和大小的明显增加。其中的一些应该获取使用无细胞病毒液传代的能力。通常，预计适当的传代证明抑制α干扰素的能力降低。

本发明的欧洲prrs疫苗的安全性和功效通过直接遵循的包括实施例3-7的实验协议和数据进一步证明。

实施例3-对1天龄仔猪施用欧洲prrsmlv，随后在疫苗接种后约26周用另外的欧洲prrsv分离株进行攻击，由此提供免疫期。

该研究的目的是在1天龄时通过肌内途径(im，组t02)或鼻内途径(in，组t03)接种疫苗，然后在疫苗接种后26周用不同的欧洲prrsv分离株进行呼吸攻击的猪中评价欧洲prrs修饰的活疫苗(由seqidno:5编码的病毒)的免疫期(doi)。确定功效的主要变量是与t01猪相比治疗组t02和t03的血清病毒载量(病毒血症)。将肺病变、直肠温度、脱落、临床征象和体重作为次要变量进行比较。

在1天龄时，来自组t02和t03的猪通过肌内途径(t02)或鼻内途径(t03)施用单次2ml剂量的ivp。来自对照组(t01)的猪接受2ml肌内盐水溶液和2ml鼻内盐水溶液。在疫苗接种后26周(182天)，用euprrsv分离株olot/91(参见j.duran等，virusgenes，第14卷，第1期，1997，第19页至第29页；和z.lu等，virologyjournal，第11卷，第42期，2014)作为呼吸攻击对猪进行鼻内攻击。在攻击阶段期间，每隔3至4天收集血样、鼻或口腔拭子、临床观察和直肠温度，直至尸体剖检日。在疫苗接种之前、攻击前和尸体剖检时对猪进行称重。攻击后9或10天，对猪实施安乐死并进行尸体剖检。尸体剖检时，评价肺prrsv病变的存在并进行评分。该测试是有效的，因为在整个疫苗接种期所有t01猪都保持prrsv病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。

当比较组间血清中的病毒载量时，观察到im疫苗接种和in疫苗接种两者的保护性作用。在攻击后的所有采样日(第3天、第6天、第8天和第9/10天，对应于研究第185天、第188天、第190天和第191/192天)，与对照组相比，用ivp进行疫苗接种的两组(t02和t03)均具有显著(p≤0.05)低的病毒滴度。与对照组相比，功效还通过尸体剖检时prrsv相关肺病变的显著减少以及两个接种疫苗组中鼻和口腔脱落的显著减少支持。

接种疫苗组之间的比较揭示，在攻击后3天，与通过im途径接种疫苗的组(t02)相比，通过in途径接种疫苗的组(t03)具有显著更低的病毒血症、鼻脱落和口腔脱落。这些结果指示，在本研究的条件下，in疫苗接种后获得的保护作用强于im疫苗接种后获得的保护作用。

疫苗接种在疫苗接种后28天内诱导prrsv特异性抗体的发展。所有接种疫苗的猪在攻击时(疫苗接种后26周)对prrs抗体呈血清反应阳性，指示两种施用途径都能够引发针对疫苗接种的强烈且保护性的抗体反应。然而，与通过肌内接种疫苗的组相比，在通过in途径接种疫苗的组中在攻击时检测到的抗体滴度水平显著更高，这一事实可以解释在攻击后3天，与im组相比，in组中血清和排泄途径检测到的病毒载量显著降低。

总之，本研究的结果证明，通过肌内或鼻内途径向1天龄猪中单次施用含有2.5log10ccid50剂量的euprrsvmlv疫苗(seqidno:5)赋予6.5个月(26周)的免疫保护期。

实施例3至7中使用的缩写包括：aaalac，实验动物护理认可和评估委员会；ae，不良事件；ccid50，细胞培养感染剂量50％；cp，对照产品；dc，攻击日；dcf，数据采集形式；drac，每日复查动物护理；id，鉴定；if，免疫荧光；im，肌内；in，鼻内；iv，静脉内；ivp，研究性兽医产品；mda，母源抗体；mlv，修饰的活疫苗；msf，主研究文档；msv，主种子病毒；na，不适用；pam，猪肺泡巨噬细胞；prrsv，猪繁殖与呼吸综合症病毒；pbs，磷酸盐缓冲盐水；rt-qpcr，定量逆转录聚合酶链反应；sart，病态动物报告和治疗；sop，标准操作工序；s/p，样品阳性比；和tbd，待定。

设计

在1天龄时，向t01仔猪施用2ml剂量(im途径)和2ml剂量(in途径)的cp。此外，单次2.0ml剂量的ivp通过im途径施用到t02仔猪，且通过in途径施用到t03仔猪。疫苗接种后26周，用prrsvolot/91攻击猪，并且在攻击后9-10天对其实施安乐死并进行尸体剖检。第0天＝疫苗接种日。

随机化

出生后立即对仔猪进行交叉饲养，使仔猪随机分布，并且尽可能均匀地散在所有大母猪之中。在断奶时，将大母猪移出并将仔猪圈养在源农场的围栏中(每次处理1个围栏)。

动物的某些参数如下：

使用12头妊娠的大母猪总共获得117头仔猪。在预计的分娩日前一天，通过肌内注射氯前列醇(porcino,virbac)诱导分娩。所有大母猪在(d-1)后一天分娩。为了减少分娩期和死产仔猪的数量，除两头(已完成分娩的71和78)外的所有大母猪都注射了催产素(dfv)。

在疫苗接种阶段期间，8头仔猪死亡或必须实施安乐死。剩余的109头仔猪中，55头用于本研究。

为了减少年龄较大的雄性猪的侵略性和性行为，在特定地点的动物福利工序后，在6天龄时对仔猪进行阉割。三头仔猪(232、284和286)因阴囊疝而无法阉割。

疫苗接种后约1个月，两头突然死亡，病理结果相同，地板上出现白点，并且一些猪在排尿结束时显示白色尿液，这表明细菌感染影响了泌尿道。认为该过程对研究结果没有影响，因为所有动物对治疗反应良好，并且在疫苗接种的其余阶段(接下来3个月，直至攻击)期间没有出现其他病例。·可能影响动物健康和结果评价的与测试工序无关的损伤或临床疾病的任何动物可以由研究者自行决定退出研究。研究性兽医产品(ivp)由冷冻干燥的部分提供，该部分以2.5log10ccid50/ml(seqidno:5病毒)重悬于盐水溶液中

重构

在第0天，用疫苗稀释剂(批次t22019)稀释ivp以匹配目标滴度(2.5log10ccid50/2ml)。收集一等份的ivp以在bhk-21-c12-26细胞上滴定以确认剂量。将额外的ivp样品冷冻(-80±10℃)并作为保留样品储存。遵循当地标准工序执行bhk-21-c12-26细胞上的滴定。重构并稀释的疫苗的滴度为10^1.9ccid50/ml，其对应于10^2.2ccid50/2ml(2.2log10ccid50/2ml)。在第0天，用疫苗稀释剂(批次t22019)稀释ivp以匹配目标滴度(2.5log10ccid50/2ml)。收集一等份的ivp以在bhk-21-c12-26细胞上滴定以确认剂量。将额外的ivp样品冷冻(-80±10℃)并作为保留样品储存。遵循当地标准工序执行bhk-21-c12-26细胞上的滴定。重构并稀释的疫苗的滴度为10^1.9ccid50/ml，相当于10^2.2ccid50/2ml(2.2log10ccid50/2ml)，对照产品(cp)是疫苗稀释剂(盐水溶液)，并以4.0ml(2.0mlim+2.0mlin)施用。

在第0天，用如所述的ivp或cp对仔猪进行疫苗接种。t01和t02组的仔猪在颈部右侧经肌内注射。t01和t03组的仔猪经鼻内施用，在每个鼻孔中递送1.0ml。

攻击施用

通过用olot/91病毒以105.7ccid50/2ml的滴度在每个鼻孔中滴入1.0ml攻击材料，对所有猪进行鼻内(in)攻击，总攻击体积为2.0ml。

结果-病毒血症

所有猪在疫苗接种前(d0)和攻击前(d181)血清中rt-qpcrprrsv阴性。攻击后，来自t01组的100％的猪在第185天(攻击后3天，dc+3)患上病毒血症并且保持阳性直至研究结束。在接种疫苗组中，100％(t02组)和88％(t03)的猪在dc+3时也是阳性的。然而，与对照组t01相比，两个接种疫苗组中阳性猪的百分比随时间减小并且在dc+8和尸体剖检日(dn)显著降低。

在两个接种疫苗组中，在攻击后的所有采样日，与组t01相比，血清中检测到的病毒载量的量也显著降低。在第185天(dc+3)，在t03组中还观察到病毒滴度关于t02的显著降低。表1汇总攻击期后10天期间的病毒血症结果。

表1.根据组和研究日的病毒血症结果(攻击期数据)的汇总

n：数量；se：标准误差；cb：置信界限；d＝研究日；dc：攻击日；dn：尸体剖检日；rt-qpcr阳性：>1.7log10rna拷贝/ml。

鼻脱落

在攻击前(d181)，所有猪在鼻拭子中都是rt-qpcrprrsv阴性。攻击后，来自t01的所有猪都成了鼻脱落者。在接种疫苗组中，曾通过鼻途径脱落的猪的百分比为94％(t02组)和88％(t03组)。关于t01组，在t03组中在第185天、第188天和第191/192天(dc+3、dc+6和dn)以及在t02组中在第191/192天(dn)观察到鼻脱落者的百分比显著降低。在接种疫苗组之间未检测到鼻脱落者百分比的显著差异。与dc+6和dn的t02组相比并且与dc+3、dc+6和dn的t03相比，t01组中通过鼻途径脱落的病毒量显著更高。接种疫苗组之间的比较揭示，与dc+3的t03相比，t02组中的病毒滴度显著更高。表2汇总攻击期后10天期间的鼻脱落结果。

表2.根据组和研究日的鼻脱落结果(攻击后数据)的汇总

n：数量；se：标准误差；cb：置信界限；d＝研究日；dc：攻击日；dn：尸体剖检日；rt-qpcr阳性：>1.7log10rna拷贝/ml

口腔脱落

在攻击前(d181)，所有猪在口腔拭子中都是rt-qpcrprrsv阴性。攻击后，曾通过口腔途径脱落的猪的比例在t01组、t02组和t03组中分别为9/20(45％)、8/18(44％)和7/17(41％)。到研究结束时，来自t02组的所有猪和t03组中除一头猪外的所有猪在口腔拭子中都是阴性的。在对照组t01中，那时5/20仍为阳性；在研究结束时(dn)，t01和t02之间口腔脱落者的百分比差异在统计学上是显著的。在尸体剖检日，对应于攻击后9/10天，与t03组相比，在t01组中通过口腔途径脱落的病毒量显著更高。在第185天(dc+3)，与t01和t03两者相比，t02组的病毒载量也显著更高。表3汇总攻击期后10天期间的口腔脱落结果。

表3.根据组和研究日的口腔脱落结果(攻击后数据)的汇总

n：数量；se：标准误差；cb：置信界限；d＝研究日；dc：攻击日；dn：尸体剖检日；rt-qpcr阳性：>1.7log10rna拷贝/ml

临床观察

在整个攻击后期间，没有一头猪显示出异常的一般情况、抑郁、呼吸窘迫、咳嗽或打喷嚏。

直肠温度

表4汇总攻击后期间的直肠温度结果。在t01组中，5/20头猪(25％)在攻击后期间至少发烧一次(rt≥40.5)。在接种疫苗组t02和t03中，攻击后发烧的猪的比例分别为8/18(44％)和12/17(71％)。在第185天(dc+3)，与t01组相比，接种疫苗组t02和t03中的直肠温度显著更高。

表4.根据组和研究日的仔猪直肠温度结果的汇总

lsm：最小二乘平均值；se：标准误差；cb：置信界限；rt：直肠温度

肺病变

每个治疗组的病变肺的百分比示于表5中。肺视觉分数显示在表6中。在尸体剖检时，来自对照组t01的18/20猪(90％)具有阳性肺视觉分数，指示prrsv攻击成功诱导肺病变。在t02和t03组中，12/17(71％)和7/16(44％)猪也得分为阳性。来自t03组的一头猪(#300)显示出catharral化脓性胸膜肺炎，其影响10％至70％的右肺叶，2％至30％的左肺叶和70％的附加叶，从而掩盖了任何潜在的prrsv相关病变的存在。来自该猪的数据自分析标记(参见msf的标记报告)。与接种疫苗组t02和t03相比，在对照组t01中在尸体剖检时观察到的病变肺的百分比显著更高。在接种疫苗组之间未发现差异。

表5.病变肺的百分比的汇总

^*不同的字母上标指示统计学上显著的差异。

表6.治疗组的肺视觉分数

血清学(elisa)结果

血清学结果的汇总示于表7中。自疫苗接种期间以每月间隔收集的样品获得的elisa结果仅用描述性统计(几何平均值和标准偏差)汇总；因为没有实验单元的复制(治疗没有混合)，所以无法评价组间差异。组间差异仅在动物混合用于攻击期后在研究第181天进行测试。所有猪在疫苗接种前均为elisa阴性(idexxs/p比<0.4)。来自对照组t01的猪直至攻击保持阴性。疫苗接种后一个月(第28天)，来自t02和t03组的所有猪已经发展针对prrsv的抗体，并且它们在攻击时(疫苗接种后6.5个月)都仍然是阳性的。在第181天(dc-1)的组间比较揭示，与t02组相比，t03组中的最小二乘平均抗体滴度显著更高。

表7.s/p比elisa结果的汇总，

^*第0天、第28天、第56天、第83天、第113天、第140天和第168天的结果用几何平均值和标准偏差(sd)表示。第181天，反向变换-最小二乘平均值(lsm)和标准误差(se)；elisa阳性：s/p比≥0.4

病毒血症和脱落

在统计分析之前，使用适当的对数变换来变换rt-qpcr。使用一般线性重复测量的混合模型分析变换的数据。如果治疗或治疗-时间点相互作用效应是显著的(p≤0.05)，则在每个时间点进行成对治疗比较。治疗最小二乘平均值和95％置信区间被反向变换以进行呈现。还计算了病毒血症动物/脱落者的百分比。如果>50个prrsvrna拷贝/ml(1.7log10prrsvrna拷贝/ml)，其对应于该技术的检测限(100个prrsvrna拷贝/ml)的一半，则确定每个样品为阳性。还确定了动物对于天数≤dc(是指攻击前)和天数>dc(攻击后)是否曾患病毒血症或曾经是脱落的。计算每个时间点病毒血症状态的频率表，以及动物在攻击前数天和攻击后数天是否曾患病毒血症。

直肠温度

使用一般线性重复测量混合模型分析来分析直肠温度。如果治疗或治疗-时间点相互作用效应是显著的(p≤0.05)，则在每个时间点进行成对治疗比较。计算每个时间点的治疗最小二乘平均值、95％置信区间、最小值和最大值。计算每种治疗和研究日、攻击前的描述性统计、平均值、标准偏差和范围。

对于每种治疗，计算发烧动物(直肠温度□40.5℃)的频率分布，并且收集时间点数据。对于天数≤dc以及对于天数>dc确定动物是否曾经发烧过。如果动物曾发烧过，则对于每个时期：天数≤dc以及天数>dc，计算频率表。

血清学(elisa)

在统计分析之前，必要时使用适当的对数变换来变换血清学。使用一般线性重复测量的混合模型分析变换的血清学数据。如果治疗或治疗-时间点相互作用效应是显著的(p≤0.05)，则在每个时间点进行成对治疗比较。治疗最小二乘平均值和95％置信区间被反向变换以进行呈现。此外，对于每种治疗在每个时间点计算阳性/阴性结果的频率分布。此外，确定研究期间的任何时间每只动物是否发生血清转化(s/p比≥0.4)。对于每种治疗，计算动物是否发生血清转化的频率分布。对于每种治疗，计算攻击前的描述性统计、平均值、标准偏差和范围。

临床观察

对于每种治疗，单独地计算攻击前临床征象的频率分布和攻击后临床征象的频率分布，并且收集时间点数据。对于每种治疗，计算每个阶段(天数≤dc和天数>dc)动物是否曾具有临床征象的频率分布。

体重

使用一般线性重复测量混合模型分析体重。对于每种治疗，在每个时间点计算最小二乘平均值、标准误差、95％置信区间、最小值和最大值。如果治疗作用和/或治疗-时间点相互作用是显著的，则在每个时间点进行治疗之间的成对治疗比较。计算估计值的标准误差和95％置信区间。对于每种治疗，计算攻击前的描述性统计、平均值、标准偏差和范围。使用来自模型的参数估计来计算平均每日增加估计和比较。

肺病变

使用以下公式计算总病变肺(totallungwithlesion)的百分比：总病变肺的百分比＝(0.10×左颅)+(0.10×左中)+(0.25×左尾)+(0.10×右颅)+(0.10×右中)+(0.25×右尾)+(0.10×附件)。在分析之前，对总病变肺的百分比应用平方根反正弦变换。用一般线性混合模型分析变换的肺病变。如果治疗作用是显著的，则进行治疗组之间的成对比较。计算总病变肺的百分比的反向变换最小二乘平均值、其标准误差及其95％置信区间以及最小值和最大值。

肺病变评估分数

计算每种治疗的肺病变评估分数的频率分布。使用用于二项式数据的广义线性混合模型分析正常或不正常的分数。如果一般线性混合模型没有收敛，则使用费希尔精确检验(fisher’sexacttest)来分析数据。如果治疗主作用是显著的，则进行成对治疗比较。

分析模型

总病变肺的变换百分比用一般线性混合模型分析，所述模型具有固定效应治疗以及随机效应围栏和围栏内区块。在测试显著(p≤0.05)治疗作用后，在先验对比中使用参数估计的线性组合。进行治疗之间的比较。使用5％的显著性水平(p≤0.05)来评估统计学差异。对于每种治疗，计算最小二乘平均值(反向变换)、标准误差、平均值的95％置信区间和范围。

病毒血症状态用具有罗吉连接(logitlink)的一般线性重复测量混合模型分析，所述模型具有固定效应：治疗、时间点和治疗-时间点相互作用，以及随机效应：围栏、围栏内区块以及区块、围栏和治疗内的动物，这是动物术语。在测试显著(p≤0.05)治疗作用或治疗-时间点相互作用后，在先验对比中使用参数估计的线性组合。在每个时间点的治疗之间进行比较。使用5％的显著性水平(p≤0.05)来评估统计学差异。对于每种治疗和每个时间点，计算最小二乘平均值(反向变换)、标准误差和平均值的95％置信区间。如果所述模型没有收敛，则使用费希尔精确进行分析。

肺部评估得分、正常/不正常以及是否曾患病毒血症用广义线性混合模型通过glimmix分析，所述模型具有固定效应治疗和随机效应围栏和围栏内区块。如果治疗主作用是显著的，则进行成对治疗比较。如果glimmix没有收敛，则使用费希尔精确检验进行分析。

病毒载量、血清学、体重和直肠温度用广义线性重复测量混合模型分析，所述模型具有固定效应：治疗、时间点和治疗-时间点相互作用，以及随机效应：围栏、围栏内区块以及区块、围栏和治疗内的动物，这是动物术语。在测试显著(p≤0.05)治疗作用或治疗-时间点相互作用后，在先验对比中使用参数估计的线性组合。在每个时间点进行治疗之间的比较。使用5％的显著性水平(p≤0.05)来评估统计学差异。对于每种治疗和每个时间点，计算最小二乘平均值(对于病毒载量和血清学进行反向变换)、标准误差、平均值的95％置信区间和范围。所有假设检验均使用双侧检验以0.05的显著性水平进行。

讨论

因此，本研究的目的是在1天龄时通过肌内途径(im，组t02)或鼻内途径(in，组t03)接种疫苗的猪在疫苗接种后26周用基因型iprrs分离株作为呼吸攻击进行接种后评价euprrs修饰的活疫苗(seqidno:5)的免疫期(doi)。确定功效的主要变量是与t01猪相比治疗组t02和t03的血清病毒载量(病毒血症)。将肺病变、直肠温度、脱落、临床征象和体重作为次要变量进行比较。

该测试是有效的，因为在整个疫苗接种期所有t01猪都保持prrsv病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。当比较组间血清中的病毒载量时，观察到im和in疫苗接种的保护性作用；在攻击后的所有采样日，对照组t01与接种疫苗组t02和t03相比具有显著更高的病毒滴度。此外，关于对照组，在两个接种疫苗组中，在攻击后第8天和第9/10天，病毒血症猪的比例也显著降低。当比较接种疫苗组时，与通过肌内接种疫苗的组(t02)相比，在通过in途径接种疫苗的组(t03)中在第185天(dc+3)检测到显著更低的病毒滴度。im和in疫苗接种对病毒复制的益处也通过两个接种疫苗组在通过鼻途径脱落的病毒量以及鼻脱落者百分比方面观察到的显著降低来支持。此外，在攻击后第9/10天的口腔脱落方面也观察到疫苗接种的积极作用，正如关于对照组而言病毒载量显著降低(t03组)或口腔拭子中阳性的猪的百分比(t02组)所证明。

攻击后，在dc+3，与对照组相比，两个接种疫苗组的直肠温度显著更高。那时，通过im和in途径用ivp进行疫苗接种的组中发烧(rt≥40.5℃)猪的比例分别为6/18(33％)和9/17(53％)。在对照组中，在dc+3，只有1/20(5％)发烧。然而，值得注意的是，在(dc+3)时，与对照组相比，在两个接种疫苗组中血清中检测到的病毒载量确实显著降低，因此表明prrsv复制可能不是在攻击后不久在接种疫苗的猪中观察到的直肠温度升高背后的唯一原因。此外，从那时起，接种疫苗的猪的直肠温度下降，并且在攻击后第8天，所有组的平均直肠温度已经低于40℃。

除了直肠温度升高外，在整个攻击后期间，来自任何组的猪均未显示出与prrsv相容的临床征象(异常身体状况、抑郁、呼吸窘迫、咳嗽或打喷嚏)。此外，组间没有检测到体重或平均日体重增加的差异。

在尸体剖检时，来自对照组t01的18/20猪(90％)具有阳性肺视觉分数，指示prrsv攻击成功诱导肺病变。在t02和t03组中，12/17(71％)和7/16(44％)猪也得分为阳性。治疗组之间的比较显示，对照组中病变肺的百分比显著高于接种疫苗组，证明疫苗接种对降低prrsv相关的肺病变的益处，而与施用途径无关。

血清学数据证明，通过im或in途径用ivp进行疫苗接种在疫苗接种后28天内诱导prrsv特异性抗体的发展。所有接种疫苗的猪在攻击时(疫苗接种后6.5个月)对prrsv抗体呈血清反应阳性，指示两种施用途径都能够引发针对疫苗接种的强烈且保护性的抗体反应。然而，接种疫苗组之间的比较显示，与通过im途径接种疫苗的组相比，in途径接种疫苗的组中的抗体滴度显著更高。

虽然通过in和im途径进行的疫苗接种在疫苗接种后26周时赋予对抗prrsv攻击的明确保护，但组间的比较揭示，在攻击后3天，与肌内注射接种疫苗的组(t02)相比，通过in途径接种疫苗的组(t03)具有显著更低的病毒血症、鼻脱落和口腔脱落。这些结果指示，在本研究的条件下，in疫苗接种后获得的保护作用强于im疫苗接种后获得的保护作用。病毒学结果的这些差异将通过与im接种疫苗的组(s/p比范围：0.477-1.959)相比，在in接种疫苗的组(s/p比范围：0.665-2.422)中在攻击前通过elisa检测到显著更高的抗体滴度来解释。

通过im或in途径单次施用含有2.5log10ccid50剂量的euprrsmlv疫苗(seqidno:5)到1天龄血清反应阴性猪的疫苗接种赋予26周的免疫期，如在疫苗接种后26周用致病性euprrsv病毒株攻击后在血清中检测到的病毒载量显著降低所看到的。功效还通过尸体剖检时肺病变的百分比显著降低以及鼻和口腔脱落的减少来支持。

实验室方法

关于rtqpcr，通过遵循局部sop对疫苗接种前(d-1)、攻击前(d62)和攻击后第3天、第5天、第7天和第10天(d66、d68、d70和d73)收集的血清样品执行的逆转录(rt)qpcr测量病毒血症(血清中的prrsv载量)和脱落(拭子材料中的prrsv载量)。简而言之，将纯化的病毒rna用作模板，在50℃下逆转录30分钟，并在95℃下变性5分钟。反应的pcr程序由在95℃下变性20秒和在53℃下退火40秒的40个循环组成。qrt-pcr在7500实时pcr系统热循环仪中进行。如下为莱利斯塔德病毒选择适当的引物和探针：

正向引物(莱利斯塔德f)：5'-gcaccacctcacccagac-3'(seqidno:6，终浓度为0.5微摩尔)。

反向引物(莱利斯塔德r)：5'-cagttcctgcgccttgat-3'(seqidno:7，终浓度为0.5微摩尔)。

探针(莱利斯塔德s)：5'-6-fam-cctctgcttgcaatcgatccagac-tamra-3'(seqidno:8，终浓度为0.6微摩尔)。

血清学(elisa)

遵循制造商的说明，使用idexxprrsx3elisa针对抗prrsv的抗体测试疫苗接种前(d0)、攻击前(d67)和尸体剖检时(d77)收集的血清。简而言之，将血清样品在涂有重组prrsv抗原的96孔板中以1:40稀释，并在18-26℃下温育30分钟。洗涤后，添加抗猪辣根过氧化物酶缀合物，并且将板在18-26℃下再温育30分钟。洗去未结合的缀合物并将tmb底物添加到孔中。在650nm下测量显色。记录每个样品的s/p值。如果s/p比≥0.4，则将样品归类为prrs抗体阳性。如果s/p比<0.4，则将样品归类为阴性。elisa说明包括在研究文件中。

实施例4-施用到2周龄猪的修饰的活euprrsv疫苗在疫苗接种后4周对抗欧洲prrs分离株的攻击的免疫起始(ooi)

本研究的目的是评价施用到2周龄猪的实验性euprrsvmlv疫苗(seqidno:5病毒)用于预防疫苗接种后4周由prrsv诱导的呼吸道疾病的免疫起始(ooi)。确定疾病预防的主要变量是与t01(用对照产品进行疫苗接种)相比，治疗组t02(用测试项目进行疫苗接种)血清中的病毒载量，其通过肺病变、口腔和鼻脱落、临床观察、直肠温度和体重支持。

在14-15天龄时，将单次2.0ml剂量的对照产品(cp)或测试项目(ti，seqidno:5病毒)作为肌内注射施用到每只动物。疫苗接种后4周，用euprrsv分离株olot/91作为呼吸攻击对猪进行鼻内攻击。在攻击期间，每隔2-3天收集血液样品、鼻和口腔拭子、临床观察和直肠温度，直至尸体剖检日。在疫苗接种前一天、攻击前和尸体剖检时对猪进行称重。攻击后10天，将猪麻醉，实施安乐死并进行尸体剖检。尸体剖检时，评价肺prrsv病变的存在并进行评分。该研究是有效的，因为在整个疫苗接种期t01猪都保持prrsv血清阴性和病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。

当比较组间血清中的病毒载量时，观察到疫苗接种的保护性作用。在攻击后的所有采样日，与对照组相比，用ti进行疫苗接种的组(t02)具有显著更低的病毒滴度。

功效还通过尸体剖检时(攻击后10天)病变肺的百分比显著降低、鼻和口腔脱落减少以及攻击后7天直肠温度降低来支持。没有检测到体重的差异。疫苗接种在疫苗接种后4周内诱导prrsv特异性抗体的发展。攻击后10天，与对照组(t01)相比，t02组中的抗体滴度保持显著更高。总之，对14-15天龄猪(对prrsv呈血清反应阴性)单次肌内施用含有2.0log10ccid50剂量的实验性euprrsvmlv疫苗免于受到在疫苗接种后4周用致病性euprrsv病毒株攻击后诱导的呼吸道疾病。实验设计如下：

在第27天，在重新饲养猪后，通过鼻内(in)途径用2ml攻击病毒株olot/91攻击所有动物。通过在每个鼻孔中滴入1.0ml攻击材料，对猪进行攻击，总攻击体积为2.0ml。在攻击后将猪保持处于前视位置几秒钟。

临床观察和直肠温度

在指明错误的日期记录直肠温度和临床观察！没有找到参考源。临床观察包括一般情况、抑郁、打喷嚏、咳嗽和呼吸窘迫。根据当地标准工序收集直肠温度。在未执行完整临床检查的那些日子(疫苗接种/攻击接种之前和之后)，观察猪的一般健康状况并遵循标准sop以每日复查动物护理(drac)形式记录。

尸体剖检和肺评分。

尸体剖检时，使用以下方法对肺病变进行评分：1)将对每个肺叶(左颅、左中、左尾、右颅、右中、右尾和附件)的实变百分比进行评分并记录为具有病变的所观察肺叶的百分比；和2)数字视觉分数(0、1、2、3)。

rtqpcr

通过遵循标准工序执行的逆转录(rt)qpcr测量病毒血症(血清中的prrsv载量)和脱落(鼻和口腔拭子中的prrsv载量)。简而言之，将纯化的病毒rna用作模板，在50℃下逆转录30分钟，并在95℃下变性5分钟。反应的pcr程序由在95℃下变性20秒和在53℃下退火40秒的40个循环组成。qrt-pcr在7500实时pcr系统热循环仪中进行。结果表示为rna拷贝/ml。

血清学

遵循制造商的说明，使用idexxprrsx3elisa针对抗prrsv的抗体测试疫苗接种前、攻击前和尸体剖检时收集的血清。简而言之，将血清样品在涂有重组prrsv抗原的96孔板中以1:40稀释，并在18-26℃下温育30分钟。洗涤后，添加抗猪辣根过氧化物酶缀合物，并且将板在18-26℃下再温育30分钟。洗去未结合的缀合物并将tmb底物添加到孔中。在650nm下测量显色。记录每个样品的s/p值。如果s/p比≥0.4，则将样品归类为prrs抗体阳性。如果s/p比<0.4，则将样品归类为阴性。elisa说明包括在研究文件中。该研究在第37天结束(安乐死)。

病毒血症和脱落

在统计分析之前，使用适当的对数变换来变换rt-qpcr数据。使用一般线性重复测量的混合模型分析变换的数据。如果治疗或治疗-时间点相互作用效应是显著的(p≤0.05)，则在每个时间点进行成对治疗比较。治疗最小二乘平均值和95％置信区间被反向变换以进行呈现。还计算了病毒血症/脱落天数百分比。如果>250个prrsvrna拷贝/ml，其对应于该技术的检测限(500个prrsvrna拷贝/ml)的一半，则确定每个样品为阳性。还确定了动物对于天数≤27(是指攻击前)和天数>27(攻击后)是否曾患病毒血症或曾经是脱落的。

肺病变

使用以下公式计算总病变肺的百分比：总病变肺的百分比＝(0.10×左颅)+(0.10×左中)+(0.25×左尾)+(0.10×右颅)+(0.10×右中)+(0.25×右尾)+(0.10×附件)。在分析之前，对总病变肺的百分比应用平方根反正弦变换。用一般线性混合模型分析变换的肺病变。如果治疗作用是显著的，则进行治疗组之间的成对比较。计算总病变肺的百分比的反向变换最小二乘平均值、其标准误差及其95％置信区间以及最小值和最大值。计算每种治疗的肺病变评估分数的频率分布。使用用于二项式数据的一般线性混合线性模型分析正常或不正常的分数。如果一般线性混合模型没有收敛，则使用费希尔精确检验来分析数据。如果治疗主作用是显著的，则进行成对治疗比较。

肺评分

每个治疗组的病变肺的百分比示于表8中。肺视觉分数显示在表9中。在尸体剖检时，来自对照组t01的17/18猪(94.4％)具有阳性肺视觉分数，指示prrsv攻击成功诱导肺病变。在t02组中，14/19(73.7％)猪也得分为阳性。与t02组相比，对照组t01具有显著更高的病变肺的ls平均百分比。关于总肺视觉分数，将来自所有t02猪的肺评分为0(无病变)或1(轻度病变)。在t01对照组中，7/18(38.9％)猪给出2的视觉分数(中度病变)。来自任何组的肺均未给出3的视觉分数(严重病变)。

表8.病变肺的百分比的汇总

不同的上标意指组之间存在显著差异。

表9.治疗组的肺视觉分数

rt-qpcr结果，病毒血症(血清中的prrsv载量)

在第0天，发现所有猪在血液中都是rt-qpcrprrsv阴性。在攻击时(第27天)，可以在100％的用ti进行疫苗接种的猪(t02组)中检测到prrsvrna。到那时，所有t01猪仍然是prrsv阴性。在对照猪中，首先在第29天(攻击后2天)检测到病毒血症，并且猪保持prrsv阳性，直至研究结束。在攻击后的所有采样日，在对照t01组中检测到的病毒载量显著高于在t02组中检测到的病毒载量。表10汇总从第27天(攻击日)直至第36天的病毒血症结果。最小二乘平均值和组间ls平均值差异的汇总示于表11中。

表10.根据组和研究日的病毒血症结果的汇总。

rt-qpcr阳性：>2.4log10rna拷贝/ml

表11.病毒血症结果的最小二乘平均值的汇总表。

不同的上标意指组之间存在显著差异。

鼻和口腔脱落

发现所有猪在第0天在鼻和口腔拭子中都是rt-qpcrprrsv阴性。在攻击时(第27天)，70％和85％的用ti进行疫苗接种的猪(t02组)分别在鼻拭子和口腔拭子中具有可检测的prrsvrna。来自t01组的猪那时都没有脱落。在攻击后期间，t01组中鼻脱落者的百分比范围为85％(第34天)至100％(第29天)。在t02组中，鼻脱落者的百分比范围为42％(第36天)至90％(第29天)。关于口腔脱落，t01组中阳性猪的百分比在95％至100％之间，且组t02中阳性猪的百分比在73.7％至100％之间。组间lsm的比较揭示，在t01组中在攻击后的所有天数，而对于鼻拭子在第34天以及对于口腔拭子在第31天和第36天，病毒载量显著更高。

从第27天(攻击日)直至第36天的鼻和口腔脱落的结果分别汇总在表12和

表54中。组间lsm和ls平均值差异的汇总示于表13和表15中。

表12.根据组和研究日的鼻脱落结果的汇总。

rt-qpcr阳性：>2.4log10rna拷贝/ml

表13.鼻脱落结果的最小二乘平均值的汇总表。

表5.根据组和研究日的口腔脱落结果的汇总。

rt-qpcr阳性：>2.4log10rna拷贝/ml

表6.口腔脱落结果的最小二乘平均值的汇总表。

不同的上标意指组之间存在显著差异。

血清学

所有猪在疫苗接种前均为prrsv血清学阴性(idexxs/p比<0.4)。在攻击时(疫苗接种后4周)，所有对照猪仍为血清反应阴性，而90％的用ti进行疫苗接种的猪已经血清转化为prrsv(idexxs/p比>0.4)。在第36天(攻击后9天)，所有猪都对prrsv呈血清反应阳性。与对照组t01相比，来自组t02的猪具有显著更高的ls平均抗体滴度。表76汇总通过elisa获得的血清学结果。

表76.根据治疗组和天数的s/p比elisa结果(ls平均值和范围)以及血清反应阳性猪的百分比

不同的上标意指组之间存在显著差异。

讨论

该研究评价在14-15天龄接种疫苗的猪中在疫苗接种后4周用致病性基因型iprrsv分离株作为呼吸攻击进行接种后修饰的活prrsv疫苗的免疫起始(ooi)。该测试是有效的，因为在整个疫苗接种期所有t01猪都保持prrsv血清阴性和病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。

确定功效的主要变量是与t01猪相比治疗组t02的血清病毒载量。将肺病变、直肠温度、脱落、临床征象和体重作为次要变量进行比较。

当比较t01组和t02组之间血清中的病毒载量时，观察到疫苗接种的保护性作用；在攻击后的所有采样日，与对照组t01相比，用ti进行疫苗接种的组具有显著更低的病毒滴度。

攻击后，无论治疗组如何，均可在所有猪中检测到口腔和鼻脱落。然而，在t01组中在所有天数，而对于鼻拭子第34天，且对于口腔拭子第31天和第36天，检测到显著更高的病毒载量。

关于肺病变，当比较组间肺病变的反向转变最小二乘平均百分比时，对于t02猪还观察到保护性疫苗作用。此外，在尸体剖检时给予阳性视觉分数的所有14头t02猪被评分为1(轻度病变)。相反，来自t01组的17头猪的肺也得分为阳性，10头猪得分为1(轻度病变)，且7头猪得分为2(中度病变)。

在攻击后期间，在攻击后第7天用ti进行疫苗接种的猪的直肠温度显著更低。到那时，20％的t01猪发烧，而t02组中没有一头猪发烧。在攻击前，与t01相比，t02组中的直肠温度也显著更低。然而，没有一头猪发烧，并且该组中没有可能诱导直肠温度增加的明显的临床情况。除了直肠温度增加外，在整个时间段内在所有猪中都没有观察到与prrs相容的其他临床观察(抑郁、呼吸窘迫、咳嗽或打喷嚏)。此外，在组之间在任何时间点都没有检测到体重差异。

血清学数据证明用ti进行疫苗接种(t02组)在疫苗接种后4周内诱导prrsv特异性抗体的发展。t02组中的抗体滴度增加，直至研究结束，并且显著高于在未接种疫苗的攻击组t01中在那时检测到的滴度。

对14-15天龄猪单次肌内施用含有2.0log10ccid50剂量的实验性euprrsvmlv疫苗进行疫苗接种免于受到prrsv影响，如在疫苗接种后4周用致病性euprrsv病毒株攻击后在血清中检测到的病毒载量显著降低所看到的。功效还通过对尸体剖检时(攻击后10天)肺病变的百分比观察到的保护性作用、口腔和鼻脱落减少以及攻击后7天直肠温度降低来支持。

实施例5-评估母源抗体对施用到1天龄血清反应阳性猪的修饰的活euprrsv疫苗对抗欧洲prrsv分离株攻击的功效的潜在作用的评估

本研究的目的是评价母源抗体(mda)在通过肌内途径(im，组t02)或鼻内途径(in，组t03)施用到1天龄仔猪时对euprrsmlv(由seqidno:5表达的病毒)的功效的影响。

该研究是根据ema/cvmp/wp/439467/2007“关于证明母源抗体对幼小动物中疫苗功效的可能影响的反思论文(reflectionpaperonthedemonstrationofapossibleimpactofmaternallyderivedantibodiesonvaccineefficacyinyounganimals)”和欧洲药典(europeanpharmacopoeia,ph.eur.)monograph04/2008:50207:“兽用疫苗和免疫血清的功效的评价(evaluationofefficacyofveterinaryvaccinesandimmunosera)”的建议设计的。两份文件都建议必须充分评价被动获得且母源的抗体对疫苗功效的影响。此外，ema/cvmp/wp/439467/2007陈述，尽管存在正常的生物学变异，但在存在mda的情况下进行疫苗接种的动物中疫苗的功效应与相同年龄但在不存在mda情况下进行疫苗接种的动物中获得的功效相似。

基于上述说明书，在1天龄时接种疫苗(im和in途径)的血清反应阳性猪中在用致病性基因型iprrsv分离株作为呼吸攻击进行接种后评价修饰的活euprrsv疫苗的保护性免疫起始(ooi)。当通过对照组(t01)中的血清中和测试(snt)检测到的mda水平变得不可检测时，对动物进行攻击。为了证明对抗攻击的保护作用，评价在血清反应阴性动物中执行的先前研究中评价的相同参数(血清中的病毒载量、肺病变、直肠温度、脱落、临床征象和体重)。

该测试是有效的，因为在整个疫苗接种期所有对照猪(t01组)都保持prrsv病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。

当通过im途径施用euprrsmlv时，观察到疫苗接种的保护性作用，如通过与对照组相比血清中的病毒载量显著降低所看到的；功效还通过鼻和口腔脱落显著减少以及直肠温度显著降低来支持。肺病变的平均百分比差异接近显著(p＝0.092)。在本研究中im施用后观察到的功效类似于先前研究中获得的功效，其中所述功效在血清反应阴性动物中评价；在两项研究中，在主要变量(病毒血症减少)方面观察到疫苗接种的显著影响，并且还通过鼻脱落减少和直肠温度降低来支持。

当通过in途径施用euprrsmlv时，未实现对prrsv攻击的保护作用，如通过评价的任何参数缺乏显著差异所看到的。

总之，本研究的结果证明，当在1天龄仔猪中肌内施用疫苗时，缺乏母源抗体对疫苗功效的干扰。然而，当疫苗通过in途径施用时，疫苗接种后大多数猪没有产生免疫反应，可能是由于疫苗被mda中和。为了产生prrsvmda阳性仔猪，在妊娠的前半段(妊娠45天)期间，用euprrsmlv疫苗批次vmrd13-015(5log10ccid50/2ml)对6头妊娠大母猪进行疫苗接种。在预计的分娩日期前一天，通过肌内注射氯前列醇(porcino,virbac)诱导分娩。所有大母猪都在第二天分娩。所有大母猪在第0天都对prrs呈血清反应阳性。显示结果。

疫苗病毒以6.0log10ccid50/ml的效价提供。在第0天，用疫苗稀释剂(批次t22019)稀释ivp以匹配目标滴度(2.5log10ccid50/2ml)。收集一等份的ivp以在bhk-21-c12-26细胞上滴定以确认剂量。将额外的ivp样品冷冻(-80±10℃)并作为保留样品储存。遵循当地标准工序执行bhk-21-c12-26细胞上的滴定。重构并稀释的疫苗的滴度为101.8ccid50/ml，其对应于102.1ccid50/2ml(2.1log10ccid50/2ml)

在第0天，如第4部分所述，用ivp或cp对仔猪进行疫苗接种。t01和t02组的仔猪在颈部右侧经肌内注射。t01和t03组的仔猪经鼻内施用，在每个鼻孔中递送1.0ml。攻击材料是在猪肺泡巨噬细胞(pam)中生长的基因型1西班牙prrsv分离株olot/91。该病毒株在1991年从大母猪中的晚期流产病例中分离。

病毒血症

在疫苗接种之前(d0)，发现所有猪在血清中都是rt-qpcrprrsv阴性的，并且来自t01组的所有猪都保持rt-qpcrprrsv阴性，直至攻击。相反，来自t02组(im接种疫苗)的8/16(50％)仔猪和来自t03组(in接种疫苗)的1/19(5.3％)仔猪在攻击时(接种后67天)为rt-qpcrprrsv阳性。

攻击后，来自t01组的100％的猪在d70(攻击后3天)患上病毒血症并且保持阳性，直至研究结束(dc+10)。在接种疫苗组(t02和t03)中，所有猪至少一次被检测到prrsv阳性；然而，到研究结束时(dc+10)，只有11/16t02猪(68.8％)仍然患病毒血症。相比之下，除一头猪外的所有t03猪在攻击后的所有采样点都是阳性的。

在攻击后的所有采样日，来自t02组的猪在血清中的病毒载量显著低于来自t01对照组的猪。在dc+3和dc+10，t02组中的病毒载量也显著低于t03组。在t01组和t03组之间未检测到显著差异。

表7汇总攻击期后10天期间的病毒血症结果。

表17.根据组和研究日的病毒血症结果(攻击后数据)的汇总

n：数量；se：标准误差；cb：置信界限；d＝研究日；dc：挑战日；dn：尸体剖检日；rt-qpcr阳性：>1.7log10rna拷贝/ml

病毒血症和脱落

在统计分析之前，使用适当的对数变换来变换rt-qpcr数据。使用一般线性重复测量的混合模型分析变换的数据。如果治疗或治疗-时间点相互作用效应是显著的(p≤0.05)，则在每个时间点进行成对治疗比较。治疗最小二乘平均值和95％置信区间被反向变换以进行呈现。还计算了病毒血症/脱落天数百分比。如果>50个prrsvrna拷贝/ml，其对应于该技术的检测限(100个prrsvrna拷贝/ml)的一半，则确定每个样品为阳性。还确定了动物对于天数≤dc(是指攻击前)和天数>dc(攻击后)是否曾患病毒血症或曾经是脱落的。

本研究的目的是评价当在1天龄仔猪中通过肌内途径(im，组t02)或鼻内途径(in，组t03)施用时母源抗体(mda)对euprrsmlv功效的影响。在1天龄接种疫苗的血清反应阳性猪中在用致病性基因型iprrsv分离株作为呼吸攻击接种后评价功效。当t01组中通过snt检测到的mda水平变得不可检测时(第67天)，对动物进行攻击。

确定功效的主要变量是与t01猪相比治疗组t02和t03的血清病毒载量(病毒血症)。将肺病变、直肠温度、脱落、临床征象和体重作为次要变量进行比较。

该测试是有效的，因为在整个疫苗接种期所有t01猪都保持prrsv病毒阴性并且没有检测到混杂的疾病因子。

当比较t01组和t02组之间血清中的病毒载量时，观察到im疫苗接种的保护性作用；在攻击后的所有采样日，与对照组t01相比，通过im途径用ivp进行疫苗接种的组具有显著更低的病毒滴度。在t01组和t03组之间未检测到病毒滴度的差异，指示in疫苗接种对攻击后的病毒载量没有保护性作用。t03组中功效的缺乏也通过在攻击后3天和10天与t02组相比在该组中观察到显著更高的病毒载量来证明。

im疫苗接种(t02组)后赋予的保护性作用通过关于对照组t01而言在t02组中鼻脱落者百分比显著降低以及鼻和口腔分泌物中检测到的病毒量的显著降低来支持。与对于病毒血症观察到的相似，当通过in途径(t03组)施用ivp时，在病毒脱落方面未观察到疫苗接种的积极作用，因为在t01组和t03组之间未检测到差异。事实上，在t03组中检测到的经鼻和口腔途径脱落的病毒量也显著高于t02。

通过im途径进行的疫苗接种对直肠温度也具有积极影响。在攻击前(d67)，与t01和t03相比，t02组的平均直肠温度显著降低；然而，由于当时来自任何组的猪都没有发烧(rt≥40.5)，并且在将动物混合用于攻击阶段之前收集d67的直肠温度，可以得出结论，这些差异可能归因于最初评价的动物的压力。在攻击后期间，t01、t02和t03组中发烧至少一次的猪的百分比分别为61％、31％和42％。对照猪(t01)的直肠温度显著高于第70天(攻击后3天)用ivp进行疫苗接种的猪(t02和t03组)；然而，在dc+10时，t03组的直肠温度显著高于t01和t02组。除了直肠温度增加外，没有观察到与prrsv感染相容的其他临床征象。关于体重，没有观察到疫苗接种的作用，如组之间缺乏显著差异所看到的。

在尸体剖检时，来自对照组t01的13/18头猪(72％)具有阳性肺视觉分数。在t02和t03组中，7/16(44％)和13/19(68％)猪也得分为阳性。治疗组之间的比较显示病变肺的百分比没有显著差异。然而，在对照组t01和通过im途径用ivp进行疫苗接种的组(t02)之间观察到的差异接近显著(p＝0.092)。

如通过elisa测量(s/p比≥0.4)，所有猪在疫苗接种之前都存在prrsv特异性抗体，因此符合纳入标准。在攻击前(接种后67天)，对照组中39％的猪仍然是血清反应阳性，指示当时存在剩余的mda(平均s/p比：0.279)。然而，来自对照组的所有猪在攻击后发生病毒血症并且13/18在尸体剖检时也具有阳性肺分数的事实指示通过elisa检测的剩余mda不干扰攻击。事实上，当通过snt确定那些猪中的prrsv特异性中和抗体的水平时，在攻击前(第52天)在所有t01猪中检测到阴性结果。在通过im途径用ivp进行疫苗接种的组中，9/16猪从疫苗接种日到接种后67天经历了通过elisa检测到的抗体水平增加，并且所有这些在攻击前都是血清反应阳性的(平均s/p比：1.803)，指示即使面对mda，im疫苗接种后抗体反应也会发展。相比之下，只有2/19头通过in途径用ivp进行疫苗接种的猪从疫苗接种到攻击具有prrs抗体增加，并且仅32％在d67是血清反应阳性(平均s/p比：0.328)，这指示由于疫苗被mda中和，其他17头猪中没有诱导体液免疫反应。攻击后(d77)，所有猪，无论是否是治疗组，均为血清反应阳性，并且没有检测到组间elisa滴度的显著差异。

ema/cvmp/wp/439467/2007指南“关于证明母源抗体对幼小动物中疫苗功效的可能影响的反思论文”陈述，尽管存在正常的生物学变异，但在存在mda的情况下进行疫苗接种的动物中疫苗的功效应与相同年龄但在不存在mda情况下进行疫苗接种的动物中获得的功效相似。基于这些说明，本研究中观察到的功效应与先前研究(c/394/13)中获得的功效相似，其中ooi在1天龄通过in和im途径接种疫苗的血清反应阴性动物中进行评价。

当通过im途径施用euprrsmlv时，无论猪的血清学状态如何，都可以证明其功效，因为在两项研究中均观察到病毒血症(主要变量)的显著降低。在两种情况下，还证明了im疫苗接种对鼻脱落和直肠温度的保护性作用。此外，在mda+猪的im疫苗接种后，口腔脱落也显著减少，并且病变肺的百分比差异接近显著。总之，当通过im途径在1天龄仔猪中施用疫苗时，这些数据清楚地证明缺乏mda对疫苗功效的干扰。

当通过in途径施用euprrsmlv时，仅在没有mda的情况下才能证明功效，如在血清反应阴性动物中观察到的病毒血症和鼻脱落的显著减少所看到的。在mda+猪中，in疫苗接种没有诱导保护作用，如通过评价的任何参数缺乏显著差异所看到的。

因此，通过im途径单次施用含有2.5log10ccid50剂量的euprrsmlv疫苗到1天龄血清反应阳性猪的疫苗接种赋予对抗prrsv的保护作用，如在疫苗接种后67天(9.6周)用致病性euprrsv病毒株攻击后在血清中检测到的病毒载量显著降低所看到的。功效还在攻击后鼻和口腔脱落以及直肠温度的显著降低来支持。此外，肺病变的平均百分比差异接近显著(p＝0.09)。通过in途径单次施用含有2.5log10ccid50剂量的euprrsvmlv疫苗至1天龄血清反应阳性猪的疫苗接种对prrsv攻击没有保护作用。本研究的结果证明，当疫苗在1天龄肌内施用时，缺乏母源抗体对疫苗功效的干扰。当通过in途径施用疫苗时，如通过elisa测量，大多数猪(17/19)在疫苗接种后未能产生免疫反应。这指示疫苗被mda中和，这可能会折衷畜群水平的疫苗功效。

实施例6-施用一次剂量、重复剂量和过量的修饰的活euprrsv疫苗96v198克隆1msv+3至1天龄猪的散布、传播和安全性

本研究的目的是评价重复剂量和过量的安全性，以及通过im和in途径在1天龄猪中施用一剂修饰的活prrsv疫苗96v198克隆1的散布、传播和安全性。使用msv+3进行测试，msv+3是一批疫苗中存在的最低减毒传代水平(参见第8页，msv+5是标准第49代)。

根据现行的欧洲立法，必须证明疫苗的安全性以获得上市许可。在这种情况下，该协议的制定考虑了欧洲药典；指导性2009/9/ec和vichgl44指南，以证明在1天龄仔猪中通过in和im途径(疫苗预期的建议途径和动物类别)施用的一剂、重复剂量和过量的安全性。

根据欧洲药典对兽用疫苗的建议评价安全性，即：直肠温度的评估，以及至少直至接种后14天的局部和全身反应。从接种疫苗(一剂)到未接种疫苗的哨兵猪评价疫苗株的传播；还研究了接种疫苗的动物(一剂)的脱落(鼻粘液、口腔液和粪便)和组织中的散布。

该研究遵循良好实验室规范(glp)规定，根据相应的ocde指南并符合欧洲药典7.704/2013:50206(兽医疫苗和免疫血清的安全性评价)的要求进行。

测试产品是euprrsmlv(96v198克隆1)，最低减毒传代水平msv+3)，最大释放滴度为105.2tcid50/2ml，2lin或im剂量，其中较低传代(较低程度减毒)被选为更好的安全量度。对于测试系统，该协议的制定考虑了欧洲药典；指导性2009/9/ec和vichgl44指南，以证明在1天龄仔猪中通过in和im途径(疫苗预期的建议动物类别)施用的一剂、重复剂量和过量的安全性。

使用足够数量的大母猪(n＝11)来获得进行研究所需的仔猪(至少，n＝80)。应用设计允许适当描述对于两种途径im和in而言疫苗的安全性、散布和脱落。大母猪从prrsv阴性农场到达实验农场(附件i)。大母猪位于设施中的11个隔离箱中。在实验农场，大母猪在分娩前放血，并使用商业elisa再次分析prrsv特异性抗体的存在(prrsx3ab测试：参考99-4095,idexxlaboratories)(附件i)。im施用头孢噻呋钠(13ml/大母猪；对大母猪进行预防性治疗。

在授精后约111-113天施用1mlim的d-氯前列醇(galapan,invesa)(附件xvi)，使大母猪的分娩同步(分娩同步)。仔猪在接着的40小时内(4月9日和10日)出生。疫苗接种开始于10日；在此日期，所有仔猪的年龄约≤24小时(1天龄)。

在分娩后第一天内(疫苗接种前)执行交叉寄养以平衡窝并使窝均化。最后，使用10头大母猪，每组中仔猪的总数等于或高于进行欧洲药典中确立的安全性研究的最小样品量。总数：80头仔猪；每种途径：in和im，40头仔猪(28头用实验产品进行疫苗接种-单剂量、重复剂量和过量-，8只动物作为对照，并且4只动物作为哨兵)。

还有额外30头仔猪作为储备分配在t01至t12的所有组中，只有当一些组由于仔猪死亡或排除而没有达到所需的最小仔猪数时才被纳入研究(附件ii和附件xiv；修正案n°2)；这些仔猪的原始数据记录在标有(s)的原始数据笔记本(13至24号笔记本)中。最后，使用10头大母猪，并且每头大母猪供养11头仔猪。

实验假设

本研究设计成通过与用疫苗稀释剂接种的对照组(阴性对照)相比较，在实验条件下对于所有下面描述的参数证明疫苗euprrsmlv在1天龄猪(96v198克隆1)中的安全性，但考虑到疫苗接种前每头仔猪的基础温度作为对照值来分析温度。如果没有观察到可归因于疫苗的原因的严重局部或全身反应，并且接种疫苗组中所有猪的平均温度升高与疫苗接种前的基础平均温度相比不超过1,5℃，而且实验组中的仔猪都没有显示出与疫苗接种前每个仔猪基础温度相比温度升高超过2℃，则认为疫苗则是安全的。评价疫苗病毒株的传播和散布，研究哨兵猪中疫苗病毒株的存在。评价接种疫苗的动物的散布，研究血液、鼻、口腔和直肠样品中以及组织中的病毒量。

直肠温度-鼻内和肌内途径。

关于温度，可以得出结论，疫苗在所有评价的协议(途径、滴度和剂量数)方面都是安全的，因为所获得的结果实现了欧洲药典对兽用疫苗的建议。

局部反应

鼻内途径。没有观察到局部反应。

肌内途径。

在尸体剖检时，t12中仅有两头仔猪(im途径的最大滴度)具有肉眼可见的轻度病变。在显微镜下，仅在组t10的四头猪中观察到病变；病变的特征在于非常轻微的局灶性或多灶性存在单核炎性细胞浸润。

全身反应和不良事件

鼻内途径：缺乏与疫苗接种相关的全身反应和临床征象指出疫苗是安全的。

肌内途径。

通过im途径仅在属于接受最高滴度(×10最大释放滴度)的组(组t12)的8头仔猪中的2头中观察到疫苗施用后的不良事件。这些事件在4小时前消失，并且仔猪完全恢复。关于临床日常评价，跛行病例不能被视为与疫苗施用相关的现象；在对照组的仔猪中也观察到跛行。在研究期间观察到的超出单独死亡的原因是由于压伤；因此，应该认为这种死亡与疫苗施用无关。总之，通过im途径施用的疫苗病毒株96v198克隆1应被认为是完全安全的，除了针对最高滴度(×10)描述的不良事件之外。

体重

鼻内途径。

当比较体重增加的平均值时，从第0天到第14天，t07显示低于相应对照(t02)的值(p<0.05)。然而，当比较第14天到第28天的体重增加时，并且尤其是当考虑到第0天到第28天的所有研究时，这种差异消失了。因此，通过鼻内途径接种疫苗的仔猪的体重增加不受影响，与接受的剂量无关。

肌内途径。

以相同的方式，从第0天到第14天，t11显示出低于相应对照(t04)的值(p<0.05)。当分析第14天到第28天的时期时，这种差异消失，但是从第0天到第28天，其再次出现在所有研究中。这些差异可以得到解释，因为来自t11的三头仔猪的体重增加是包括在第28天尸体剖检的所有仔猪(与产品、滴度或施用途径无关)(这意指t02、t04、t07和t11)中最低的。从第0天到第28天的所有个体体重增加等于或高于5.5kg，除了上述三头仔猪(对于n°199、202和205仔猪体重增加分别是4.08kg、2.89kg和3.05kg)。有趣的是，这些仔猪遭受最长时间的跛足。总之，如果在t04和t11之间观察到的差异，则无法区分体重增加是由于跛行事件还是疫苗接种。

散布

鼻内和肌内途径。在接种疫苗的动物中评价的几乎所有组织中疫苗病毒株的存在证明了病毒的散布，这与所用的途径无关。病毒株96v198克隆1在肺、扁桃体和气管支气管淋巴结中以及在脾和肠系膜淋巴结中以可以被认为高的滴度存在表明疫苗病毒株的完全有机散布。

传播

鼻内和肌内途径。虽然口腔液和直肠拭子中疫苗病毒株的检测结果自接种疫苗的仔猪多变，但鼻拭子中的检测结果不变且高；疫苗病毒株检测的频率分布随时间下降。这些结果与来自所有哨兵猪的血液样品中的疫苗病毒株的检测结果一起证明96v198克隆1在疫苗接种后早期活跃且连续地脱落。此外，疫苗病毒株在来自哨兵仔猪的组织和血液样品中的存在指出从接种疫苗的仔猪传播的病毒是活跃的；其可以感染哨兵动物，并且其可以在哨兵动物中复制；甚至来自t09的一头im哨兵猪具有与prrs相容的肺病变加上ihc的阳性结果。总之，上述结果指示96v198克隆1至少在疫苗接种后的早期阶段可以从接种疫苗的仔猪一致地传输到未接种疫苗的仔猪。

肺病变

鼻内和肌内途径。所有9头具有与prrs相容的宏观和微观病变(间质性肺炎)加上prrsvihc的阳性结果的猪都来自im组。因此，可以得出结论，in途径是安全的，而im途径可以至少在每组(t09到t12)的一头猪中诱导与prrsv相容的肺病变。

实施例7-在施用到prrsv血清反应阳性妊娠大母猪时重复施用单剂量的修饰的活euprrsv疫苗的安全性

本研究经设计以证明在妊娠后半期(妊娠87天)在血清反应阳性大母猪中施用重复单剂量的euprrsmlv的安全性。在第一次施用或第二次施用后未观察到疫苗接种后的全身反应。此外，在整个观察期内在所有大母猪中都没有记录临床观察。

关于直肠温度，在疫苗接种后的任何时间，大母猪都没有显示发烧(rt≥40.1℃)。此外，疫苗接种后的平均直肠温度不超过疫苗接种前的平均直肠温度加1.5℃，并且没有一头大母猪超过疫苗接种前其自身的直肠温度加2℃。

在第1次施用和第2次施用时，分别在63％和50％用测试项目接种疫苗的大母猪中观察到注射点的局部反应。反应由可触知和/或可见的肿胀(直径0.4cm至2.8cm)组成，其在1至6天内消失。在任何施用后，没有一头大母猪显示出泛红，局部热量增加或注射点疼痛。

关于繁殖性能，没有记录堕胎或过早分娩。此外，没有观察到疫苗接种明显影响死产、木乃伊、低活力仔猪的数量和断奶前死亡率。疫苗接种没有诱导经胎盘感染，如在出生时和仔猪断奶时收集的血清样品中检测到的rt-qpcr阴性结果所看到的。总之，在妊娠后半期在血清反应阳性大母猪中重复施用疫苗是安全的。

这里使用的缩写包括：bhk-21，小仓鼠肾脏克隆21；brp，分批释放协议；ccid50，细胞培养感染剂量50％；cp，对照产品；d，天；drac，每日复查动物护理；id，鉴定；glp，良好实验室规范；if，免疫荧光；iv，静脉；mlv，修饰的活疫苗；msv，主种子病毒；na，不适用；p，传代；pbs，磷酸盐缓冲盐水；pi，疫苗接种后；prrsv，猪繁殖与呼吸综合症病毒；rt，直肠温度；rt-qpcr，定量逆转录聚合酶链反应；sop，标准操作工序；s/p，样品阳性比；tbd，待定；ti，测试项目；和vich，兽医国际协调会议。

研究目标和理由

euprrsv修饰活疫苗(mlv)旨在用于prrs污染环境中小母猪和大母猪的主动免疫，以减少由欧洲prrs病毒株感染引起的病毒血症、经胎盘感染和流产。根据现行法律，必须证明疫苗的安全性以获得上市许可。本研究根据欧洲药典7.7:04/2013/50206-兽医疫苗和免疫血清的安全性评价-以及vichgl44-兽医活疫苗和灭活疫苗的目标动物安全性-指南设计。本研究的目的是评价euprrsmlv在妊娠后半期血清反应阳性大母猪中重复施用(1x+1x)的安全性。测试的材料是6.6log10ccid50/小瓶euprrsv，96v198c1病毒株，(msv+3)，剂量为5.2log10ccid50，2ml/肌内。rtqpcr

通过遵循标准工序执行的逆转录(rt)qpcr测量病毒血症(血清中的prrsv载量)。简而言之，将纯化的病毒rna用作模板，在50℃下逆转录30分钟，并在95℃下变性5分钟。反应的pcr程序由在95℃下变性20秒和在53℃下退火40秒的40个循环组成。qrt-pcr在7500实时pcr系统热循环仪中进行。

引物和探针的序列如下(seqidnos6-8，连续)：

正向引物(莱利斯塔德f)：5'-gcaccacctcacccagac-3'(终浓度为0.5μm)。

反向引物(莱利斯塔德r)：5'-cagttcctgcgccttgat-3'(终浓度为0.5μm)。

探针(莱利斯塔德s)：5’-6-fam-cctctgcttgcaatcgatccagac–tamra-3’(终浓度为0.6μm)。

血清学

遵循制造商的说明，使用idexxprrsx3elisa针对抗prrsv的抗体测试疫苗接种前收集的大母猪血清。简而言之，将血清样品在涂有重组prrsv抗原的96孔板中以1:40稀释，并在18-26℃下温育30分钟。洗涤后，添加抗猪辣根过氧化物酶缀合物，并且将板在18-26℃下再温育30分钟。洗去未结合的缀合物并将tmb底物添加到孔中。在650nm下测量显色。记录每个样品的s/p值。如果s/p比≥0.4，则将样品归类为prrs抗体阳性。如果s/p比<0.4，则将样品归类为阴性。elisa说明包括在研究文件中。

临床观察

在疫苗接种后期(d0到d28)，没有记录任何大母猪的异常临床观察。

直肠温度

疫苗接种前和在接下来的4天内每组收集的平均直肠温度(rt)显示为错误！没有找到参考源。并且错误！没有找到参考源。直肠温度的个别数据显示为错误！没有找到参考源。

为了研究直肠温度，遵循两个标准：

a)整个组疫苗接种后的平均直肠温度不应超过疫苗接种前的平均直肠温度加1.5℃。

第一次疫苗接种：疫苗接种后平均直肠温度(d0+4h、d1、d2、d3或d4)≤[疫苗接种前平均直肠温度(平均d-1/d0)]+1.5℃

第二次疫苗接种：疫苗接种后平均直肠温度(d14+4h、d15、d16、d17或d18)≤[疫苗接种前平均直肠温度(平均d13/d14)]+1.5℃

b)每头大母猪疫苗接种后的个体直肠直肠温度不应超过疫苗接种前的直肠温度(疫苗接种前)加2℃。

第一次疫苗接种：疫苗接种后的个体直肠温度(d0+4h、d1、d2、d3或d4)≤[疫苗接种前的个体直肠温度(个体平均值d-1/d0)]+2.0℃

第二次疫苗接种：疫苗接种后的个体直肠温度(d14+4h、d15、d16、d17或d18)≤[疫苗接种前的个体直肠温度(个体平均值d13/d14)]+2.0℃

在t01和t02组中，疫苗接种后的平均rt不超过疫苗接种前的平均值加1.5℃。此外，在t01或t02组的所有大母猪中，每头大母猪的疫苗接种后rt均不超过同一大母猪在疫苗接种前的直肠温度加2℃。第一次施用后，t01组中rt增加最大值为0.81℃(第2天)，并且t02组中rt增加最大值为0.76℃(第0天+4h)。第二次施用后，在第17天在t01组(0.81℃)和t02组(0.47℃)中都观察到最大增加。在疫苗接种后的任何时间点，来自t01或t02组的大母猪中没有一头显示出直肠温度升高(≥40.1℃)。

疫苗接种后的全身反应

在来自t01或t02组的所有大母猪中都没有观察到疫苗接种后的全身反应。

注射部位的局部反应

在疫苗接种之前，检查所有大母猪颈部区域是否存在局部反应，这些反应可能是由可能干扰注射部位的局部反应的评价的先前接种引起的。三头大母猪，其中两头来自t01组(1802和2259)，一头来自t02(1663)，由于先前的接种而在右颈部显示出旧的反应。然而，所有这些反应都位于下方，并且远离各自的接种点。当在第二次疫苗接种之前检查左颈部时，在四头大母猪中也观察到旧的反应，两头来自t01组(316和1802)，两头来自t02组(2547和2842)。如对于右颈部所观察到的，这些反应位于接种点下方。在所有情况下(对于右颈部和左颈部)，认为旧的反应都不会潜在地干扰疫苗接种后局部反应的评价。用cp进行疫苗接种的大母猪(t01组)中没有一头在疫苗接种后的任何时间点在注射部位显示出局部反应。在t02组中疫苗接种后观察到的局部反应汇总在17中。

在第一次疫苗接种后，63％的t02大母猪(5/8)在右颈部的注射部位显示出可见和/或可触知的肿胀。观察到的最大溶胀是持续6天的直径2.8cm的反应(对应于3分)。没有一头大母猪显示出泛红，局部热量增加或注射点疼痛。

在第二次疫苗接种后，在50％的t02大母猪(4/8)中观察到可见且可触知的肿胀(左颈部)。所有观察到的反应都被评分为1或2(最大直径1cm)，并持续最多5天。如在第一次疫苗接种后观察到的，没有一头大母猪显示出泛红，局部热量增加或注射点疼痛。

表18.t02组中局部反应的汇总

注射部位的尸体检查

在宏观检查中，观察到来自两组的几头大母猪在颈部肌肉中具有病变，主要由多个干酪样坏死物结节组成，这些结节散在整个颈部区域中。这些病变归因于旧的注射，因为它们在注射点并未被检测到。

当检查t02大母猪的接种点时，1/8在右颈部呈现可见的反应，而3/8在左颈部呈现可见的反应。在t01组中，一头大母猪(1/7)在第一个接种点(右颈部)也显示出可见的反应。所有反应都被描述为存在苍白肌纤维，在大多数情况下明显跟随针迹并且不可测量。此外，在两头t02大母猪中观察到多个结节(左接种点)。

繁殖性能

所有治疗组中均未记录堕胎或过早分娩。t01组的妊娠期长度介于114天和117天之间，且t02组的妊娠期长度介于114天和119之间。对每头大母猪健康生出的仔猪用耳标进行识别，并用供养。

在本研究中，在妊娠后半期(妊娠87天)在血清反应阳性大母猪中评价重复施用单剂量euprrsmlv的安全性。安全性参数包括对疫苗接种的全身反应、疫苗接种后的直肠温度、临床观察、注射部位的局部反应、繁殖性能和注射部位的尸体检查。

在第一次施用或第二次施用后未观察到疫苗接种后的全身反应。此外，在整个研究中对于所有大母猪都没有记录一般临床观察。

在第1次疫苗接种和第2次疫苗接种时，分别在63％和50％的t02大母猪中观察到注射点的局部反应。第一次疫苗接种后，观察到的最大肿胀是直径为2.8cm的反应，其持续最多6天。第二次疫苗接种后，最大肿胀的直径为1cm，且其最长持续时间为5天。在任何施用后，没有一头大母猪显示出泛红，局部热量增加或注射点疼痛。

在尸体检查时，仅在3/8接种疫苗的大母猪中观察到接种点的可见反应。其中两头(15和1663)对应于局部反应评价时给出的最高肿胀分数(分别为2和3)；在宏观上，病变被描述为跟随针迹的苍白肌纤维，其被诊断为伴有涉及肌纤维的中度肉芽肿性肌炎。在大母猪15的情况下，在病变内观察到疫苗滴，这支持该病变由于施用测试项目而诱发的事实。对于显示出可见反应的其他t02大母猪(2547)，病变也被描述为跟随针迹的苍白肌纤维，但在这种情况下也具有包含干酪样坏死物的多个结节。在组织病理学分析中，该病变被诊断为存在局灶性但广泛性的坏死的严重肉芽肿性肌炎。由于在8/8t02和5/7t01大母猪中也观察到颈部区域存在多个结节，而不是具体地在接种点处，因此在大母猪2547中观察到的病变可能是由先前的注射引起的，而不是由测试项目引起的。这将得到以下事实的支持：在局部反应的体内评价期间，该大母猪仅具有持续5天的直径<0.5cm的肿胀。

prrsv相关的繁殖病症的特征在于早产分娩、晚期流产、死产或低活力仔猪和木乃伊化胎儿增加。在本研究中，没有记录堕胎或过早分娩。此外，没有观察到疫苗接种明显影响死产、木乃伊或低活力仔猪的数量。prrsv感染也可能增加断奶前的死亡率。在本研究中，t01和t02组断奶前死亡率的平均％分别为6.0和5.3，指示疫苗接种对仔猪存活率没有影响。

最后，由t01和t02大母猪生出的仔猪在出生时或断奶时收集的所有血清样品根据rt-qpcr是prrsv阴性的，指示疫苗接种后缺乏经胎盘感染。

因此，在妊娠87天对prrsv血清反应阳性大母猪施用重复单剂量的euprrsvmlv：未引起异常全身反应(过敏性休克、呕吐)；在疫苗接种后14天内没有诱导任何临床观察；疫苗接种后没有诱导异常直肠温度；在第1次疫苗接种和第2次疫苗接种后分别有63％和50％的大母猪在注射部位引起局部反应，其中此类反应由可触知和/或可见的肿胀(直径0.4cm至2.8cm)组成，在1至6天内消失；对繁殖参数没有影响；并且没有引起经胎盘感染。

序列表

<110>zoetisservicesllc

calvert,jaygregory

balasch,monica

fort,maria

pearce,douglass.

keith,marcial.

<120>断奶前对抗欧洲猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒株的有效疫苗接种

<130>zp000148apct

<150>62/434,144

<151>2016-12-14

<160>8

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>15092

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>prrs病毒分离株96v198-第0代

<400>1

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