发明领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及针对癌糖肽的单克隆和人源化抗体或其功能片段，和它们的用途。
发明背景
癌细胞表达作为免疫抑制性生物大分子的异常糖缀合物以破坏免疫监视(图1)。异常的糖基化肿瘤粘蛋白，例如muc1，结合bax和激活抗-细胞凋亡途径[1-2]。此外，muc1聚糖结合淋巴细胞的信号转导分子半乳凝素-9，和抑制天然杀伤细胞的细胞毒性功能[3-4]。muc1是在肺癌中最高表达的粘蛋白，其在肺癌(小细胞肺癌和nsclc)的治疗中已得到广泛研究。我们之前的研究，包括在212例肺癌中糖蛋白的mrna表达概况的分析，证实了muc1是免疫疗法的首选靶标[5]。其他人的之前研究还发现，携带tn和唾液酸tn糖残基的muc1蛋白由乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌和其它癌症类型表达[6-9]。
产生针对muc1糖肽的高度特异性抗体一直是一种挑战。聚糖由于其高亲水性和缺少电荷导致免疫原性差。糖肽的肽部分的免疫原性远高于其聚糖部分。因此，可识别肽和聚糖部分二者的抗体是罕见的。lakshminarayanan等人发现，来自由糖肽免疫的小鼠的90％的抗体可被所述糖肽的合成肽部分抑制。换句话说，由糖肽疫苗诱导的90％的抗体结合活性涉及肽部分[10]。
muc1已作为免疫疗法的靶标数十年。针对muc1产生的大多数抗体由没有聚糖修饰的包含muc1的串联重复结构域的合成肽诱导。在i和ii期临床试验中发现这些抗体是安全的[11]。然而，未观察到明显的临床益处。认为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性不足以消除患者的肿瘤。抗体-药物缀合物、嵌合抗原受体(car)转导的t细胞，已被报道以数种形式的muc1肽或糖肽为靶标。由sanofi开发的huds6-dm4识别muc1上的肿瘤相关唾液酸糖表位，尽管准确的表位序列仍不清楚(12)。5e5，一种结合galnac(tn)修饰的60聚体串联重复序列的单克隆抗体(13,14)，当使用其vl和vh区来设计嵌合抗原受体用于t细胞疗法时，已表明在治疗实体瘤(胰腺癌)中大有前景(15)。
对于具有治疗价值的抗-糖肽抗体，它们必须具有高特异性以识别肿瘤，但不识别健康组织。尽管已知肿瘤组织表达独特的聚糖结构例如tn抗原(galnac)、唾液酸tn抗原(neuacalpha2,6galnac)，但聚糖结构免疫原性差，并且不能诱导具有高亲和力的抗体。为了获得可识别聚糖和多肽二者的糖肽特异性抗体，我们已经筛选了由肿瘤细胞免疫的小鼠，和选择与未糖基化对照肽相比对糖肽具有较高血清抗体反应的那些少数小鼠，和产生对糖肽具有特异性的单克隆抗体。
鼠抗体必须经人源化以用于治疗用途，例如抗体-药物、car(嵌合抗原受体)t-细胞疗法、基于抗体的体内诊断试剂等。cdr(互补决定区)移植是识别抗原和决定抗体特异性的可变区的小鼠cdr的移植。通过移植小鼠单克隆抗体的cdr至人抗体的可变区并置换人抗体的cdr，将获得人抗体与特定抗原的结合，和减少其在人中的免疫原性。
因此，本发明人设计了对于鼠16a的cvl基因和cvh基因的人源化轻链hvl1和hvl2序列以及人源化重链hvh1、hvh2、hvh3、hvh4、hvh5序列。人源化抗体通过产生融合亲本抗体序列的选择部分与人框架序列的多重杂合序列来设计。使用3d模型，这些人源化序列通过目测和计算机建模进行方法学分析，以分离最可能保留抗原结合的序列[16]。目的是在最终的人源化抗体中使人序列的量最大化，同时保留原始的抗体特异性。
发明简述
本发明的目标包括提供针对癌糖肽的人源化和单克隆抗体或其功能片段，和它们的用途。
在本发明的第一方面，提供了人源化抗体或其功能片段，其中人源化抗体识别癌细胞表面上的muc1糖肽表位rpapgs(galnac)tappahg。
人源化抗体优选地是单克隆的。
在优选的实施方案中，人源化抗体或其功能片段包含：重链序列包含具有cdrh1、cdrh2和cdrh3的可变区，和cdrh1包含seqidno:28显示的氨基酸序列，cdrh2包含seqidnos:29显示的氨基酸序列，和cdrh3包含seqidno:30显示的氨基酸序列；和
轻链序列包含具有cdrl1、cdrl2和cdrl3的可变区，和cdrl1包含seqidno:31显示的氨基酸序列，cdrl2包含seqidno:32显示的氨基酸序列，和cdrl3包含seqidno:33显示的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，人源化抗体或其功能片段包含重链序列的可变区，该可变区包含seqidnos:21-25中任一个显示的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，人源化抗体或其功能片段包含轻链序列的可变区，该可变区包含seqidno:26或seqidno:27显示的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，人源化抗体或其功能片段包含人源化重链序列hvh1、hvh2、hvh3、hvh4和hvh5，其分别包含seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11和seqidno:13显示的氨基酸序列。
在又一个优选的实施方案中，本发明提供人源化抗体或其功能片段，其包含人源化轻链序列hvl1和hvl2，所述人源化轻链序列hvl1和hvl2分别包含seqidno:15和seqidno:17显示的氨基酸序列。
在又一个优选的实施方案中，提供编码上述人源化抗体或其功能片段的重链hvh1、hvh2、hvh3、hvh4和hvh5的核苷酸序列，其中核苷酸序列分别在seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12和seqidno:14中描述。在又一个优选的实施方案中，本发明提供编码上述人源化抗体或其功能片段的轻链hvl1和hvl2的核苷酸序列，其中核苷酸序列在seqidno:16和seqidno:18中描述。
在本发明的第二方面，提供小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段，其中小鼠-人嵌合抗体识别癌细胞表面上的muc1糖肽表位rpapgs(galnac)tappahg。
在优选的实施方案中，小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段包含具有seqidno:1中描述的氨基酸序列的重链序列cvh和具有seqidno:2中描述的氨基酸序列的轻链序列cvl。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供编码小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段的重链cvh的核苷酸序列，其具有seqidno:3中描述的核苷酸序列。在又一个优选的实施方案中，本发明提供编码小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段的轻链cvl的核苷酸序列，其中基因具有seqidno:4中描述的核苷酸序列。
所有序列在下表1中列出。
在本发明的第三方面，提供表达载体，其中所述表达载体包含编码上述人源化抗体的重链hvh1、hvh2、hvh3、hvh4和hvh5的核苷酸序列，和/或编码上述人源化抗体的轻链hvl1和hvl2的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供了宿主细胞，其中所述细胞包含上述表达载体，或具有整合至其基因组的上述核苷酸序列。
在本发明的第五方面，提供了药物组合物，其包含小鼠-人嵌合抗体16a(所述小鼠-人嵌合抗体16a包含小鼠单克隆抗体16a的vl和vh区和人igg1的恒定区)或其功能片段和药学上可接受的载体。
在本发明的第六方面，提供了药物组合物，其包含上述人源化抗体或其功能片段和药学上可接受的载体。
本发明还提供了上述人源化抗体或其功能片段在预防或治疗疾病例如癌症中的用途。
本发明还提供了小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段在预防或治疗疾病例如癌症中的用途。
本发明还提供了一种预防或治疗癌症的方法，其中所述方法包括给予有需要的受试者有效量的上述人源化抗体或其功能片段或小鼠-人嵌合抗体16a或其功能片段。
鉴于本公开内容，本发明的其它方面对于本领域技术人员将显而易见。
表1.本发明的序列
附图简述
图1说明肿瘤糖缀合物促进肿瘤生长和破坏免疫监视。粘蛋白muc1直接结合bax分子和阻断肿瘤细胞的细胞凋亡途径。粘蛋白糖蛋白结合nk细胞和t细胞的半乳凝素，和诱导免疫细胞的细胞凋亡。
图2说明通过用缺少核心-1β3-半乳糖基转移酶活性的异种肿瘤细胞系免疫小鼠产生单克隆抗体。(a)c57b6品系小鼠通过转染有muc1基因的jurkat细胞系静脉内免疫；(b)在肿瘤细胞表面上表达的muc1表位刺激b细胞产生抗体。肿瘤细胞抗原将cd4辅助t细胞提供给b细胞。(c)对糖肽的抗体反应可通过elisa实验检测。单克隆抗体可通过使用特定糖肽进行选择。
图3描述16a嵌合抗体的氨基酸和dna序列。每个可变区通过黑色区域显示。
图4显示cdr移植抗体的人源化程度。
图5描述人源化抗体的氨基酸和dna序列。每个可变区通过黑色区域显示。
图6说明通过elisa测量的嵌合和人源化抗体的特异性。pep1是糖肽rpapgs(galnac)tappahg，pep2是没有糖基化的对照多肽。y-轴是od值，x-轴是抗体浓度(ng/ml)。
图7说明嵌合和人源化抗体与肺癌细胞系h838的结合。肺癌细胞系h838用不同浓度的嵌合亲本和人源化抗体(hvh1hvl2、hvh2hvl2、hvh3hvl2、hvh4hvl2和hvh5hvl2)染色。实线是首先通过人源化抗体和然后通过荧光标记的第二抗体的染色；虚线是仅通过第二抗体的染色。实线和虚线的重叠表明最低染色浓度。
图8说明16a抗体的抗-肿瘤功效。左小图：16a抗体药物组；右小组：对照igg组。每个组包含5只小鼠。提供每只小鼠的肿瘤生长曲线。数据代表了3次独立实验(16a抗体抑制肿瘤细胞系的生长)。
图9说明16a抗体与代表性肺腺癌患者的组织切片的特异性结合。仅肿瘤组织被染色为阳性，而肿瘤周围的肺组织不是如此。
发明详述
提供以下非限制性实施例以进一步说明本文公开的发明的实施方案。本领域技术人员将理解，实施例中公开的技术遵循代表性的方法，所述方法已经被发现在本发明的实践中完全起作用，因此可被认为构成其实践方式的实施例。然而，本领域技术人员根据本公开内容将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方案中可进行许多变化和仍获得同样或类似结果。
实施例1.16a单克隆抗体的cvl和cvh基因的克隆
通过qiagenrneasymini试剂(qiagen)，从16a鼠杂交瘤(来自theuniversityoftexasmdandersoncancercenter；参考资料：intjoncol41(6):1977-84,12/2012)提取总rna。cdna通过smarterrace试剂(clontech)合成。用于逆转录的引物是寡聚-dt。cdna用作pcr模板，以克隆cvh基因和cvl基因。通用引物amix(clontech)和5’-gggrccarkggatagachgatgg-3’(根据小鼠igg抗体重链序列的c区段设计)用作cvh基因的克隆引物。通用引物amix(clontech)和5’-5′-cttcagaggaagggtggaaacagg-3’(根据小鼠igg抗体轻链序列的c区段设计)用作cvl基因的克隆引物。cvh和cvlpcr片段通过3130xlabidna测序仪测序。
实施例2.鼠16a嵌合抗体的设计和表达
嵌合16a抗体的编码基因是一种杂合结构，其中鼠16avh和vl基因片段连接至人igg1的c区片段。16a嵌合抗体的氨基酸和cdna序列显示于图3。vl和vh基因通过sydlabs,ma合成。合成的基因使用3130xlabidna测序仪，通过dna测序验证。嵌合vl和嵌合vh基因分别作为pcdna3.1-嵌合vl和pcdna3.1-嵌合-vh，构建到pcdna3.1表达载体(invitrogen)中。
实施例3.嵌合抗体的表达和纯化
hek293细胞在无血清培养基(dmem,lifetechnologies)中培养。pcdna3.1-嵌合vl和pcdna3.1-嵌合-vh通过电穿孔(maxcyte)同时瞬时转染。电穿孔后将hek293细胞培养另外5天，和培养上清液用于后续的抗体滴度测试。然后将培养上清液合并，和抗体通过蛋白a亲和色谱柱(gehealthcare)纯化。
实施例4.鼠16a人源化(cdr移植)抗体的设计和表达
16a抗体可变区的cdr直接决定抗体的特异性。通过移植小鼠单克隆抗体的cdr至人抗体的可变区，我们设计了轻链hvl1和hvl2序列，和重链hvh1、hvh2、hvh3、hvh4和hvh5序列。我们因此在后续的抗体功能测试中使用hvl2序列。
人抗体框架的选择基于分别针对人hvh和hvl数据库(
人源化抗体通过移植16acdr区至人抗体框架产生。此外，数个氨基酸位点使用计算机3d建模优化。目的是获得具有最高人类评分的人源化序列，同时保留16a抗体的特异性。人源化程度的计算方法根据参考文献16进行。预测的人类评分显示于图4中。
人源化16抗体的氨基酸和cdna序列显示于图5中。
实施例5.单克隆抗体与糖肽的结合活性的测量
elisa板用链霉抗生物素蛋白(1.5μg/ml,millipore)在4℃包被过夜，和在室温下通过1％bsa封闭1小时。将2μg/ml生物素化糖肽(rpapgs(galnac)tappahg)连接至链霉抗生物素蛋白包被的板。连续稀释的嵌合或人源化16a抗体(抗体浓度如图6所示)与糖肽一起孵育。用pbs0.05％tween-20洗涤三次后，然后将板与hrp-缀合的山羊抗-小鼠第二抗体孵育。三次洗涤后，将板与dab试剂一起孵育。未糖基化对照肽以相同浓度使用，以测量其与嵌合或人源化16a抗体的结合。
16a嵌合抗体和人源化抗体对糖肽的亲和力高于对照多肽，特别是hvh5hvl2。如图6所示，发现与糖肽的强结合，甚至在10ng/ml的抗体浓度下(od＝2.0)。而抗体与对照肽(肽2)的结合在10ng/ml抗体浓度下非常低(od＝elisa背景)。肽1和肽2之间的唯一区别是肽2没有糖(galnac)修饰。
结合抗原rpapgs(galnac)tappahg的嵌合和人源化抗体的最小浓度，如通过elisa测定的。
实施例6.通过流式细胞术染色测量抗体与肿瘤细胞的结合
肺癌细胞系h838获自theuniversityoftexasm.d.andersoncancercenter。细胞在10％rpmi1640培养基中培养。不同浓度的嵌合抗体或人源化抗体用作第一抗体用于染色，用pbs洗涤三次，然后与pe-缀合的小鼠抗-人igg(biolegend)一起孵育。染色的细胞通过facscaliber流式细胞仪(bdbiosciences,sanjose,ca)分析。染色结果显示在图7中。
结合抗原的嵌合和人源化抗体的最小浓度，通过肺癌细胞系h838的细胞表面染色测定。
实施例7.16a单克隆抗体的抗肿瘤功效
c3h小鼠(jacksonlaboratory,me)用ag104-muc1细胞系接种，ag104-muc1细胞系为一种通过muc1基因稳定转染的小鼠纤维肉瘤细胞系(9)。6-周龄c3h小鼠用2百万个肿瘤细胞皮下接种。100微克的16a抗体在肿瘤接种当日通过腹膜内注射给予。16a抗体药物每3天以100微克/小鼠给予。对照小鼠igg抗体(来自southernbiotech,al)用于治疗对照组的带肿瘤小鼠。测量肿瘤的垂直直径，和肿瘤面积用于表示肿瘤负荷。在通过16a单克隆抗体治疗的小鼠中，肿瘤生长显著受到抑制。
实施例8.16a抗体与癌症而不与肿瘤周围的组织特异性结合
按之前所述(9)，进行免疫组织化学。简言之，将5-μm石蜡固定的组织切片在二甲苯中脱石蜡，和通过使用乙醇梯度(100、95-80％，sigma,st.louis,mo)再水合。使用ptmodule(labvisioncorp.,usa)在tris-edta缓冲液(ph9.0)中进行抗原修复30min。冷却后，将玻片在蒸馏水中充分洗涤和在1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤三次，每次2min。内源过氧化物酶活性通过在室温下浸入3％过氧化氢(sigma)中，然后浸入甲醇中10min，接着在1xpbs中漂洗2min三次淬灭。第一抗体的非特异性结合通过在室温下用10％正常马血清孵育切片30min来封闭。然后将切片用1μg/ml浓度的第一抗-16a单克隆抗体在4℃孵育过夜。
第二天，在1xpbs中洗涤三次(每次2min)后，玻片用第二抗-小鼠igg-生物素抗体(1:200,vectastaineliteabc试剂盒；vectorlaboratories,ca,usa)在室温下孵育1h和在1xpbs中漂洗三次(每次2min)。在用抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(1:100,vectastaineliteabc试剂盒；vectorlaboratories,ca,usa)另外孵育1-h和用1xpbs重复洗涤步骤后，用发色团3,3-二氨基联苯胺(dab,dako,carpinteria,ca,usa)进行显像。玻片用苏木精复染和用permount盖玻片。jurkat-pcdna-ires-egfp-muc1和jurkat-pcdna-ires-egfp的切片分别用作阳性和阴性对照。同种型igg和省略第一抗体用作染色的阴性对照。
本公开内容引用的所有参考资料通过引用结合到本文中，如同各自单独通过引用结合到本文中。此外将理解，本领域技术人员根据上文描述的教导，在不背离本发明的精神的情况下可对本发明进行各种变化和修改，和这些等同方案被认为落入随附权利要求书定义的本发明的范围内。
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