一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及应用的制作方法

本发明涉及一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备及其应用。

背景技术：

顺铂，在1965年被Rosenberg等人发现抗癌活性后，迅速成为目前临床上治疗各种恶 性肿瘤(包括睾丸癌，卵巢癌，乳腺癌，膀胱癌，肝癌，肺癌，颈癌和非小细胞肺癌)使用 最广泛的一线抗癌药物。顺铂的作用机制主要是通过与DNA的腺嘌呤和鸟嘌呤碱基共价性 结合，使得DNA产生链间和链内交叉联结，从而抑制DNA的合成而杀伤细胞。顺铂对细胞 周期各时相均无特异性，且药效呈现剂量依赖性，但是伴随的毒副作用，如肾毒性，不可逆 的周围神经病变和耳毒性，严重限制了顺铂的临床应用。为了减少毒副作用但同时保留顺铂 的抗肿瘤活性，惰性四价铂前药化合物的出现受到研究者的广泛关注。

四价铂前药化合物，以其八面体配位的惰性结构，被认为在铂类抗癌药物的研究领域 中具有广阔的应用前景。该类化合物在血液循环中与蛋白质和其他生物大分子保持取代动力 学惰性，能够更加稳定地到达肿瘤细胞，在肿瘤细胞内高还原性条件下被还原成二价铂类活 性物质，从而发挥抗肿瘤活性。据有关文献报道，轴向配体在四价铂前药化合物的还原过程 中起重要作用，当四价铂化合物的赤道配体相同时，它们的氧化还原电极电位随着轴配体的 变化而变化，按照以下模式：OH^-＜OAc^-＜Cl^-。此外，如果轴向配体是OAc-，则四价铂化合 物的氧化还原电极电位最为符合四价铂类抗癌药物设计的要求，不会因为还原过快带来严重 的毒副作用，也不会因为还原过慢而使药物在体内失活。因此，一系列的四价铂类药物陆续 涌现，如赛达铂(第一个进入临床验证口服四价铂药物)，奥马铂和异丙铂等。但是四价铂类 药物在临床上依然存在着诸多问题，例如无法降低顺铂的毒副作用，以及减弱顺铂的抗肿瘤 活性等。针对目前四价铂前药的所面临的挑战，寻找有效的药物递送系统是解决四价铂前药 存在问题的关键措施。

聚合物递送系统可以通过在肿瘤组织中增强的渗透性和保留(EPR)效应克服四价铂 前药存在的缺陷。在过去的十年中，聚合物递送系统在肿瘤学中的重要性随着生物可降解聚 合物的出现而倍受关注。良好的聚合物载体对于抗癌药物在体内的输送起着至关重要的作用， 它可以成功地将药物装载到递送系统并在特定的肿瘤部位释放。而且，聚合物载体必须安全， 无抗原性并且适合于多次给药。据报道，聚(谷氨酸)(PGA)，N-(2-羟丙基甲基丙烯酰胺) (HPMA)和聚(乙二醇)(PEG)是疏水性药物在临床治疗中使用最广泛的水溶性聚合物。 聚(谷氨酸)PGA，以其生物相容性和生物可降解性，成为聚合物载体的首选。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型还原敏感型四价铂纳米复合物；

本发明的另一目的是提供一种还原敏感型四价铂纳米复合物的制备方法；

本发明还有一个目的是提供上述还原敏感型四价铂纳米复合物在抗肿瘤方面的作用。

因此，本发明提供一种敏感型四价铂纳米复合物，其特征是：以顺铂为原料，经氧化 剂氧化，并以琥珀酸酯修饰之后成为适合于在肿瘤细胞内还原发挥活性的四价铂前药小分子， 之后通过配位键将四价铂前药和一个聚氨基酸载体巧妙连接，形成在肿瘤细胞内还原响应的 四价铂纳米复合物。

其中所述的聚氨基酸载体包括聚天冬氨酸(PASP)，γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，α-聚谷氨 酸(α-PGA)，聚精氨酸(PAA)，聚赖氨酸(ε-PL))，含有羟基的小分子多羟基羧酸修饰的聚 氨基酸酯，小分子多羟基羧酸包括：乳酸，柠檬酸，丙三酸，氨基丙二酸等，优选γ-聚谷氨 酸(γ-PGA)，α-聚谷氨酸(α-PGA)，柠檬酸修饰的γ-聚谷氨酸酯，其结构通式为：

本发明提供的还原敏感性四价铂复合物由聚氨基酸载体与氧化修饰后的四价铂通过配 位键结合而成，其中四价铂与聚氨基酸载体的结合方式有多种，以柠檬酸修饰后的γ-聚谷氨 酸与四价铂结合为例，其复合物的结构可表示如下，但不限于此。

本发明提供的还原敏感型四价铂纳米复合物制备过程如下：

(1)顺铂氧化：称量一定量顺铂，加入适量超纯水和氧化剂，避光室温下搅拌12～36h。减压

(2)琥珀酸修饰：称取一定量该亮黄色粉末溶于DMSO，按摩尔比2∶1～1∶5加入琥珀酸酐， 50～80℃水浴下搅拌过夜反应，得到浅黄色溶液，抽真空减少溶液体积至0.5ml，加入适量体 积的冰丙酮，得到浅白色沉淀，3000r离心5～15min，真空干燥，得到浅黄色固体。

(3)复合物制备：取一定量聚谷氨酸载体粉末，加入适量超纯水搅拌溶解，按摩尔比 0.1∶1～1∶0.3加入上述合成的四价铂前药小分子，室温下搅拌至溶解后，持续反应24～72h，冷 冻干燥，即得还原敏感型四价铂纳米复合物。

本发明制备四价铂纳米复合物的步骤(1)的氧化剂可以是MnO₂，H₂O₂，优选30％H₂O₂做氧化剂；避光搅拌12～36h，优选时间为24h。步骤(2)采用的聚氨基酸载体与琥珀酸酐反 应摩尔比为2∶1～1∶5，优选摩尔比1∶1；采用的水浴加热条件为50～80℃，优选为70℃；离心 时间为2～10min，优选为5min。步骤(3)的反应溶剂可以是惰性有机溶剂：如DMF，DMSO， 环己烷或纯水，优选纯水做反应溶剂；四价铂前药小分子与聚氨基酸载体的反应摩尔比为 0.1∶1～1∶0.3，优选1∶0.2；反应时间为24～72h，优选48h；干燥方式为真空干燥或冷冻干燥， 优选冷冻干燥。

本发明制备的四价铂纳米复合物形态均一，粒径在200nm左右，载药量为15％。

本发明制备的四价铂纳米复合物，在体外释放实验中还原条件下和酸性环境中48h的 累积释放量比普通血液环境的累积释放量高出30％左右。

本发明制备的四价铂纳米复合物，体外细胞实验中表现出较低的毒性，但是在还原条 件下孵育之后抗肿瘤活性明显增强。

本发明制备的四价铂纳米复合物，在体内药效实验中表现处较强的肿瘤抑制率，而且 显著延长裸鼠的生存期，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂的氢谱图

图2为c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂的红外光谱图

图3为四价铂前药小分子的氢谱图

图4为四价铂前药小分子的红外光谱图

图5为四价铂纳米复合物的氢谱图

图6为四价铂纳米复合物的红外光谱图

图7为四价铂纳米复合物的TEM图

图8为四价铂纳米复合物的体外释放曲线图

图9为四价铂纳米复合物的体外细胞凋亡情况图

图10为四价铂纳米复合物的体内药效图

具体实施方式

下面对本发明进行进一步的阐述。

实施例1

c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]的合成及表征

(1)c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂]的合成：称量一定量顺铂，加入适量超纯水和30％的双 氧水，避光室温下搅拌12～36h。减压抽滤，分别用超纯水、乙醇和乙醚洗涤两次，除去残余 溶剂得到亮黄色固体。

(2)c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂结构表征

核磁共振分析取c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂干燥纯品适量，溶于DMSO-d6中，进行核磁 共振H谱(¹HNMR)检测，结果见图1。

红外图谱分析取c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)₂干燥纯品适量，与少量KBr研磨压片制样，室 温下于4000～500cm-1范围内扫描，分辨率2cm-1，结果见图2。

实施例2

c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)(OOCCH₂CH₂COOH)]的合成及结构表征：

(1)c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)(OOCCH₂CH₂COOH)]的合成：称一定量实施例1中的亮黄 色粉末溶于适量DMSO，按摩尔比2∶1～1∶3加入琥珀酸酐，50-80℃水浴下搅拌过夜反应，得 到浅黄色溶液，抽真空减少溶液体积至0.5ml，加入适量体积的冰丙酮，得到浅白色沉淀，3000r 离心5min～15min，真空干燥，得到浅黄色固体。

(2)c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)(OOCCH₂CH₂COOH)]结构表征

核磁共振分析取c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)(OOCCH₂CH₂COOH)]干燥纯品适量，溶于 DMSO-d6中，进行核磁共振H谱(¹HNMR)检测，结果见图3。

红外图谱分析取c，c，t-[Pt(NH₃)₂Cl₂(OH)(OOCCH₂CH₂COOH)]干燥纯品适量，与少量 KBr研磨压片制样，室温下于4000～500cm-1范围内扫描，分辨率2cm-1，结果见图4。

实施例3

四价铂纳米复合物的制备及表征：

四价铂纳米复合物的制备：取一定量冻干载体粉末，加入适量超纯水搅拌溶解，按摩 尔比0.1∶1～1∶0.3加入上述合成的四价铂前药小分子，于室温下搅拌至溶解后，持续反应 24～72h，冷冻干燥，即得还原敏感型四价铂纳米复合物。

四价铂纳米复合物的结构表征：

核磁共振分析取四价铂纳米复合物干燥纯品适量，溶于DMSO-d6中，进行核磁共振 H谱(¹HNMR)检测，结果见图5。

红外图谱分析取四价铂纳米复合物干燥纯品适量，与少量KBr研磨压片制样，室温下 于4000～500cm-1范围内扫描，分辨率2cm-1，结果见图6。

TEM透射电镜分析取四价铂纳米复合物干燥纯品适量，用超纯水溶解并稀释成一定浓 度，缓慢滴加至镀膜铜网，滤纸吸去多余液体，置于红外灯下干燥，80kV投射电子显微镜下 观察，结果见图7。

实施例4

四价铂纳米复合物的载药量测定

精密称取四价铂纳米复合物适量，溶于一定量的浓硝酸，80℃硝解30min，冷却至室 温后，用移液管准确移取一定体积至10ml容量瓶，用超纯水定容至刻度。取20μL于石墨炉 原子吸收分光光度计测定吸光度计测定吸光度A值，代入标准曲线求出铂溶液的浓度，并计 算四价铂纳米复合物中铂含量。平行测定三批，顺铂载药量为15％左右，顺铂利用率较高， 复合物制备成本较低。

实施例5

四价铂纳米复合物的体外释放研究

分别配制四种释放介质：pH5.0，，pH7.4，0.1mM NaAsc和5mM NaAsc的PBS缓冲 液，准确称取一定量四价铂纳米复合物，溶解在适量上述释放介质中，迅速置于密封的透析 袋(MWCO＝3500)，立即封口后，将透析袋置于五倍量体积的释放介质中。将不同的释放体 系分别放置于37℃，100rpm恒温震荡箱中，分别于相应时间点吸取1ml释放介质留待分析， 同时迅速补充1ml新鲜释放介质。采用石墨炉原子吸收分光光度计法测定不同释放介质中的 铂浓度。

实验结果如图8所示：四价铂纳米复合物中在模拟肿瘤环境(pH5.0)下，铂累积释放 量为明显超出生理环境下(pH7.4)，48h的铂累积释放量高出30％多。在5mM的NaAsc的释 放介质中，四价铂纳米复合物的释放表现出明显的还原敏感性，在0.1mM NaAsc的释放介 质中，四价铂纳米复合物的铂累积释放量只有20％，而在5mM的NaAsc铂累积释放量达到 58％，高出了38％。

实施例6

四价铂纳米复合物的体外细胞凋亡考察

取对数生长期的MCF-7细胞，接种于6孔板上，细胞密度为10*5/孔，用RPMI 1640 完全培养基于细胞培养箱中孵育24小时。分别设置空白组(不加药)，对照组(游离顺铂)， 给药组(四价铂纳米复合物)，还原组(事先用GSH孵育三小时，四价铂纳米复合物)，细胞 贴壁长至60％～70％为宜，弃去培养基，然后按照各个组别的设置加入相应药物继续孵育。待 药物作用24h后，移去培养基，用PBS清洗三次，然后用0.25％的胰蛋白酶溶液(无EDTA) 收集细胞，加Binding Buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5μL，再加入Propidium Iodide 5μL 混匀，室温下避光搅拌5～15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

细胞凋亡情况如图9所示，游离顺铂孵育24h后，与对照组正常细胞相比，细胞凋亡 比例为39％，四价铂纳米复合物组的细胞凋亡率为15.57％，还原组(提前用谷胱甘肽孵育3 小时)的细胞凋亡率明显高于四价铂纳米复合物组，为24.94％。

实施例7

四价铂纳米复合物的体内药效研究

将四周龄裸鼠饲养一周，接种人源乳腺癌细胞MCF-7建立人源肿瘤模型。约7～10天， 当肿瘤体积长至100mm³时，取荷瘤裸鼠30只，体重20～22g，随机分成5组：空白对照组， 游离CDDP组，四价铂纳米复合物组(三个剂量)，每组6只。给药前禁食12h，自由饮水。 采用生理盐水注射液分别稀释CDDP和各个制剂冻干粉至适宜浓度，尾静脉注射给药，四价 铂纳米复合物组剂量分别为8mg/kg，15mg/kg，30mg/kg(均以CDDP计)，以生理盐水注射液 为对照，每只裸鼠给药体积为0.2ml，隔天给药，共给药四次，通过测量肿瘤体积动态观察制 剂的抗肿瘤效果。于第一次给药起，每天观察裸鼠的临床症状，采用游标卡尺测量肿瘤的大 小，并称量裸鼠的体重。肿瘤体积计算公式如下：

肿瘤体积＝0.5ab²(a为肿瘤最长直径；b为肿瘤最短直径)

体内药效结果如图10所示：跟生理盐水对照组相比，顺铂组和不同剂量的四价铂纳 米复合物组均表现出明显的抑瘤效果，其中顺铂的抑瘤效果最为显著，当四价铂纳米复合物 的剂量为8mg/kg的时候，抑瘤率只有顺铂的25％，当剂量逐渐增加时，四价铂纳米复合物对 肿瘤的抑制率也随之增强，当剂量提高到15mg/kg时，抑瘤率提高到60％，继续增加给药剂 量，当剂量提高至30mg/kg时，四价铂纳米复合物的抑瘤率和顺铂一致。值得注意的时，高 剂量的药物并没有给裸鼠带来很明显的毒副作用，体重在正常范围内平缓波动。而剂量只有 4mg/kg的顺铂，裸鼠的体重下降明显，表现出较强的毒副作用。从绘制的生存期曲线可以看 出，顺铂组的裸鼠生存质量普遍很差，生存期明显低于四价铂纳米复合物组，也反映出了四 价铂纳米复合物在保留有顺铂较强的肿瘤杀伤力之外，还能够避免游离顺铂所带来的副作用。