本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种清益调免方及其应用。
背景技术：
美国生殖医学学会(ASRM)将复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)定义为与同一性伴侣连续发生2次或者2次以上的自然流产。复发性自然流产(RSA)在育龄期女性中的发病率约1-5％，通常发生在妊娠20周之前。其发病原因复杂，常见有血栓前状态，胚胎染色体异常，母体解剖结构异常，母体内分泌失调，感染等因素(Su MT,Lin SH,Chen YC.Genetic association studies of angiogenesis-and vasoconstriction-related genes in women with recurrent pregnancy loss:a systematic review and meta-analysis.[J].Hum Reprod Update 2011；17:803–812.)。在RSA中约50％以上为原因不明的复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。由于近年来社会进步，妇女各方面压力不断增高，其临床发病率也呈上升趋势，其主要原因被认为与母胎免疫应答与免疫抑制失衡导致母体免疫系统排斥胎儿有关。
对于URSA的治疗一直是临床的热点与难点，目前临床上常用免疫抑制剂进行治疗，如糖皮质激素类、细胞毒性药物等，然而，免疫抑制类药物的毒副作用是其临床运用的主要障碍，而对于妊娠期妇女药物致畸形、致突变的风险大幅增加，例如Laskin等研究发现，强的松虽然可一定程度上提高URSA女性的活产率(活产率上升9％，无显著统计学差异)，却可导致孕产妇早产，糖尿病及高血压发病率明显升高(有统计学差异)。近年来环孢菌素等免疫抑制剂在URSA的病人中应用明显增加，但是环孢菌素除了存在常见的导致肾毒性，高血压，高脂血症风险外，同时存在致畸的风险，因此常规免疫抑制药物并不适合在URSA的治疗中规模性使用，其对妊娠女性远期健康的影响仍待进一步观察。因此，寻找与研究安全可靠的妊娠期免疫调节治疗方法，对于URSA防治具有重要的临床价值与意义。
技术实现要素：
中医药保胎治疗历史源远流长，其用药安全性及有效性已得到了长期临床实践的检验与证明。本发明旨在将中医药“安胎”、“保胎”的治则治法与现代免疫调控的用药机制相结合，提供一种清益调免方及其在制备治疗复发性自然流产药物中的应用。
一方面，本发明提供一种清益调免方，所述清益调免方的配方为：按重量份计，生黄芪10～30生地黄10～30银花9～15连翘3～9丹参10～30续断9～15党参9～15当归6～20菟丝子10～30黄芩6～15丹皮6～9山药10～30巴戟天6～9杜仲9～20陈皮6～9。
本发明的清益调免方(中药组合物)能显著抑制淋巴细胞特异性增殖反应，从而降低CBA/j×DBA/2模型小鼠的自然流产率，起到保护孕鼠的作用。其作用机制可能是通过增加免疫抑制效应细胞因子IL-10的分泌并上调Treg(调节性T细胞(regulatory T cells,Treg cells))及其表面CTLA-4的表达，抑制效应性T细胞增殖，发挥Treg在母胎界面免疫调控的作用。而且，本发明的清益调免方能显著抑制OVA小鼠的淋巴细胞特异性增殖反应，同时对于免疫活化的小鼠的体液免疫系统也具有一定的抑制作用。其作用机制可能是通过对p-STAT5/SOCS1平衡的调控诱导和促进了Treg细胞的分化，通过对Treg分化的上调使得整体免疫反应受到抑制，这些作用有可能阻断URSA发病的关键环节。因此，本发明的清益调免方有望用于治疗复发性自然流产。
较佳地，所述清益调免方的配方为：按重量份计，生黄芪30生地黄30银花9连翘9丹参10续断15党参15当归10菟丝子15黄芩10丹皮9山药15巴戟天6杜仲15陈皮6。
另一方面，本发明提供上述清益调免方在制备治疗复发性自然流产药物中的应用。
所述复发性自然流产可以是原因不明的复发性自然流产。
所述药物还可包括药学上可接受的载体。
所述药物还可包括药学上允许的辅料。
所述药物的剂型可以是胶囊、颗粒、片剂、口服液、合剂或糖浆剂。
附图说明
图1中的A是本发明一实施例中经OVA诱导的各组淋巴细胞的吸光度值；B是经OVA诱导的各组淋巴细胞的增殖率；
图2是本发明一实施例中各组OVA致敏小鼠的血清中抗OVA特异性抗体IgG的相对含量；
图3是本发明一实施例中经OVA诱导的各组淋巴细胞的Th细胞分化相关因子的mRNA相对表达量，其中A是CD4，B是CD25，C是FoxP3；
图4是本发明一实施例中OVA诱导体系中各组细胞培养上清中细胞因子IL-2(A)和TGF-β(B)的浓度、以及各信号传导因子的表达量；
图5是本发明一实施例中各组小鼠的胚胎丢失率；
图6是本发明一实施例中各组小鼠的淋巴细胞增殖率；
图7是本发明一实施例中各组小鼠脾脏淋巴细胞的IL-10分泌水平(A)和γ-IFN分泌水平(B)；
图8是本发明一实施例中各组小鼠的调节性T细胞比例；
图9是本发明一实施例中各组小鼠的PD-1的mRNA转录水平(A)和CTLA-4的mRNA转录水平(B)。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
中医药保胎治疗历史源远流长，其用药安全性及有效性已得到了长期临床实践的检验与证明。本发明人根据临床免疫原因导致复发性流产患者的临床表现多见：神疲乏力，口干腰酸，月经色红，舌红脉细小数，认为此类复发性流产患者中医辨证当属气阴两虚，脾肾不足。宗明.万全《万氏妇人科》对于妊娠安胎之见解：“气虚血虚，胞中有热，下元不固也”，地黄、黄芩、银翘、丹皮之属清其热，黄芪、党参、山药健其脾胃之气，菟丝子、巴戟天、杜仲、续断补下元之虚，全方共凑清热、益气、安胎之效。
本发明一实施方式提供一种药物组合物清益调免方，其配方为：按重量份计，生黄芪10～30生地黄10～30银花9～15连翘3～9丹参10～30续断9～15党参9～15当归6～20菟丝子10～30黄芩6～15丹皮6～9山药10～30巴戟天6～9杜仲9～20陈皮6～9。
本发明一特别优选的实施方式中，所述清益调免方的配方为：按重量份计，生黄芪20生地黄20银花9连翘9丹参10续断15党参15当归10菟丝子15黄芩10丹皮9山药15巴戟天6杜仲15陈皮6。本发明另一特别优选的实施方式中，所述清益调免方的配方为：按重量份计，生黄芪30生地黄30银花9连翘9丹参10续断15党参15当归10菟丝子15黄芩10丹皮9山药15巴戟天6杜仲15陈皮6。
上述配方中，各组分的含量是以将单味中草药经炮制、煎煮而制成的浓缩颗粒计量的含量。即，上述各组分可以是颗粒剂。采用免煎颗粒剂，可以直接按比例溶解于水后服用。但应理解，本发明中，清益调免方也可以是由原料药配制而成。以原料药配制时，其重量份是否与上述配比大致相同。该情况下，可以从原料药中提取有效成分。提取可包括：煎煮、回流提取、浸渍或渗漉。
可以将本发明的清益调免方以有效剂量给予哺乳动物以治疗复发性流产、尤其是原因不明的复发性自然流产。
所述药物可根据需要加入药学上可接受的辅料制备成任何药用剂型。所述辅料包括载体、赋形剂和/或填充剂等。所述药物的剂型可以是胶囊、颗粒、片剂、口服液、合剂或糖浆剂。
术语“治疗”意指减缓与疾病、病症或病况有关的症状，或停止这些症状的进一步发展或恶化。取决于患者的疾病和病况，如本文中所使用的“治疗”可包括治愈、缓和及预防性治疗中的一种或多种。治疗还可包括结合其它治疗给药本发明的药物制剂。
术语“药学上可接受的辅料”包括任何这样的材料，当与活性成分组合时，其允许所述成分保持生物活性，并且不与对象的免疫系统反应。
术语“哺乳动物”指所有哺乳动物，包括人、家畜和宠物。
本发明的清益调免方具有良好的免疫下调作用，并且能促进模型小鼠调节性T细胞的分化，而其作用机制可能是通过对-STAT5/SOCS1平衡的调控实现的。
本发明的清益调免方能显著抑制淋巴细胞特异性增殖反应，从而降低CBA/j×DBA/2模型小鼠的自然流产率，其作用机制可能是通过增加细胞因子IL-10的分泌并上调Treg及其表面CTLA-4的表达，从而抑制效应性T细胞增殖。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1：清益调免方调节OVA致敏小鼠免疫环境的实验研究
运用卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的免疫小鼠模型，通过对模型小鼠淋巴细胞增殖检测、血清特异性抗体测定，确定了清益调免方对于模型小鼠免疫系统的调控作用。并且通过ELISA、实时定量PCR和免疫印迹法，对模型小鼠调节性T细胞相关细胞因子、细胞表面分子及相关信号通路进行研究。具体如下所述。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
Balb/c雌性小鼠，SPF级，6周龄，共30只购于北京维通利华实验动物有限公司(许可证号：SYXK(京)2003-0012)。动物购入后置于上海中医药大学实验动物中心SPF级小鼠专用房，分笼饲养。所有实验操作均符合动物福利的有关规定。
1.1.2清益调免方：生黄芪30生地黄30银花9连翘9丹参10续断15党参15当归10菟丝子15黄芩10丹皮9山药15巴戟天6杜仲15陈皮6(天江制药免煎颗粒剂)，购于曙光医院中草药房。按比例溶解于纯水后浓缩成4g/ml生药浓度，分装后4℃冰箱保存，备用。小鼠灌胃按与人体表面积比等效剂量换算：为40g·kg-1·d-1。
1.1.3实验试剂与仪器：
逆转录试剂盒：RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自于Farmentas公司。荧光定量PCR试剂盒：Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)购自于Thermo Scientific公司。微量分光光度仪：DeNovix DS-11spectrophotometer。实时定量PCR仪：Applied Biosystems 7500Real time PCR System。
1.2方法
1.2.1OVA致敏小鼠模型建立及分组给药
1.2.2OVA致敏小鼠模型建立：每10mg卵清白蛋白(OVA)用2.5mL PBS溶解，加等体积完全弗氏佐剂(CFA)混悬，充分乳化。于实验第7天和第14天，分别于小鼠尾基底部，后足足掌部皮下注射75μL(150μg OVA)每只(每个部位25μL)。
1.2.3分组及用药：将小鼠随机分为正常对照组，模型对照组及清益调免方组，共三组，每组10只小鼠。各组小鼠均采用OVA致敏建立模型。清益调免方组小鼠从实验第1天开始，每天每只治疗组小鼠给予0.2ml清益调免方，连续给药21天。其余两组给予等体积生理盐水。
1.2.4特异性淋巴细胞增殖检测
在实验终点(第21天)，脱脊椎处死小鼠，无菌取脾脏。分离脾脏细胞，裂解红细胞后获得脾脏免疫细胞(主要含淋巴细胞)。将细胞调浓度至4×107/ml悬于含血清1640培养液中。用终浓度为50μg/ml的OVA诱导特异性淋巴细胞的增殖反应。各组细胞与OVA共培养于含5％CO2的37℃培养箱中48小时。设无细胞培养液作为检测空白对照，无OVA诱导细胞作为非特异性增殖对照，培养结束前12小时每孔加入25μl CCK8(同仁化学，日本)溶液，培养结束时用酶标仪450nm读取OD值，以OD值代表活细胞数量。细胞增殖率＝(检测OD值-空白组OD值)/(模型对照组OD值-空白组OD值)×100％。
1.2.5血清特异性抗体的检测
在实验终点，眼底静脉采血，分离血清样本。用ELISA方法检测血清中抗OVA特异性抗体水平，以50μg/ml OVA包被酶标板，4℃孵育过夜。封闭后，加入1:5000稀释血清样品和倍比稀释的相对标准品，室温反应1小时后加入Goat anti-mouse IgG(H+L)直联辣根过氧化物酶(HRP)抗体(Jackson,美国)，室温反应1小时后再加入底物溶液显色，用0.1M HCl终止显示反应后于450nm、校正570nm处测定OD值。根据标准曲线换算出血清中抗OVA特异性IgG的相对含量。
1.2.6实时定量PCR法
在实验终点，分离纯化各组小鼠脾脏免疫细胞，在体外用终浓度为200μg/ml的OVA活化淋巴细胞，培养48小时后收集各组细胞样本。用Trizol(Invitrogen,美国)裂解细胞并通过与氯仿混合抽提RNA，异丙醇沉淀，75％乙醇纯化RNA样品。定量总RNA后进行逆转录反应(Takara，日本)，获得的cDNA样本通过实时定量PCR反应(Takara，日本)进行检查，相关引物序列如下：CD4上游5’-AGG TGA TGG GAC CTA CCT CTC-3’，下游5‘-GGG GCC ACC ACT TGA ACT AC-3’；CD25上游5’-AAC CAT AGT ACC CAG TTG TCG G-3’，下游5‘-TCC TAA GCA ACG CAT ATA GAC CA-3’；Foxp3上游5’-CAC CTA TGC CAC CCT TAT CCG-3’，下游5‘-CAT GCG AGT AAA CCA ATG GTA GA-3’；GAPDH上游5‘-CAA GGT CAT CCATGA CAA CTT TG-3’，下游5‘-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3’。实验结果通过2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。
1.2.7细胞因子的检测
在实验终点，分离纯化各组小鼠脾脏免疫细胞，在体外用终浓度为200μg/ml的OVA活化淋巴细胞，培养48小时后收集各组细胞培养上清。用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测培养上清中IL-2和TGF-β的水平(BD，美国)。将样品与标准品加入已包被一抗的酶标板，连接带有HRP的二抗，再加入底物，待反应充分后终止。于450nm、校正570nm处测定OD值，根据标准曲线计算上清中相关细胞因子的浓度。
1.2.8免疫印迹法
在实验终点，分离纯化各组小鼠脾脏免疫细胞，在体外用终浓度为200μg/ml的OVA活化淋巴细胞，培养48小时后收集各组细胞样本。用RIPA(碧云天，中国)裂解并抽提蛋白样品，BCA(碧云天，中国)法进行蛋白定量。通过电泳分离蛋白，并将蛋白样品转至PVDF膜(Millipore，美国)，用特异性抗体STAT5、p-STAT5、SOCS1、SOCS2和β-Actin(CST，美国)进行免疫反应，连接二抗Goat anti-Rabbit Ab-HRP(Jackson,美国)，通过ECL化学发光进行成像。
1.3数据统计
实验结果以平均值±标准差表示，统计采用Student t-test(应采用单因素方差分析)。对模型对照组与正常对照组进行比较，NS代表无统计学差异，p<0.05表示存在统计学显著性差异(p<0.05#，p<0.01##，p<0.001###)；复方治疗组与模型对照组进行比较(p<0.05*，p<0.01**，p<0.001***)；体外OVA诱导与非诱导进行比较(p<0.05△，p<0.01△△，p<0.001△△△)。
2结果
2.1清益调免方抑制特异性细胞免疫的作用
OVA致敏的小鼠体内发生较为典型的免疫应答反应，脾脏中存在大量OVA特异性的记忆性淋巴细胞。当脾脏中记忆细胞在体外再次抗原OVA后，则引起特异性淋巴细胞增殖反应。实验结果显示，经OVA诱导的各组淋巴细胞均发生了明显的淋巴细胞增殖反应，提示在体内诱导中OVA成功的活化了模型小鼠的免疫系统(参见图1中的A)。但正常小鼠的淋巴细胞经体外OVA刺激后也能够发生较明显的增殖反应，提示OVA也可能激活部分的非特异性免疫反应。而体外未受到OVA诱导的模型组淋巴细胞较正常组同样其增殖反应明显增强，同样显示OVA对于免疫反应具有整体的活化效应。在清益调免方干预的OVA小鼠，其淋巴细胞增殖能力较在有无OVA诱导的条件下，均发生一定程度的下调，而对于OVA诱导的特异性免疫反应中其抑制效应具有显著的统计学差异，而其非特异性免疫抑制作用则未体现出差异，提示清益调免方的作用更倾向于抑制特异性免疫反应。为进一步明确复方清益调免方对于特异性免疫反应的抑制效应，运用方法2.3中的细胞增殖率公式，去掉非特异性增殖本底，计算并统计复方干预的小鼠淋巴细胞相对于模型小鼠的特异性细胞增殖率(参见图1中的B)，结果提示清益调免方能显著抑制OVA小鼠的淋巴细胞特异性增殖反应。
2.2清益调免方抑制特异性体液免疫的作用
URSA的排异反应主要是通过体液免疫实现的，而IgG是免疫球蛋白中最主要且唯一能通过胎盘的抗体。为观察清益调免方对于免疫小鼠模型在体液免疫中的效应，本实施例检测了各组小鼠血清中抗-OVA特异性抗体中的总Ig(H+L)。实验结果显示，清益调免方能明显降低OVA小鼠血清中抗-OVA特异性抗体IgG的水平，提示清益调免方对于免疫活化的小鼠的体液免疫系统也具有一定的抑制作用(图2)。
2.3清益调免方可能通过诱导调节性T细胞发挥免疫调节作用
以上实验结果证明清益调免方对于整体免疫反应均具有抑制效应，包括细胞免疫反应与体液免疫反应。为进一步研究复方调节免疫功能的可能机制，本实施例对Th细胞分化的相关分子进行的实时定量PCR检测。实验结果显示，虽然清益调免方对于CD4的转录水平没有影响(图3中的A)，即对总的Th细胞比例没有影响。但在OVA诱导条件下，淋巴细胞中CD25(图3中的B)与Foxp3(图3中的C)的转录明显增加，提示清益调免方促进了Treg细胞的分化，可能通过对Treg分化的上调使得整体免疫反应受到抑制。
2.4清益调免方可能通过STAT5通路诱导调节性T细胞
通过对OVA诱导体系中各组细胞培养上清中细胞因子IL-2和TGF-β的检测，TGF-β各组均无差异(图4中的B)，而清益调免方组的淋巴细胞培养上清液中IL-2浓度明显减少(图4中的A)。由于IL-2是促进T细胞活化和增殖的主要功能细胞因子，IL-2水平与淋巴细胞增殖水平通常一致。而IL-2信号是诱导Treg细胞分化的关键，实验结果显示(图4中的C)，清益调免方组中STAT5的磷酸化水平明显上升，SOCS2的表达无明显变化，而SOCS1的表达增加。提示清益调免方干预的淋巴细胞，虽然在IL-2整体水平下降的条件下，但IL-2相关的信号通路STAT5的敏感性增加，体现在p-STAT5/SOCS1的比值增加，清益调免方可能是通过对p-STAT5/SOCS1平衡的调控诱导Treg细胞的分化。
与模型对照组相比，清益调免方能显著抑制OVA小鼠的淋巴细胞特异性增殖反应(p<0.001)；明显降低OVA小鼠血清中抗-OVA特异性抗体IgG的水平(p<0.001)；在OVA诱导条件下，淋巴细胞中CD25与Foxp3的转录明显增加(p<0.05)；清益调免方治疗组中STAT5的磷酸化水平明显上升(p<0.05)，SOCS2的表达无明显变化(p>0.05)，而SOCS1的表达增加(p<0.05)。
根据本实施例可知，清益调免方能显著抑制OVA小鼠的淋巴细胞特异性增殖反应，并在一定程度上抑制模型小鼠的体液免疫反应(P<0.001)。而对Th细胞分化的相关因子进行检测，发现清益调免方可显著增加Th细胞中CD25及FoxP3mRNA的表达(P<0.05)，提示清益调免方抑制OVA致敏小鼠整体免疫反应的作用机制可能与其促进Treg细胞的分化密切相关。同时对IL-2介导的STAT5信号通路进行研究发现，清益调免方组淋巴细胞上清液中STAT5的磷酸化水平明显上升，SOCS1的表达增加。结果提示在IL-2整体水平下降的条件下，清益调免方可增加p-STAT5/SOCS1的比值，从而增加IL-2相关的信号通路STAT5的敏感性，进而进一步诱导Treg细胞的分化。
本发明的清益调免方能显著抑制OVA小鼠的淋巴细胞特异性增殖反应，同时对于免疫活化的小鼠的体液免疫系统也具有一定的抑制作用。其作用机制可能是通过对p-STAT5/SOCS1平衡的调控诱导和促进了Treg细胞的分化，通过对Treg分化的上调使得整体免疫反应受到抑制，这些作用有可能阻断URSA发病的关键环节。
实施例2：清益调免方对自然流产小鼠模型调节免疫的实验研究
将小鼠随机分为正常妊娠组，自然流产模型组，清益调免方组及强的松组，通过对小鼠胚胎丢失率、淋巴细胞增殖率的测定，初步确定了清益调免方对于模型小鼠免疫系统的调控作用。并且通过ELISA、流式细胞检测法和实时定量PCR，对小鼠调节性T细胞相关细胞因子、细胞表面分子进行研究。具体如下所述。
1材料与方法
1.2材料
1.1.1实验动物
Balb/c雄性小鼠5只，DBA/2雄性小鼠15只，CBA/j雌性小鼠40只，均为SPF级，6周龄，购于北京维通利华实验动物有限公司(许可证号：SYXK(京)2003-0012)。动物购入后置于上海中医药大学实验动物中心SPF级小鼠专用房，分笼饲养。所有实验操作均符合动物福利的有关规定。
1.1.2清益调免方：生黄芪30 生地黄30 银花9 连翘9 丹参10 续断15 党参15 当归10 菟丝子15 黄芩10 丹皮9 山药15 巴戟天6 杜仲15 陈皮6等(天江制药免煎颗粒剂)，购于曙光医院中草药房。小鼠灌胃给药以10倍代谢率(换算系数)及体表面积换算，按比例溶解于纯水后浓缩成0.0143帖/ml生药浓度，制备药物后，分装后4℃冰箱保存，备用，每天倍比稀释，清益调免汤组连续给药60天。
本实施例采用临床应用时间较久，致畸率较低(接近于正常妊娠畸形胚胎风险)的强的松(Prednisone)作为阳性药物对照。强的松购买于曙光医院西药房，5mg/片，小鼠灌胃给药以10倍代谢率(换算系数)及体表面积换算，药物浓度为0.143mg/ml，连续给药60天。CBA/j×BALB/c正常妊娠CBA/j×DBA/2自然流产模型小鼠予等量生理盐水灌胃。
1.1.3实验试剂与仪器：
RNA提取试剂RNAiso Plus，逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit和荧光定量PCR试剂盒Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)均购自于TaKaRa公司。Anti-CD4-PE、Anti-CD25-PE Cy7、Anti-Foxp3-APC荧光抗体及胞内染色试剂盒(Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation/Permeabilization Diluent、Permeabilization Buffer)购自于affymetrix eBioscience公司。微量分光光度仪：DeNovix DS-11spectrophotometer；梯度PCR仪：Biometra T-gradient；实时定量PCR仪：Applied Biosystems 7500Real time PCR System；流式细胞仪：BD FACS Calibu。
1.2方法
1.2.1自然流产CBA/j×DBA/2小鼠模型建立：将雌、雄小鼠按2∶1合笼交配，CBA/j×BALB/c为正常妊娠小鼠模型，CBA/j×DBA/2为自然流产鼠模型。自合笼开始，于每天的8：00及15：00分别观察雌鼠有无阴栓，发现阴栓脱落则记为妊娠的第1天，妊娠第6天认定为孕鼠胚胎植入期，妊娠第9天认定为自然流产前期，妊娠第14天认定为正常孕鼠胚胎发育期或自然流产后期。
1.2.2分组及用药：将小鼠随机分为正常妊娠对照组，自然流产模型对照组，清益调免方治疗组及阳性药物(强的松)治疗对照组，共四组，每组10只小鼠。除正常妊娠对照组外均进行CBA/j×DBA/2合笼交配。在合笼交配前30天，给予清益调免方或阳性对照药，每天每只治疗组小鼠给予0.1ml/10g体重，连续给药30天后进行合笼。
1.2.3胚胎丢失率评价
每只受孕小鼠在观察到阴栓脱落第14天进行胚胎丢失率评价，取每只小鼠的胚胎及胎盘组织，以一下公式计算胚胎丢失率：
胎丢失率＝丢失胚胎数/(丢失胚胎数+存活胚胎数)×100％。
1.2.4淋巴细胞增殖检测
处死小鼠后无菌取脾脏。分离脾脏细胞，裂解红细胞后获得脾脏免疫细胞(主要含淋巴细胞)。将细胞调浓度至4×107/ml悬于含血清1640培养液中。用终浓度为1μg/ml的刀豆蛋白A(ConA)诱导淋巴细胞的增殖反应。各组细胞与ConA共培养于含5％CO2的37℃培养箱中48小时。设无ConA诱导细胞为非诱导对照，细胞培养液作为空白对照，培养结束前12小时每孔加入10μl CCK8(同仁化学，日本)溶液，培养结束时用酶标仪450nm读取OD值，以OD值代表活细胞数量；
细胞增殖率＝(诱导OD值-非诱导OD值)/(非诱导OD值-空白OD值)×100％。
1.2.5实时定量PCR法
取每只小鼠抗凝全血，用红细胞裂解的方法获得外周血单个核细胞(PBMCs)。用Trizol(Takara，日本)裂解细胞并通过与氯仿混合抽提RNA，异丙醇沉淀，75％乙醇纯化RNA样品。定量总RNA后进行逆转录反应(Takara，日本)，获得的cDNA样本通过实时定量PCR反应(Takara，日本)进行检查，相关引物序列如下：PD-1上游5’-ACC CTG GTC ATT CAC TTG GG-3’，下游5‘-CAT TTG CTC CCT CTG ACA CTG-3’；CTLA-4上游5’-TTT TGT AGC CCT GCT CAC TCT-3’，下游5‘-CTG AAG GTT GGG TCA CCT GTA-3’；GAPDH上游5‘-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3’，下游5‘-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3’。实验结果通过2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。
1.2.6细胞因子的检测
在实验终点，分离纯化各组小鼠脾脏免疫细胞，在体外用终浓度为2μg/ml的ConA活化淋巴细胞，培养48小时后收集各组细胞培养上清。用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测培养上清中IL-10、IFN-γ和IL-2的水平(BD，美国)。将样品与标准品加入已包被一抗的酶标板，连接带有HRP的二抗，再加入底物，待反应充分后终止。于450nm、校正570nm处测定OD值，根据标准曲线计算上清中相关细胞因子的浓度。
1.2.7流式细胞检测
取每只小鼠PBMCs并进行细胞计数，分别每管2×106的细胞样本分别进行细胞表面染色，分别加入Anti-CD4-PE Antibody，Anti-CD25–PE-Cy7Antibody(Treg)和Anti-PD1–FITCAntibody(Treg)，放置于4℃中孵育30min。随后对细胞进行固定与穿膜，每管加入100μl固定/穿膜工作液，4℃中固定过夜后进行细胞胞内染色。各组细胞分别加入Anti-Foxp3-APCAntibody(Treg)，染色20min。清洗后用PBS悬起细胞(每管0.5ml)进行流式细胞仪分析。数据用CellQuestTM Software进行分析。
1.2.8数据统计
实验结果以平均值±标准差表示，统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。对自然流产模型对照组与正常妊娠对照组进行比较，NS代表无统计学差异，p<0.05表示存在统计学显著性差异(p<0.05#，p<0.01##，p<0.001###)；清益调免方治疗组与自然流产模型对照组进行比较(p<0.05*，p<0.01**，p<0.001***)。
2结果
2.1清益调免方降低自然流产小鼠胚胎丢失率的作用
实验结果(参见图5)显示自然流产CBA/j×DBA/2小鼠的胚胎丢失率明显高于CBA/j×BALB/c正常妊娠小鼠(p<0.05)，而经清益调免方干预后，CBA/j×DBA/2小鼠的胚胎丢失率较模型组下降，且具有统计学差异(p<0.05)。而强的松干预的CBA/j×DBA/2小鼠，其胚胎丢失率较自然流产模型组虽然有一定程度的下降，但无统计学差异(P>0.05)。
2.2清益调免方抑制淋巴细胞增殖的作用
实验结果(参见图6)显示自然流产CBA/j×DBA/2模型小鼠脾脏淋巴细胞的增殖水平明显上升，而清益调免方能有效的降低ConA诱导的淋巴细胞增殖反应(p<0.05)。强的松虽然也可降低淋巴细胞的增殖率，但无统计学差异(P＝0.07)。
2.3清益调免方调节细胞因子的作用
实验结果(参见图7)显示自然流产模型CBA/j×DBA/2小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-10的水平均明显下降(p<0.01)，而经清益调免方干预小鼠的IL-10分泌水平较自然流产模型小鼠明显增加，且有统计学差异(p<0.05)。而强的松组小鼠IL-10分泌水平较自然流产模型组无明显差异。各组γ-IFN分泌水平均无明显差异。
2.4清益调免方可能通过诱导调节性T细胞发挥免疫调节作用
实验结果(参见图8)显示自然流产CBA/j×DBA/2小鼠较正常妊娠小鼠调节性T细胞比例明显减少，而清益调免方干预的小鼠其调节性T细胞比例较模型组上升的程度最为明显，且有统计学差异(p<0.05)。
实验结果(参见图9)显示清益调免方的干预对于PD-1的mRNA转录水平并没有明显的影响。对于另一种抑制性细胞表面分子CTLA-4却具有明显的促进表达作用。
根据上述结果可知，清益调免方可有效降低CBA/j×DBA/2自然流产模型小鼠胚胎丢失率且具有统计学差异(p<0.05)。而强的松干预的CBA/j×DBA/2小鼠，其胚胎丢失率较自然流产模型组虽然有一定程度的下降，但无统计学差异(P>0.05)。提示清益调免方可有效干预模型小鼠的自然流产发生率，且其保护孕鼠的作用要优于临床常用的免疫抑制剂强的松。
本实施例发现清益调免方清益调免方可有效的降低ConA诱导的淋巴细胞增殖反应(p<0.05)。强的松虽然也可降低淋巴细胞的增殖率，但无统计学差异(P＝0.07)。提示清益调免方能够整体抑制细胞免疫水平，其对淋巴细胞增殖的抑制作用强于强的松，且可能是通过抑制T淋巴细胞反应实现的。
本实施例发现清益调免方可明显提高自然流产模型小鼠细胞因子IL-10的分泌水平，而γ-IFN的水平则无明显改变。提示清益调免方对于自然流产小鼠具有抑制性免疫调控的趋势，其作用的机制可能与Th2分泌的细胞因子IL-10密切相关。
本实施例通过流式细胞技术对各组小鼠的外周血单个核细胞中的CD4+CD25+Foxp3+的比例进行了检测。本实施例发现清益调免方组小鼠的Treg比例较自然流产模型小鼠明显提高。提示清益调免方可能是通过调节性T细胞发挥其免疫调控作用。
本实施例发现，清益调免方可显著提高模型小鼠Treg表面CTLA-4基因的表达，而对PD-1基因的表达并无显著影响。提示清益调免方降低模型小鼠自然流产率的作用机制可能与增加Treg表面CTLA-4的表达密切相关。
本发明的清益调免方能显著抑制淋巴细胞特异性增殖反应，从而降低CBA/j×DBA/2模型小鼠的自然流产率，起到保护孕鼠的作用。其作用机制可能是通过增加免疫抑制效应细胞因子IL-10的分泌并上调Treg及其表面CTLA-4的表达，抑制效应性T细胞增殖，发挥Treg在母胎界面免疫调控的作用。