本发明属于生物技术领域，涉及mir-409抑制非小细胞肺癌肿瘤的生长，特别涉及mir-409在制备用于抑制非小细胞肺癌肿瘤的生长的产品中的应用。
背景技术：
非小细胞肺癌是目前世界范围内最普遍的肺癌类型。研究表明，非小细胞肺癌患者一经诊断，其生存率仅为15％左右。虽然针对非小细胞肺癌治疗的放疗和化疗在过去的几十年中已经取得长足进展。然而，非小细胞肺癌患者的临床治疗效果却并未发生明显改善。因此，寻找更好的非小细胞肺癌临床治疗方案并理解其中的作用机制至关重要。
微小rna(microrna，mirna)作为一类内源小rna，能够通过调节并结合在靶基因的3’端非转录区域(utr)从而调节靶基因的功能。越来越多的研究表明，mirnas在胚胎发育、代谢以及凋亡和肿瘤的转归和进展中扮演重要的角色。最新，研究表明，mirnas的异常表达与非小细胞肺癌的功能损伤异常相关，如mir-138、mir-330-3p、mir-503和mir-582-3p。然而，mir-409在非小细胞肺癌中的作用前仍未被具体研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供mir-409及其相关生物材料的新用途。
第一方面，本发明要求保护如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(a)-(d)至少一种中的应用：
(1)成熟mir-409；
(2)前体mir-409；
(3)编码(1)中所述成熟mir-409或(2)中所述前体mir-409的dna分子；
(4)含有(3)中所述dna分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；
(a)抑制肺癌细胞迁移，或者制备用于抑制肺癌细胞迁移的产品；
(b)抑制肺癌细胞生长，或者制备用于抑制肺癌细胞生长的产品；
(c)抑制肺癌细胞增殖，或者制备用于抑制肺癌细胞增殖的产品；
(d)抑制肺癌肿瘤生长，或者制备用于抑制肺癌肿瘤生长的产品。
第二方面，本发明要求保护能够促进如下(1)或(2)或(3)表达的物质在如下(a)-(d)至少一种中的应用：
(1)成熟mir-409；
(2)前体mir-409；
(3)编码(1)中所述成熟mir-409或(2)中所述前体mir-409的dna分子；
(a)抑制肺癌细胞迁移，或者制备用于抑制肺癌细胞迁移的产品；
(b)抑制肺癌细胞生长，或者制备用于抑制肺癌细胞生长的产品；
(c)抑制肺癌细胞增殖，或者制备用于抑制肺癌细胞增殖的产品；
(d)抑制肺癌肿瘤生长，或者制备用于抑制肺癌肿瘤生长的产品。
在上述第一方面和第二方面所述的应用中，所述产品可为药品或保健品等。
第三方面，本发明要求保护能够抑制如下(1)或(2)或(3)表达的物质在如下(a’)-(d’)至少一种中的应用：
(1)成熟mir-409；
(2)前体mir-409；
(3)编码(1)中所述成熟mir-409或(2)中所述前体mir-409的dna分子；
(a’)促进肺癌细胞迁移，或者制备用于促进肺癌细胞迁移的产品；
(b’)促进肺癌细胞生长，或者制备用于促进肺癌细胞生长的产品；
(c’)促进肺癌细胞增殖，或者制备用于促进肺癌细胞增殖的产品；
(d’)促进肺癌肿瘤生长，或者制备用于促进肺癌肿瘤生长的产品。
在所述应用中，所述用于促进肺癌细胞迁移的产品可为迁移能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备迁移能力增强的肺癌细胞模型的物质。
在所述应用中，所述用于促进肺癌细胞生长的产品可为生长能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备生长能力增强的肺癌细胞模型的物质。
在所述应用中，所述用于促进肺癌细胞增殖的产品可为增殖能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肺癌细胞模型的物质。
在所述应用中，所述用于促进肺癌肿瘤生长的产品可为肺癌肿瘤生长能力增强的动物模型，或者是用于制备肺癌肿瘤生长能力增强的动物模型的物质。
在所述应用中，所述“能够抑制如下(1)或(2)或(3)表达的物质”可为mir-409抑制剂。
在本发明的一个实施例中，所述mir-409抑制剂具体为mir-409inhibitor(thermofisherscientific，mimat0001639)。
第四方面，本发明要求保护如下(1)-(3)所示物质中的任一种在作为用于治疗和/或预防肺癌的靶标中的应用：
(1)成熟mir-409；
(2)前体mir-409；
(3)编码(1)中所述成熟mir-409或(2)中所述前体mir-409的dna分子。
在上述第一、第二、第三和第四方面所述的应用中，所述成熟mir-409具体为人源成熟mir-409；所述前体mir-409具体为人源前体mir-409。
进一步地，所述人源成熟mir-409具体为seqidno.1所示的rna分子。所述人源前体mir-409具体为seqidno.2所示的rna分子。
相应的，编码所述成熟mir-409或所述前体mir-409的所述dna分子具体为seqidno.3所示的dna分子或者seqidno.3的第401-479位所示的dna分子。
在上述第一、第二、第三和第四方面所述的应用中，所述肺癌具体为非小细胞肺癌。
进一步地，在上述第一、第二、第三和第四方面所述的应用中，所述肺癌细胞具体为非小细胞肺癌细胞系a549。所述肺癌肿瘤具体为由非小细胞肺癌细胞系a549所致的肿瘤。
实验证明，mir-409能够抑制非小细胞肺癌细胞的生长、迁移和增殖，并能抑制非小细胞肺癌肿瘤的生长。本发明发现，mir-409与非小细胞肺癌患者总体生存及预后密切相关。因此，mir-409有可能成为治疗非小细胞肺癌患者预后的新的生物标志物和治疗靶标。
附图说明
图1为细胞划痕实验结果。a为mir-409过表达能够显著抑制肺癌的迁移。b位抑制mir-409表达，相对于正常组，则显示能够促进非小细胞肺癌细胞系的迁移。
图2为细胞生长实验结果。a为mir-409过表达后能够显著抑制肺癌细胞的生长特性。b为mir-409抑制后则能够促进非小细胞肺癌的生长。
图3为细胞克隆形成实验结果。a为mir-409能够显著抑制非小细胞肺癌的克隆形成能力。b为抑制mir-409表达后则能够显著促进克隆形成。
图4为mir-409过表达能够显著抑制小鼠体内肺癌肿瘤的生长。a为肿瘤大小照片。b为肿瘤大小统计结果。
图5为mir-409与非小细胞肺癌患者临床预后密切相关。a为实时荧光定量pcr结果显示，mir-409在非小细胞肺癌组织中表达明显呈现低水平。b为kaplanmeier生存分析表明，体内mir-409高表达的患者具有更好的无病生存期(p＝0.009)。c为kaplanmeier生存分析表明，体内mir-409高表达的患者具有更好的整体存活率(p＝0.003)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的人源成熟mir-409具体为seqidno.1所示的rna分子。人源前体mir-409具体为seqidno.2所示的rna分子。相应的，编码所述成熟mir-409或所述前体mir-409的所述dna分子具体为seqidno.3所示的dna分子。
下述实施例中，生存分析采用kaplanmeier法，生存曲线的差异用对数秩检验进行评估。采用cox回归模型进行单因素和多因素分析。定量资料采用单因素方差分析和并进行检验评估。采用graphpadprism6软件通过pearsonχ2进行相关性分析。统计计算采用spss17.0软件进行。所有体外实验均均重复三次以上。数据以均值±标准差(sd)表示。p<0.05被认为具有统计学意义。
实施例1、mir-409抑制非小细胞肺癌细胞的迁移、生长和增殖
一、mir-409过表达非小细胞肺癌细胞系的制备
1、mir-409过表达载体pcdh-mir-409的构建
按常规pcr方法，以seqidno.3的第401-479位所示的mir-409的编码基因为模板，采用上游引物和下游引物进行pcr扩增，其中pcr引物中上游引物：5’-ggatcctggtactcggggagaggttac-3’；下游引物：5’-ctcgagtgataccgaaaaggggttcacc-3’。bamhi和xhoi双酶切pcr产物和相应载体pcdh(systembiosciences公司产品，货号为cd500b1)，按正确相位将目的片断插入载体。经转化、筛选，得到阳性克隆酶切鉴定，分析各种重组蛋白的表达，所有重组质粒送北京博迈德生物技术有限公司测序。将测序后表明将载体的酶切位点bamhi和xhoi之间的小片段替换为seqidno.3的第401-479位所示dna片段后的重组质粒命名为pcdh-mir-409。
2、mir409过表达非小细胞肺癌细胞系的制备
向a549细胞(americantypeculturecollection，
二、划痕实验
供试细胞：步骤一制备的mir-409过表达非小细胞肺癌细胞系；以及作为对照的向a549细胞中转入pcdh空载体的空载对照细胞。经浓度为50nm的mir-409抑制剂mir-409inhibitor(thermofisherscientific，mimat0001639)处理48h的a549细胞系；以及作为对照的未经任何处理的正常a549细胞系。
先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。其次在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。然后用pbs洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃5％co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。
三、细胞生长实验
供试细胞：步骤一制备的mir-409过表达非小细胞肺癌细胞系；以及作为对照的向a549细胞中转入pcdh空载体的空载对照细胞。经浓度为50nm的mir-409抑制剂mir-409inhibitor(thermofisherscientific，mimat0001639)处理48h的a549细胞系；以及作为对照的未经任何处理的正常a549细胞系。
将各供试细胞系分别以2×104个/ml密度分别接种于96孔板中，每个孔加入100μl细胞悬液各设3个副孔，常规培养。分别于24h、48h、72h、96h取一块96孔板，在接种孔中加入10μlcck-8试剂，37℃、50ml/lco2常规培养2h，测定od490nm值；以测量时间点为横坐标，od值为纵坐标绘制生长曲线。
四、克隆形成实验
供试细胞：步骤一制备的mir-409过表达非小细胞肺癌细胞系；以及作为对照的向a549细胞中转入pcdh空载体的空载对照细胞。经浓度为50nm的mir-409抑制剂mir-409inhibitor(thermofisherscientific，mimat0001639)处理48h的a549细胞系；以及作为对照的未经任何处理的正常a549细胞系。
取对数生长期的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的dmem培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞以每皿100个细胞的梯度密度分别接种含10ml37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5ml固定15分钟。然后去固定液，加适量gimsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。
五、结果
1、mir-409能够抑制非小细胞肺癌的迁移
本发明首先针对mir-409能够对非小细胞肺癌细胞系迁移进行研究。本发明采用的划痕实验表明，mir-409过表达能够显著抑制肺癌的迁移；而抑制mir-409表达，相对于正常组，则显示能够促进非小细胞肺癌细胞系的迁移(图1)。
2、mir-409能够抑制非小细胞肺癌的生长
本发明于是采用细胞生长实验来探究mir-409是否能够影响非小细胞肺癌的生长特性。研究表明，mir-409过表达后能够显著抑制肺癌细胞的生长特性。另外，mir-409抑制后则能够促进非小细胞肺癌的生长(图2)。
3、mir-409能够抑制非小细胞肺癌的增殖
本发明进一步采用克隆形成实验，对mir-409调节非小细胞肺癌的能力进行研究。实验数据表明，mir-409能够显著抑制非小细胞肺癌的克隆形成能力，而抑制mir-409表达后则能够显著促进克隆形成(图3)。这与上述实验结果保持一致。显示mir-409在非小细胞肺癌进展过程中发挥重要作用。
实施例2、mir-409抑制非小细胞肺癌肿瘤的生长
动物研究是按照中国人民解放军总医院机构动物护理和使用委员会批准的规程进行。将大约1.3×107个a549细胞注射到6周龄balb/c裸鼠。针对肿瘤生长模型，将过表达pcdh空载体、pcdh-mir-409的稳定克隆非小细胞肺癌a549细胞系进行进行小鼠皮下注射。用卡尺测量肿瘤生长情况。根据下列公式计算肿瘤体积：体积＝(长径×短直径)/2。切除的肿瘤进行称重，并部分液氮冷冻或固定于4％多聚甲醛的进一步研究。
结果发现：mir-409过表达能够显著抑制小鼠体内肺癌肿瘤的生长(图4)。这些数据表明，mir-409是调节非小细胞肺癌的重要调控因子。
实施例3、mir-409能够指导人非小细胞肺癌的临床预后
一、病人及标本
本项研究是由中国人民解放军总医院的机构审查委员会批准(北京，中国)和并在患者知情同意下进行。85例非小细胞肺癌和癌旁组织在病理和影像学标准进行研究的基础上进行了评价。临床信息来自患者就诊记录。总的生存时间被定义为从手术到死亡的时间。患者的随访资料每月更新。标本分为两部分：一部分在液氮中立即冻结，保存在-80℃直到进行rna提取，另一部分则用于组织病理学评估。表1列出研究人口的临床和人口统计学特征。
表1mir-409表达以及与临床指标之间的关系
注：*p<0.05,**p<0.01.
二、rna的提取和定量逆转录pcr(qrt-pcr)
采用rneasyminikit(qiagen公司)试剂盒，提取总rna，并反转录成cdna，rna质量检查使用安捷伦2100生物分析仪根据rna完整性评价(rin)。rin值的范围从1到10定义为rna完全降解到结构完整，数值大于7被认为是可接受的完整性定量pcr基因表达检测。taqmanmirnaqrt-pcr系统被用于检测和定量mirna表达。用比较ct法计算mirna的相对表达水平。通用核小rnau6作为内参。
通用核小rnau6作为内参。
用于检测mir409的引物：
mir-409-f：5’-ggaatgttgctcggtga-3’；
mir-409-r：5’-cagtgcgtgtcgtgga-3’。
用于检测核小rnau6的引物：
rnau6-f：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；
rnau6-r：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。
qrt-pcr具体步骤：
(1)总rna提取：将组织用1×pbs清洗一次。再添加1mltrizol，混合均匀，在室温下裂解5min。按照每mltrizol液添加0.2ml三氯甲烷，然后剧烈振荡50次，静置2-3min，12000rpm离心15min。取上层清澈透明液体至新的ep管中，并添加等体积异丙醇，放置-80℃中15min，置于4℃离心机中高速离心15min；用75％乙醇洗涤rna白色沉淀物，4℃高速离心5min；并添加无水乙醇1ml，4℃高速离心2min；至rna自然干燥；最后，溶解rna沉淀，采用100μldepc水溶解。
(2)反转录：总rna2μg，加入1μl50μm的随机引物，72℃进行解链，5min后自然冷却到室温。然后加入dntp、逆转录酶m-mlv、rna酶抑制剂逆转录缓冲液，加水至最终体系体积，置于42℃恒温中，反应1h，95℃恒温环境，5min灭活处理，最终得到反转录完成的cdna。
(3)rt-qpcr：pcr反应液(20μl体系)按下列组分配制：10μlsybrgreenmix(2×)、2μlcdna、0.4μl上下游引物(10μm)，余下用去离子水相应补齐；将样品加入到real-timepcr专用pcr管中后，设置abiprismsds7000的pcr反应条件为：95℃5min，95℃30s,60℃30s,40cycles。完成real-timepcr后对其熔解解曲线进行分析并结合琼脂糖分析pcr产物是否特异。按2-δδct公式基因表达值进行数据计算分析。
三、结果
为更好的探讨mir-409在非小细胞肺癌患者中的临床意义，本发明采用实时荧光定量pcr试验对85例非小细胞肺癌患者及其癌旁组织进行了测量。数据发现，mir-409在非小细胞肺癌组织中表达明显呈现低水平。mir-409表达水平与非小细胞肺癌组织学分级、大小、胸膜浸润和转移密切相关(表1)。此外，kaplanmeier生存分析表明，体内mir-409高表达的患者具有更好的无病生存期(p＝0.009)和整体存活率(p＝0.003)，从而表明mir-409可用于预测非小细胞肺癌的临床转归(图5)。
<110>中国人民解放军总医院
<120>mir-409抑制非小细胞肺癌肿瘤的生长
<130>gncln180411
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>23
<212>rna
<213>人（homosapiens）
<400>1
agguuacccgagcaacuuugcau23
<210>2
<211>79
<212>rna
<213>人（homosapiens）
<400>2
ugguacucggggagagguuacccgagcaacuuugcaucuggacgacgaauguugcucggu60
gaaccccuuuucgguauca79
<210>3
<211>839
<212>dna
<213>人（homosapiens）
<400>3
gttgtgccccgttgagctcccgccaaaggaatcctctgctgggagggaggctctgtgctt60
gtgcaggggtccctacagggtcaccccctctcagggtctgggaatgaaaagcgggtgcga120
gcagggtttcattttcatctttagcaaggtgcccaaggaaggttgccgtcttttcagtat180
aagatcctacctgggtcttgcactcaacttctgggaagagtctctagattcattctggaa240
ggggttggaatcgttggacttggtgattgggaacgtccttggagagtgtgaggctctggg300
ctctgaatgcccagaccttgtgctgcccttgggggagggtcttctgcaagcacagccgcc360
tgcaagcattcaccttagtccgagcatctgagcctctccatggtactcggggagaggtta420
cccgagcaactttgcatctggacgacgaatgttgctcggtgaaccccttttcggtatcaa480
attccaccagggaggccgtcttggaggctggggcacctcggggaaggacgccggcatcag540
caccattctggggtacggggatggatggtcgaccagttggaaagtaattgtttctaatgt600
acttcacctggtccactagccgtccgtatccgctgcagcctgtggggcctgcgggccggg660
gagccgatcgcgcttcagctcagcgcctttcctggtacttgaagggagatcgaccgtgtt720
atattcgctttattgacttcgaataatacatggttgatcttttctcagtatcaaatctca780
ccttggaggacccgttggagatgaagcccttttgagggtaggagcaggacgggtgcttt839