本发明属于化妆品领域，涉及余甘子提取物的制备方法及具有祛斑美白活性的余甘子提取物的制备方法。
背景技术：
余甘子(Phyllanthus emblica L.)是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属(Phyllanthus)的果实，别名滇橄榄、油甘子、山油甘、庵摩勒、牛甘果、喉甘子、杨甘、回甘子等。余甘子原产于印度、泰国、菲律宾、马来西亚、巴基斯坦等，以印度和中国的产量最大。余甘子在我国主要分布于云南、广西、广东、福建、贵州、四川、台湾、海南等省区，以云南、福建产量最大。余甘子喜光照，能很好地耐干旱，因此，对热带、亚热带干热河谷生态环境有很好的适应性。在我国金沙江干热河谷地带较好的满足了上柱条件，余甘子的自然群落大面积分布于此。该植物根系发达，能很好的防沙固土，对防止水土流失，改善生态环境有积极的作用。因此，余甘子资源丰富，且其生长或栽培有利于生态环境，适于开发利用。
余甘子临床使用历史悠久且安全性好。收载于《中国药典》，属于藏族习用药，具有“清热凉血，消食健胃，生津止咳”的功效，“用于血热血搬，消化不良，腹胀，晐嗽，喉痛，口干”等病症。余甘子药食两用，收载于卫生部2002年公布的《既是食品又是药品的物品名单》，在民间有生食余甘子鲜果的习惯。
现代植物化学研究表明，余甘子主要含有以下化学成分：多酚类、有机酸类、糖类、维生素、氨基酸等物质以及微量元素Zn、Mn、Fe、Ca和Se等，其中，其显著特征是含有大量的多酚及丰富的维生素C。多酚类物质主要有：葡萄糖没食子鞣质(glucogallin)、没食子酸(gallic acid)、并没食子酸(e11agic acid)、鞣云实精(corlagin)、原诃子酸(terchebin)、诃子酸(chebulinc acid)、3,6-二没食子酰葡萄糖苷(3,6-digalloylglucose)，3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4,5-dihydroxy-bezoic acid)、粘酸(mucic acid)和油柑酸(phyllemblic acid)等。现代药理学研究表明，余甘子主要具有抗氧化、抗病原微生物、抗诱变、抗致畸、抗肿瘤、降脂、降血压等作用。
目前，已有国外专利报道余甘子鞣质类成分具有较好祛斑美白活性。我国余甘子资源丰富，且该植物药食两用，安全无毒，为祛斑美白类产品开发提供了良好的条件。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可工业化生产的、具有祛斑美白活性的余甘子提取物的制备方法，所得的余甘子提取物有效成分总鞣质含量高、杂质成分总黄酮含量低，外观颜色浅，安全无毒，能很好的满足祛斑美白的市场需求。
为实现上述目的，本发明提供了一种具有祛斑美白活性的余甘子提取的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：
一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，所述的余甘子提取物的制备方法包括以下步骤：
余甘子果，低温提取，过滤，滤液低温浓缩，浓缩液加水溶解，固液分离，澄清水液上大孔吸附树脂纯化，经不同浓度乙醇洗脱，收集特定醇度的乙醇洗脱液，浓缩，干燥，检测合格，包装，得余甘子提取物。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，低温提取工艺包括：①提取方式为余甘子果，破碎或不破碎，低温提取，特别是采用冷浸、温浸、超声的一种或数种方法的组合进行提取；②提取溶媒为丙酮、甲醇、乙醇、水的一种或数种溶媒的任意组成比例，特别是40％～70％的丙酮水溶液、40％～70％的乙醇水溶液、40％～70％的甲醇水溶液；③溶媒用量为余甘子重量的3～100倍/次，特别是余甘子重量的5～30倍；④提取时间为0.5～24h/次；⑤提取次数为1～5次，特别是1～3次。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，低温浓缩工艺包括：①浓缩温度为30～70℃，特别是40～60℃；②浓缩方式为低温度浓缩的设备进行提取液浓缩，特别是降膜浓缩、微滤膜浓缩、超滤膜浓缩、纳滤膜浓缩、反渗透膜浓缩的设备；③浓缩终点为浓缩至无有机溶剂或体积约余甘子重量的1～3倍。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，固液分离工艺包括：浓缩液加纯化水至余甘子重量的2～5倍，混匀，使浓缩液中的沉淀充分溶解于水中，然后进行固液分离操作，使用离心设备离心、板框过滤、微滤膜设备过滤、滤布过滤的方式，特别是离心设备离心，收集无沉淀的水液。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，纯化工艺包括：①大孔吸附树脂种类：使用大极性或中小极性的大孔吸附树脂，如HPD826、LS305、HPD100、LX～68M、JKSB-1等；②大孔吸附树脂前处理：使用高浓度乙醇或经碱、酸、乙醇等处理干净；③上样量：上样量为大孔吸附树脂的0.1～5倍(w/v)余甘子所得到的澄清水液；④洗脱：上样后的大孔吸附树脂柱，依次经纯化不同浓度乙醇洗脱，收集10％～80％乙醇洗脱液，特别是10％～40％的乙醇洗脱液。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，乙醇洗脱液浓缩工艺包括：①上柱洗脱所得的乙醇洗脱液低温浓缩；②浓缩温度：以防止高温破坏提取液化学成分，低温范围为10～70℃，特别是20～60℃；③浓缩方式：使用能低温度浓缩的设备进行提取液浓缩，特别是降膜浓缩、微滤膜浓缩、超滤膜浓缩、纳滤膜浓缩、反渗透膜浓缩等设备；④浓缩终点：浓缩至相对密度1.0～2.0，特别是1.05～1.20。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，干燥工艺为采用微波干燥、真空冷冻干燥、减压干燥、喷雾干燥等一种或数种干燥方式的组合进行浓缩液的干燥，特别是使用真空冷冻干燥、喷雾干燥、微波干燥等一种或数种方式的组合进行浓缩液的干燥。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，余甘子果及药液直接接触的水为去离子水或纯化水。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，余甘子提取物的最终形式为粉末或干膏。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，余甘子提取物总鞣质含量大于30％，特别是在40～80％，总黄酮含量小于5％，特别是小于1％。
所述的一种祛斑美白余甘子提取物的制备方法，其特征在于，余甘子提取物具有祛斑美白的功效且无皮肤刺激性，可作为主要活性成分用在皮肤增亮、美白或祛斑的化妆品中。
本发明具有以下优点：
(1)生产工艺稳定、可行，适于工业化大生产。
(2)按上述工艺制备的余甘子提取物祛斑美白活性显著。
(3)产品源自药食两用的余甘子果，未添加任何外源性成分，使用安全。
(4)质量标准科学合理，对在效成分(总鞣质)、杂质成分(总黄酮)均有有效的控制和检测。
(5)生产工艺先进，使用了适于热敏性物料的提取浓缩干燥方法，如超声波或微波提取、膜浓缩、降膜浓缩、真空冷冻干燥、微波干燥、喷雾干燥等。
附图说明：
图1余甘子提取生产工艺流程简图
具体实施方式
下面结合实例进一步详细说明本发明。尽管上述对本发明做了详细说明，但本发明不限于此实例，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。
实施例1
余甘子鲜果100kg，饮用水洗净，粗碎，加40％乙醇超声提取设备内提取1次，提取时间120min、40％乙醇用量为30倍量(V/W)，提取液100目滤布滤过，滤液于降膜浓缩设备中，60℃减压浓缩至无醇，浓缩液加纯化水溶解至余甘子重量的3倍量，管式离心机离心，离心液加在经酸碱、95％乙醇处理且纯化水平衡好的LX-68M大孔吸附柱上(余甘子重量为大孔吸附柱体积的2倍)，上柱流速为1BV/h，然后经纯化水、10％乙醇、80％乙醇洗脱各3BV以1BV/h流速洗脱，收集80％乙醇洗脱液，于降膜浓缩器中60℃减压避光浓缩至1.10(40℃)，浓缩液喷雾干燥(进风温度：170℃，雾化频率：300Hz，出风温度：100～110℃)，得余甘子提取物干膏粉，置低密度聚乙烯袋包装成500g/袋，再置阴凉、干燥、通风处保存。干膏粉总鞣质含量75.3％，总黄酮含量4.5％。
实施例2
余甘子干果800kg，粗碎，加70％丙酮于回流提取罐内50℃温浸提取2次，每次60min、每次15倍量(V/W)，提取液100目滤布滤过，滤液于降膜浓缩设备中，40℃减压浓缩至丙酮，浓缩液加纯化水溶解至余甘子重量的2倍量，200目滤布过滤，滤液加在经95％乙醇处理且纯化水平衡好的LS305大孔吸附柱上(余甘子重量为大孔吸附柱体积的1倍)，上柱流速为1.5BV/h，然后经20％乙醇、70％乙醇洗脱各3BV以1BV/h流速洗脱，收集70％乙醇洗脱液，于双效缩器60℃减压避光浓缩至1.20(50℃)，浓缩液真空冷冻干燥(预冻温度：40℃，预冻时间：60min；然后逐步升高温度进行升华，得余甘子提取物干膏，粉碎，过100目筛，得干膏粉，置低密度聚乙烯袋包装成5kg/袋，再置阴凉、干燥、通风处保存。干膏粉总鞣质含量55.9％％，总黄酮含量1.5％。
实施例3
余甘子干果700kg，粗碎，加50％甲醇于提取罐内冷浸提取3次，每次24h、每次20倍量(V/W)，提取液滤过，滤液于双效浓缩器中，50℃减压浓缩至无甲醇(酒精计测定冷凝液计数为0)，浓缩液加纯化水溶解至余甘子重量的5倍量，离心，离心液加在经酸碱处理且纯化水平衡好的HPD826大孔吸附柱上(余甘子重量为大孔吸附柱体积的0.5倍)，上柱流速为0.5BV/h，然后经20％、50％乙醇洗脱各3BV以1BV/h流速洗脱，收集50％乙醇洗脱液，于反渗透膜中缩至1.20(20℃)，浓缩液50℃真空减压干燥，得余甘子提取物干膏，粉碎，过200目筛，得干膏粉，置棕色玻璃瓶内包装成5kg/瓶，再置阴凉、干燥、通风处保存。干膏粉总鞣质含量70.3％，总黄酮含量4.1％。
实施例4
余甘子干果500kg，粗碎，加纯化水超声提取3次，每次60min、每次50倍量(V/W)，提取液离心，离心液于纳滤膜设备中浓缩至余甘子重量的3倍量，然后加在经95％乙醇处理且纯化水平衡好的JKSB-1大孔吸附柱上(余甘子重量为大孔吸附柱体积的1倍)，上柱流速为1BV/h，然后经10％乙醇、40％乙醇洗脱各3BV以1BV/h流速洗脱，收集40％乙醇洗脱液，于纳滤膜中缩至1.10(25℃)，浓缩液微波干燥，得余甘子提取物干膏，粉碎，过80目筛，得干膏粉，置不锈钢容器内包装成10kg/瓶，再置阴凉、干燥、通风处保存。干膏粉总鞣质含量40.7％，总黄酮含量0.9％。
实施例5
余甘子鲜果1000kg，粗碎，加50％乙醇超声提取设备内提取2次，提取时间60min、40％乙醇用量为15倍量/次(V/W)，提取液100目滤布滤过，滤液于降膜浓缩设备中，50℃减压浓缩至无醇，浓缩液加纯化水溶解至余甘子重量的3倍量，管式离心机离心，离心液加在经酸碱、95％乙醇处理且纯化水平衡好的LX-68M大孔吸附柱上(余甘子重量为大孔吸附柱体积的2倍)，上柱流速为1BV/h，然后经10％乙醇、50％乙醇洗脱各3BV以1BV/h流速洗脱，收集50％乙醇洗脱液，于降膜浓缩器中50℃减压避光浓缩至1.15(40℃)，浓缩液喷雾干燥(进风温度：170℃，雾化频率：300Hz，出风温度：100～110℃)，得余甘子提取物干膏粉，置低密度聚乙烯袋包装成500g/袋，再置阴凉、干燥、通风处保存。干膏粉总鞣质含量65.3％，总黄酮含量1.2％。
实施例6祛斑美白活性评价(黑色素抑制试验)
此试验对实施例5制备的余甘子提取物美白活性进行评价。操作如下：①细胞培养：选择传统选择传代培养的B16-F10细胞，经0.25％膜蛋白酶消化，用含有8％胎牛血清的DMEM高糖培养液传代，置于37℃、5％CO2饱和湿度环境的培养箱中进行培养。2d换液一次，每一次试验取自同一传代细胞。②受试样品对B16～F10细胞中黑色素的抑制试验：待B16-F10细胞生长至80％～90％时，用0.25％的膜酶将细胞消化成单个细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×105Cells·mL-1。每孔2mL接种植于6孔培养板中，将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。24h后弃除细胞上清培养液，试验分为空白组、溶媒对照组、阳性对照组和余甘子供试品组。空白组:每孔加入3mLDMEM培养液；阳性对照组和余甘子供试品组:将余甘子供试品及曲酸用DMEM培养液稀释至1、5、20μg·mL-1，余甘子供试品用DMEM培养液稀释至0.2、1、5μg·mL-1，每孔加入3mL；溶媒对照组:每孔加入3mL含相应体积DMSO的DMEM培养液。每个浓度平行3个复孔。作用B16-F10细胞48h后弃上清液，用PBS清洗细胞2次，每孔用0.5mL浓度为1mol·L-1的NaOH溶解细胞内的黑色素，待黑色素完全溶解后于450nm处测量吸光光度值。按下列公式计算黑色素相对含量。黑色素含量/％＝受试组平均OD值/空白组平均OD值×100。③结果：与空白组比，阳性对照(曲酸)在1-20μg·mL-1内对B16-F10细胞中黑色素的表达具有明显的抑制作用，差别具有统计学意义(P＜0.01)；余甘子提取物在0.2-5μg·mL-1对B16-F10细胞中黑色素的表达具有明显的抑制作用，差别具有统计学意义(P＜0.01)。
实施例7皮肤刺激性试验
此试验对实施例5制备的余甘子提取物毒性进行评价：参照2007年版卫生部《化妆品卫生规范》中的皮肤刺激性/腐蚀性试验规范，评价余甘子提物对家兔皮肤局部是否有刺激性及其刺激强度。方法：将余甘子提取物粉末配制成混悬液，然后涂抹于家兔完整皮肤上，每天一次，连续涂抹14d，每天观察症状表现。结果：余甘子提物对家兔多次皮肤刺激性试验的皮肤反应每天每只动物积分均值为0.05，根据判定标准判定余甘子提物对家兔皮肤无刺激性。结论：余甘子提物样品对家兔皮肤无刺激性。