本发明涉及雪莲培养物处理方法技术领域，尤其是一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法。
背景技术：
雪莲属于菊科，凤毛菊属植物，为多年生草本珍稀中草药，含有金合欢素、粗毛豚草素、芦丁、槲皮素等多种黄酮类成分，具有散寒除湿、活血通经、强筋助阳、抗炎镇痛等功能，可治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、麻疹不透、肺寒咳嗽、抗衰老及抑制癌细胞增生等症。近年来雪莲的药用价值和保健作用得到市场的肯定，市场需求量大增，大量的掠夺性采挖致使野生雪莲资料严重匮乏，储量急剧减少，少数种类已处于灭绝的边缘。
细胞培养是获得雪莲中主要次生代谢物的一条途径，目前在雪莲愈伤组织及次生代谢产物调控方面已有大量报送，已筛选出高产细胞系、建立了代谢调控方法。对雪莲培养物中黄酮的提取一般采用室温溶剂提取法，提取方法简单，但存在提取时间长、效率低等问题。常规的对雪莲愈伤组织中总黄酮的提取方法还包括加热回流提取法、索氏提取法以及超声提取法等。在使用单独的提取方法对雪莲愈伤组织进行总黄酮的提取和富集时，还会有黄酮类成分提取不充分等问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，能够对雪莲愈伤组织中的总黄酮成分能够进行充分的提取，并能减少有机溶剂的用量。
为解决上述技术问题，本发明的目的是这样实现的：
本发明所涉及的的一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，依次包括如下步骤：
步骤a、将雪莲培养物干燥并粉碎至100-150目，置入超临界萃取釜中，所采用的超临界流体为co2或co2挟带乙醇，进行预处理，动态萃取，控制萃取釜压力20-30mpa，萃取温度40-60℃，分离压力6-10mpa，分离温度30-50℃，时间为60-150分钟后停止，减压卸料后，进行过滤得到雪莲黄酮第一提取液和余渣；所述的超临界流体中co2所挟带的乙醇浓度为70-95%；
步骤b、对步骤a所得到的余渣加入至乙醇溶液中进行微波萃取工艺处理，所使用的微波的波长为200-500nm；再次过滤得到雪莲黄酮第二提取液和余渣；
步骤c、对步骤b所得到原余渣加入至乙醇溶液中进行超声波处理，再将过滤得到雪莲黄酮第三提取液；
步骤d、将雪莲黄酮第一提取液、雪莲黄酮第二提取液和雪莲黄酮第三提取液混合得到雪莲黄酮提取液；将雪莲提取液浓缩至乙醇浓度为0-15%体积比，进行大孔吸附树脂柱吸附；
步骤e、将吸附黄酮后的大孔吸附树脂依次用0％-95％乙醇洗脱，收集30％-50％洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。
作为上述方案的进一步说明，步骤b和步骤c中，所使用的乙醇溶液的浓度为70-95%；所述的乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的10-20倍。
作为上述方案的进一步说明，步骤b中，所使用的微波萃取的处理时间为10-30min。
作为上述方案的进一步说明，步骤d中，所用的大孔吸附树脂为hpd700或hpd400或hpd500；大孔吸附树脂依次以2-8bv/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱。
作为上述方案的进一步说明，步骤e中，吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得40％-50％雪莲总黄酮提取物。
本发明的有益效果是：本发明所涉及的基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，与现有的使用一种提取工艺的雪莲总黄酮的提取方法相比，使用了超临界提取工艺，使得处理条件较为温和，可以使雪莲中易挥发易分解成分无损原料利用率高。还使用了微波和超声波提取方法继续对经超临界提取工艺处理后的余渣进行处理，进一步的提取原料中的黄酮成分，进一步提高原料的利用率，且提取工艺简单易于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
所选取天山雪莲愈伤组织是由中国科学院植物研究所赵德修院士所培养的新疆雪莲紫红色细胞系。是采用新疆雪莲的种胚或由种子萌发的无菌苗为外植体，经诱导愈伤并进行反复继代培养，从分离的细胞系中选取颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团料状的培养物，所得到。愈伤组织是原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。
天山雪莲愈伤组织的大规模培养方法是将上述细胞系采用液体摇床培养的方法制种，并将所制得的种子在固定培养基上进行固体培养，并选择生产旺盛、颜色鲜艳、紫红色特征的培养物留种，用于液体摇床培养，其余的收获，获得培养物。在液体摇床培养所用培养基为添加0.1-0.5mg/l6-ba和1-5mg/lnaa的ms液体培养基，接种量为3-6%，在ph值为5.2-5.8，温度为22-27℃，摇床速度为100-120rpm，培养8-10天，2000lax光照10-12小时。所使用的固体培养基为1-3mg/l2,4-d和0.1-0.5mg/l6-ba（ph值为5.2-5.8，琼脂5-7g/l，蔗糖30g/l）的ms培养基。
本发明所涉及的一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，先将大规模培养的雪莲愈伤组织干燥，并粉碎至100-150目，放置入超临界萃取釜中进行预处理，进行动态萃取。
在本步骤中所采用的超临界流体为co2或co2挟带乙醇。控制萃取釜压力20-30mpa，萃取温度40-60℃，分离压力6-10mpa，分离温度30-50℃，时间为60-150分钟后停止。在超临界萃取工艺处理后，进行减压卸料，并进行过滤，可得到雪莲黄酮第一提取液和余渣。在使用co2挟带乙醇作为超临界流体时，超临界流体中co2所挟带的乙醇浓度为70-95%。
在将上述步骤所得到的余渣加入至乙醇溶液中进行微波萃取工艺处理，所使用的微波的波长为200-500nm，并再次过滤，可得到雪莲黄酮第二提取液和余渣。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为70-95%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的10-20倍。在此步骤中所使用的微波萃取的处理时间为10-30min。
将上述步骤所得到余渣加入至乙醇溶液中进行超声波处理，再将过滤得到雪莲黄酮第三提取液和余渣，并将该步所得到的余渣倒掉处理。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为70-95%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的10-20倍。
将雪莲黄酮第一提取液、雪莲黄酮第二提取液和雪莲黄酮第三提取液混合可得到雪莲黄酮提取液；将雪莲提取液浓缩至乙醇浓度为0-15%体积比，并进行大孔吸附树脂柱吸附。所用的大孔吸附树脂为hpd700或hpd400或hpd500。
大孔吸附树脂的预处理：hpd型大孔吸附树脂在使用以前，用10％的氯化钠溶液浸泡24小时，然后用2倍量的氯化钠溶液冲洗，并用5倍量去离子水冲洗，以便除去痕量的防腐剂和残留的单体化合物；树脂装柱后，用乙醇冲洗，洗去残留的少量有机物和致孔剂，再用去离子水冲洗；然后用2％氢氧化钠溶液冲洗，除去树脂中碱溶性杂质，用去离子水冲洗；再用盐酸溶液冲洗，除去酸溶性杂质，用去离子水冲洗至近中性；
将吸附黄酮后的大孔吸附树脂依次以2-8bv/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇浓度为30％-50％时的洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得雪莲总黄酮提取物。
实施例一
本实施例所涉及的一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，先将大规模培养的雪莲愈伤组织干燥，并粉碎至100目，放置入超临界萃取釜中进行预处理，进行动态萃取。
在本步骤中所采用的超临界流体为co2。控制萃取釜压力20mpa，萃取温度60℃，分离压力6mpa，分离温度30℃，时间为30分钟后停止。在超临界萃取工艺处理后，进行减压卸料，并进行过滤，可得到雪莲黄酮第一提取液和余渣。
在将上述步骤所得到的余渣加入至乙醇溶液中进行微波萃取工艺处理，所使用的微波的波长为200nm，并再次过滤，可得到雪莲黄酮第二提取液和余渣。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为95%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的10倍。在此步骤中所使用的微波萃取的处理时间为30min。由微波发生器所产生的每秒24.5亿次超高频率快速震荡，使得药材几分子间相互碰撞、挤压等，有利用雪莲愈伤组织中黄酮类成分的浸出。
将上述步骤所得到余渣加入至乙醇溶液中进行超声波处理，再将过滤得到雪莲黄酮第三提取液和余渣，并将该步所得到的余渣倒掉处理。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为70%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的10倍。
将雪莲黄酮第一提取液、雪莲黄酮第二提取液和雪莲黄酮第三提取液混合可得到雪莲黄酮提取液；将雪莲提取液浓缩至乙醇浓度为15%体积比，并进行大孔吸附树脂柱吸附。所用的大孔吸附树脂为hpd700。
将吸附黄酮后的大孔吸附树脂依次以2bv/h的流速用50％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇浓度为30％-50％时的洗脱液。吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得雪莲总黄酮提取物。
实施例二
本实施例所涉及的一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，先将大规模培养的雪莲愈伤组织干燥，并粉碎至120目，放置入超临界萃取釜中进行预处理，进行动态萃取。
在本步骤中所采用的超临界流体为co2挟带乙醇。控制萃取釜压力25mpa，萃取温度50℃，分离压力8mpa，分离温度40℃，时间为100分钟后停止。在超临界萃取工艺处理后，进行减压卸料，并进行过滤，可得到雪莲黄酮第一提取液和余渣。在使用co2挟带乙醇作为超临界流体时，超临界流体中co2所挟带的乙醇浓度为70%。
在将上述步骤所得到的余渣加入至乙醇溶液中进行微波萃取工艺处理，所使用的微波的波长为335nm，并再次过滤，可得到雪莲黄酮第二提取液和余渣。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为80%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的15倍。在此步骤中所使用的微波萃取的处理时间为20min。
将上述步骤所得到余渣加入至乙醇溶液中进行超声波处理，再将过滤得到雪莲黄酮第三提取液和余渣，并将该步所得到的余渣倒掉处理。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为80%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的15倍。
将雪莲黄酮第一提取液、雪莲黄酮第二提取液和雪莲黄酮第三提取液混合可得到雪莲黄酮提取液；将雪莲提取液浓缩至乙醇浓度为10%体积比，并进行大孔吸附树脂柱吸附。所用的大孔吸附树脂为hpd400。
将吸附黄酮后的大孔吸附树脂依次以5bv/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇浓度为30％-50％时的洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得雪莲总黄酮提取物。
实施例三
本发明所涉及的一种基于雪莲培养物提取、富集和纯化雪莲总黄酮的方法，先将大规模培养的雪莲愈伤组织干燥，并粉碎至150目，放置入超临界萃取釜中进行预处理，进行动态萃取。
在本步骤中所采用的超临界流体为co2挟带乙醇。控制萃取釜压力30mpa，萃取温度60℃，分离压力10mpa，分离温度30℃，时间为60分钟后停止。在超临界萃取工艺处理后，进行减压卸料，并进行过滤，可得到雪莲黄酮第一提取液和余渣。在使用co2挟带乙醇作为超临界流体时，超临界流体中co2所挟带的乙醇浓度为95%。
在将上述步骤所得到的余渣加入至乙醇溶液中进行微波萃取工艺处理，所使用的微波的波长为200-500nm，并再次过滤，可得到雪莲黄酮第二提取液和余渣。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为95%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的20倍。在此步骤中所使用的微波萃取的处理时间为30min。
将上述步骤所得到余渣加入至乙醇溶液中进行超声波处理，再将过滤得到雪莲黄酮第三提取液和余渣，并将该步所得到的余渣倒掉处理。此步骤中所使用的乙醇溶液的浓度为95%，乙醇溶液的重量为雪莲培养物余渣的20倍。
将雪莲黄酮第一提取液、雪莲黄酮第二提取液和雪莲黄酮第三提取液混合可得到雪莲黄酮提取液；将雪莲提取液浓缩至乙醇浓度为5%体积比，并进行大孔吸附树脂柱吸附。所用的大孔吸附树脂为hpd500。
将吸附黄酮后的大孔吸附树脂依次以8bv/h的流速用0-95％的乙醇溶液洗脱，收集乙醇浓度为30％-50％时的洗脱液，浓缩后即得黄酮固含量为40-50％的雪莲提取物。吸附后的大孔吸附树脂先用浓度为0％-15％乙醇水液梯度洗脱，再用浓度为30％-50％乙醇洗脱，收集30％-50％浓度的乙醇洗脱液，浓缩后得雪莲总黄酮提取物。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。