本发明涉及分子生物分离领域，具体涉及一种熊胆粉滴眼液原液的提取方法。
背景技术：
熊胆粉为黑熊引流胆汁的干燥粉末，其主要化学成分包括胆汁酸结合型牛磺熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、微量胆色素及非胆汁酸类成分蛋白质、肽、微量游离氨基酸、胆固醇、脂肪酸和无机元素。
牛磺熊去氧胆酸(tudca)，是由熊去氧胆酸(udca)的梭基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。牛磺熊去氧胆酸是熊胆汁的有效成分，胆汁酸组合物具有较强的退热、抗菌、止痛镇痉作用，对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。工艺中去除过饱和脂质蛋白应是制剂关键目的，目前现有工艺中针对去脂提纯制备参数随意性较大，醇沉后洗涤技术不达标，制备过程控制不了蛋白变性等不利复杂因素，导致大规模生产用于产品纯度不高。
本发明为了解决现有工艺中蛋白分离技术的缺点，根据胆汁酸中生物分子对温度、浓度、时间的敏感特性，严格限定溶解、醇沉技术参数，达到提取具有生物活性的目的物质牛磺熊去氧胆酸。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明以熊胆粉为原料，提供一种制备工艺简单、分离效果优异的熊胆粉滴眼液原液提取方法。
一种熊胆粉滴眼液原液的提取方法，包括如下工艺步骤：
(1)取1重量份的熊胆粉，研磨成粉末；
(2)熊胆粉水溶液的制备：
另取5～6重量份注射用水，在21℃～25℃或40℃～50℃的温度下边搅拌边加入1重量份熊胆粉末，至完全溶解；
(3)熊胆粉醇沉步骤如下：
将步骤(2)溶液达到18℃～20℃边搅拌边加入，熊胆粉10～12重量份95％乙醇缓慢细流，搅匀，21℃～25℃静置24h，取上清液4℃备用；
或
将步骤(2)溶液降至4℃～6℃边搅拌边加入，熊胆粉10～12重量份95％乙醇缓慢细流，搅匀，4℃～6℃静置24h～48h，取上清液4℃备用；
(4)将步骤(3)剩余沉淀物，再添加10～12重量份95％乙醇洗涤，洗涤液在4℃～6℃的温度下放置2h～6h，取上清液；
(5)合并步骤(3)和(4)的上清液，回收至无醇味，即得。
优选地，步骤(2)中，1重量份的熊胆粉加入5重量份的乙醇。
优选地，步骤(4)中，醇沉残渣洗涤前温度降至20℃以下。
优选地，步骤(4)中静置时间为3-5h。
优选地，步骤(4)中洗涤液的静置温度为4℃。
与国家药品标准相比，本发明设定的溶解剂醇沉液浓度、温度、时间对熊胆粉提取原液进行熊胆粉杂质峰指纹图谱定性定量分析，大幅去除了脂类蛋白等无效成分，保证提取液中主药成份牛磺熊去氧胆酸的含量和活性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种熊胆粉滴眼液原液的提取方法，包括如下工艺步骤：
(1)将已称量好的熊胆粉原料28g，研磨成100目粉末。
熊胆粉原料呈结晶片状，类似高聚体结构，自身具有强吸附性，遇水相互吸附脱水降低水溶解效果，因此将其研磨成粉末状，可以增加与水分子接触面积，达到完全溶解。
(2)另取140ml注射用水45℃边搅拌边加入28g熊胆粉末，至完全溶解，从而制备成熊胆粉水溶液。
熊胆粉中含纤维蛋白原90％、粘蛋白67.31％大部分为脂类物质，合理控制温度是去除熊胆粉中过饱和脂蛋白提取工艺的关键技术。在40℃～50℃的温度下溶解，避免高温溶解破坏活性组份，更好地保持分子结构和含量稳定状态。在21℃～25℃的温度下溶解，胆汁酸中大部分蛋白质在此温度都能够充分溶解，有效成分都能保持稳定状态，不影响后续蛋白分离。本实施例中采用，
注射用水边搅拌边加入熊胆粉末，增加氧气在溶解物质分子间快速释放，破坏熊胆粉脱水吸附的不良特性，迫使粒子与水分子之间增加接触面积，提高蛋白质溶解度。
(3)醇沉前提取液18℃时缓慢细流加入95％乙醇280ml搅拌均匀，21℃静置24h，取上清液4℃冷藏备用。静置过程中注意控制环境温度，不宜过高，不宜摇晃，否则影响蛋白分离沉淀效果。
该步骤中，将95％乙醇加入熊胆粉水溶液中，形成的混合液中乙醇仅在比较窄浓度下，形成溶解度差异而分离蛋白，完成首次沉淀。
醇沉前将提取液控制在低温条件下，能避免因加入95％乙醇造成局部浓度过大，引起蛋白质变性失活。
待醇沉液完全溶解后，优选低温静置条件，使得各组份物在醇中不溶性粘质蛋白和纤维蛋白等首先形成沉淀物。
上清液4℃下冷藏，可以使上清液中分离不完全的蛋白絮状物4℃低温再次聚合形成蛋白质结合体再次沉淀，提高上清液澄明度。
(4)将步骤(3)醇沉液残渣降至20℃以下，再添加280ml95％乙醇进行洗涤，搅拌均匀，洗涤液5℃静置2.0h后取上清液。
洗涤放置温度＞20℃操作，乙醇洗涤液形成上清时间过长，接近首次醇沉时间，严重影响上清液有效成分含量，药用价值不高，调至低温迫使蛋白质大分子表面水层迅速脱水、聚合成沉淀物，缩短洗涤时间避免有效成分过度被去除。
(1)合并步骤(3)和(4)的上清液，回收至无醇味。
实施例2
该实施例的方法中，步骤(2)中，制备熊胆粉水溶解液温度为23℃，步骤(3)中醇沉前提取液温度为4℃，醇沉液静置温度为4℃，醇沉液静置时间48h，其余与实施例1相同。
实施例3
该实施例的方法中，步骤(2)中，制备熊胆粉水溶解液温度为45℃，步骤(3)中醇沉前提取液温度为18℃，醇沉液静置温度为5℃，醇沉液静置时间48h，其余与实施例1相同。
实施例4
该实施例的方法中，步骤(2)中，制备熊胆粉水溶解液温度为21℃，步骤(3)中醇沉前提取液温度为18℃，醇沉液静置温度为21℃，其余与实施例1相同。
对比例1
取熊胆粉5.6g，加水28ml，搅匀，加乙醇56ml，搅拌，静置24小时，取上清液备用。残渣再加乙醇56ml洗涤，合并两次乙醇液。回收至无醇味，即可。
对比例2
将已称量好的熊胆粉1.12kg原料溶于5600ml的注射用水中，用玻璃棒搅拌均匀至彻底溶解并且溶液温度在50-60℃时加入(缓慢细流)乙醇11200ml进行醇沉，静止放置，放置时间不低于24小时。利用硅胶管将上清液引流提出，残渣再加入11200ml的95％乙醇搅拌均匀后静止放置。放置时间不低于12小时以上后，再一次提取醇沉后的上清液至双层反应釜中，弃掉残渣。
对上述实施例和比较例得到的产品进检测，检测结果如下表：
从上表中可以看出，本发明通过限定严格的工艺条件，使得胆汁酸含量大幅提升，大幅去除了脂类蛋白等无效成分。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。