本发明涉及生物材料的技术领域，具体涉及一种表面载肝素的镁合金材料及其制备方法和应用，利用该方法对镁合金进行表面改性，可以赋予镁合金良好的耐蚀性能和血液相容性。
背景技术：
镁及其合金材料由于具有良好的力学性能和可生物降解性能，已经成为生物材料的研究热点。镁合金植入后可以被人体吸收，避免了二次手术的问题，在骨科医疗器械以及心血管支架方面获得了广泛的研究。然而，镁合金化学性质活泼，在人体复杂生理条件下降解较快，容易在植入周围组织产生过量氢气形成气泡从而延迟组织愈合；同时，镁合金降解还会引起周围组织碱性升高以及二次腐蚀产物聚集等副反应，也会导致组织的延迟愈合甚至导致植入失败。另外，镁合金生物相容性较差，据报道，纯镁的溶血率高达50％以上；同时，由于降解较快，细胞在镁合金表面生长十分困难，因此，组织生长十分困难，从而限制了镁合金的临床应用。一般来说，镁合金的腐蚀降解都是从表面开始发生，同时，镁合金植入人体后首先发生的是镁合金表面与植入周围环境的界面相互作用，因此，通过表面改性来同时提高镁合金的耐生理腐蚀性能和生物相容性，对其临床应用具有十分重要的意义。
氧化石墨烯(go)是一种含有多种化学功能基团的碳纳米材料，由于其巨大的比表面积、良好的机械性能和生物相容性，在生物材料与组织工程领域具有巨大的应用前景。将go固定在镁合金材料表面或者与其它材料在镁合金表面构建复合涂层，都可以显著提升镁合金的耐蚀性能，并在一定程度上提高镁合金的生物相容性。壳聚糖具有良好的可降解性能和生物相容性，广泛应用于生物材料及组织工程的研究，将壳聚糖固定在镁合金材料表面也可以提高其耐蚀性能，从而对其电化学降解行为和生物相容性进行调控。因此，利用壳聚糖对go进行功能化，并进一步固定在镁合金表面将赋予镁合金良好的耐蚀性能和生物相容性。肝素是一种具有优异血液相容性的多糖物质，广泛应用于血液接触生物材料的表面改性，研究表明，肝素不仅可以提高材料的血液相容性，也可以在一定程度上促进内皮细胞的生长，甚至可以选择性促进内皮细胞生长，因此，将肝素装载在镁合金表面，通过肝素的可控释放将赋予镁合金良好的血液相容性和促内皮细胞生长性能。
技术实现要素：
发明目的：为克服现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种在医用镁合金表面制备载肝素的生物活性涂层的制备方法，通过该方法可以在镁合金表面构建一种能够释放肝素的多功能生物活性涂层，同时提高镁合金在生理条件下的耐蚀性能和生物相容性。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种表面载肝素的镁合金材料及其应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种表面载肝素的镁合金材料，所述表面载肝素涂层的镁合金材料从下至上包括表面固定有(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料、壳聚糖功能化的氧化石墨烯涂层和肝素涂层。
其中，所述表面固定有(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料是通过将经过表面化学处理的镁合金浸没到(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液中，振荡反应后真空热处理，然后样品分别用乙醇和蒸馏水充分清洗后干燥，得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料。
其中，所述壳聚糖功能化的氧化石墨烯是通过将羧基化氧化石墨烯与壳聚糖超声分散后，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺溶液振荡反应后离心获得壳聚糖功能化的氧化石墨烯(gocs)。
本发明内容还包括一种表面载肝素的镁合金材料的制备方法，包括以下步骤：
1)采用壳聚糖对羧基化氧化石墨烯进行改性获得壳聚糖功能化的氧化石墨烯(gocs)；
2)对镁合金表面进行化学处理；
3)将步骤2)处理后的镁合金表面自组装固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料；
4)将步骤1)得到的gocs接枝到步骤3)得到的表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料上得到表面固定gocs的镁合金材料；
5)将步骤4)得到的表面固定gocs的镁合金材料浸没到肝素溶液中充分吸附后清洗晾干，即得表面载肝素涂层的镁合金材料。
其中，所述步骤1)中的羧基化氧化石墨烯的制备方法如下：将氧化石墨烯超声分散在0.01-0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，加入氯乙酸，搅拌反应2-4小时，将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质，得到羧基化氧化石墨烯；
其中，所述步骤1)的gocs制备方法为，羧基化氧化石墨烯和壳聚糖超声分散在mes缓冲溶液中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺溶液，振荡反应2-4小时得到混合溶液，将混合溶液反复离心水洗除去未反应物质，得到gocs。其中，所述壳聚糖浓度为5～10mg/ml；
其中，所述步骤2)的镁合金表面进行化学处理工艺条件为：将抛光的镁合金样品浸没到nah2po4、nano3和hf的混合溶液中处理12-24小时，处理温度为50-80℃，所述混合溶液中nah2po4浓度为30-60g/l，nano3浓度为10-20g/l，hf浓度为5-10g/l。
其中，所述步骤3)的具体步骤为：将步骤2)处理后的镁合金样品浸没到(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液中振荡反应12h-24h，样品取出后真空热处理后分别用乙醇和蒸馏水充分清洗后干燥备用，即得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料。其中，(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液的溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜或丙酮中的一种，所述(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液浓度为2-20mm。
其中，所述步骤4)的具体步骤为：将步骤3)得到的表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料浸没到gocs溶液中继续反应4-8小时，清洗干燥后得到表面固定gocs的镁合金。该gocs溶液浓度为1-10mg/ml，是将步骤1)制备的gocs溶解在水中获得。
其中，所述步骤5)的具体步骤为：将步骤4)得到的表面固定gocs的镁合金材料浸没到肝素溶液中充分吸附10-60分钟，清洗晾干获得表面载肝素的镁合金材料，其中，肝素溶液的浓度为1-10mg/ml。
本发明内容还包括所述的表面载肝素的镁合金材料在制备医疗器械方面的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用的镁合金表面改性方法不仅可以提高镁合金的耐蚀性能，也可以显著提升镁合金的生物相容性，特别是表面装载大量肝素，可以显著提高材料的血液相容性。
(2)本发明采用了壳聚糖功能化的氧化石墨烯装载肝素，利用了氧化石墨烯的巨大比面积和与肝素的疏水性相互作用，以及正电荷特性的壳聚糖与负电荷肝素的静电相互作用，因此，不仅可以保持肝素的生物活性，也大大提高了肝素的装载量。
(3)由于化学转化层的良好耐蚀性能、gocs对镁合金表面的覆盖作用、壳聚糖的促内皮细胞生长作用、以及肝素优异的抗凝血性能和选择性促内皮细胞生长功能，发明构建的多层膜具有多功能生物活性特性。
附图说明
图1为本发明中gocs的制备路线；
图2为本发明的载肝素涂层的制备技术路线；
图3原始镁合金(左)及gocs/肝素改性的镁合金表面，可以明显看出，表面改性后镁合金有大量的石墨烯片层结构；
图4不同镁合金样品的动电位扫描极化曲线，可以看出，表面固定gocs后，材料的耐蚀性能得到提高，装载肝素后腐蚀速度未发生明显变化；
图5未改性及改性镁合金的部分凝血活酶时间，可以看出，表面装载肝素后，与对照样品比较，凝血时间明显延长，显示抗凝血性能得到显著提高。
具体实施方式
以下通过实施例来具体说明本发明，这些实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1表面载肝素的镁合金材料的制备
1、采用壳聚糖对羧基化氧化石墨烯进行改性获得gocs：
1)将氧化石墨烯超声分散在0.01mol/l的氢氧化钠溶液中获得5mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入0.01mol氯乙酸，搅拌反应2-4小时，将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质得到羧基化氧化石墨烯(go-cooh)；go-cooh溶于水中即得go-cooh溶液，配制的go-cooh溶液的浓度为1mg/ml；
2)将1mg/ml的go-cooh溶液及壳聚糖(cs，5mg/ml)超声分散在mes缓冲溶液中(2-吗啉乙磺酸缓冲液，调节溶液ph为6左右)，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc，10mm)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs，10mm)溶液，振荡反应2-4小时，将溶液反复离心水洗除去未反应物质，得到壳聚糖功能化的氧化石墨烯(gocs)；将gocs溶解在水中获得gocs溶液，配制的gocs溶液的浓度为1mg/ml。
2、镁合金表面化学处理的工艺为：将抛光的镁合金样品浸没到nah2po4(30g/l)、nano3(10g/l)和hf(5g/l)的混合溶液中处理12小时，处理温度为50℃。
3、表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料的制备：
将步骤2处理后的镁合金样品浸没到(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液(2mm，溶剂为甲苯)中振荡反应12h，样品取出后100℃下真空热处理12小时，样品分别用乙醇和蒸馏水充分清洗后干燥备用，得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料。
4、表面固定gocs的镁合金材料的制备；
将步骤3得到的表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料浸没到1mg/ml的gocs溶液中继续反应4小时，样品清洗干燥后得到表面固定gocs的镁合金材料。
5、表面载肝素的镁合金材料的制备：
将表面固定gocs的镁合金材料浸没到10mg/ml的肝素溶液中，充分吸附20分钟后清洗晾干，得到载肝素的生物活性涂层即表面载肝素的镁合金材料。
实施例2表面载肝素的镁合金材料的制备
1、采用壳聚糖对羧基化氧化石墨烯进行改性获得gocs溶液：
1)将氧化石墨烯超声分散在0.1mol/l的氢氧化钠溶液中获得5mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入0.03mol氯乙酸，搅拌反应2-4小时，将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质得到羧基化氧化石墨烯(go-cooh)；go-cooh溶于水中即得go-cooh溶液；配制的go-cooh溶液的浓度为5mg/ml；
2)将5mg/ml的go-cooh溶液及壳聚糖(cs，10mg/ml)超声分散在mes缓冲溶液中(调节溶液ph为6左右)，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc，10mm)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs，10mm)溶液，振荡反应2-4小时，将溶液反复离心水洗除去未反应物质，得到壳聚糖功能化的氧化石墨烯(gocs)；将gocs溶解在水中获得gocs溶液，配制的gocs溶液的浓度为5mg/ml。
2、镁合金表面化学处理的工艺为：将抛光的镁合金样品浸没到nah2po4(60g/l)、nano3(20g/l)和hf(10g/l)的混合溶液中处理24小时，处理温度为80℃。
3、表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料的制备：
将步骤2)处理后的镁合金样品浸没到(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液(10mm，溶剂为丙酮)中振荡反应24h，样品取出后100℃下真空热处理12小时，样品分别用乙醇和蒸馏水充分清洗后干燥备用，得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料。
4、表面固定gocs的镁合金材料的制备；
将步骤3)得到的表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料浸没到5mg/ml的gocs溶液中继续反应8小时，样品清洗干燥后得到表面固定gocs的镁合金材料。
5、表面载肝素的镁合金材料的制备：
将表面固定了gocs的镁合金材料浸没到10mg/ml的肝素溶液中，充分吸附1小时后清洗晾干，得到载肝素的生物活性涂层即表面载肝素的镁合金材料。
实施例3表面载肝素的镁合金材料的制备
1、采用壳聚糖对羧基化氧化石墨烯进行改性获得gocs：
1)将氧化石墨烯超声分散在0.05mol/l的氢氧化钠溶液中获得5mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入0.05mol氯乙酸，搅拌反应2-4小时，将溶液反复离心水洗至中性以除去杂质得到羧基化氧化石墨烯(go-cooh)，go-cooh溶于水中即得go-cooh溶液；配制的go-cooh溶液的浓度为3mg/ml；
2)将3mg/ml的go-cooh溶液及壳聚糖(cs，7.5mg/ml)超声分散在mes缓冲溶液中(调节溶液ph为6左右)，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc，10mm)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs，10mm)溶液，振荡反应2-4小时，将溶液反复离心水洗除去未反应物质，得到壳聚糖功能化的氧化石墨烯(gocs)；将gocs溶解在水中获得gocs溶液，配制的gocs溶液的浓度为10mg/ml。
2、镁合金表面化学处理的工艺为：将抛光的镁合金样品浸没到nah2po4(45g/l)、nano3(15g/l)和hf(8g/l)的混合溶液中处理18小时，处理温度为65℃。
3、表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料的制备：
将步骤2)处理后的镁合金样品浸没到(3-氯丙基)三乙氧基硅烷溶液(20mm，溶剂为四氢呋喃)中振荡反应18h，样品取出后100℃下真空热处理12小时，样品分别用乙醇和蒸馏水充分清洗后干燥备用，得到表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料。
4、表面固定gocs的镁合金材料的制备；
将步骤3)得到的表面固定(3-氯丙基)三乙氧基硅烷的镁合金材料浸没到10mg/ml的gocs溶液中继续反应6小时，样品清洗干燥后得到表面固定gocs的镁合金材料。
5、表面载肝素的镁合金材料的制备：
将表面固定了gocs的镁合金材料浸没到5mg/ml的肝素溶液中，充分吸附35分钟后清洗晾干，得到载肝素的生物活性涂层即表面载肝素的镁合金材料。
实验例1
将原始镁合金与实施例1～3制备得到的表面载肝素的镁合金材料表面喷金后进行扫描电镜观察，从图3可以看出实施例1～3制备的材料表面具有大量的氧化石墨烯片层结构，该结构有效覆盖了镁合金基体表面，从而使基体与腐蚀环境隔离开来，提高材料的耐蚀性能，而原始镁合金表面没有该结构。
实验例2耐蚀性能测试
分别将原始镁合金(mg)、实施例1～3制备的表面固定gocs的镁合金材料(mg-gocs)、实施例1～3制备的表面载肝素的镁合金材料(mg-gocs/he)分别采用动电位扫描极化曲线测试，测试采用三电极体系(ag/agcl电极为参比电极，铂丝为辅助电极，样品为测试电极)在电化学工作站上进行，扫描速度1mv/s，测试在人体模拟体液中进行，测试温度为37℃，测试完成后采用塔菲尔法拟合得到腐蚀电位和腐蚀电流。从图4可以看出，表面固定gocs后，材料的耐蚀性能得到提高(腐蚀电位提高，腐蚀电流减小)，腐蚀电位从对照镁合金的-1.570v升高到mg-gocs的-1.403v，而mg-gocs/he的腐蚀电位进一步升高到-1.128，腐蚀电流减小从镁合金的3.726×10-5a/cm2降低到mg-gocs的7.735×10-7a/cm2，装载肝素后，腐蚀电流为6.821×10-7a/cm2)，装载肝素后腐蚀速度未发生明显变化。
实验例3抗凝血性能测试
分别将原始镁合金(mg)、实施例1～3制备的表面固定gocs的镁合金材料(mg-gocs)、实施例1～3制备的表面载肝素的镁合金材料(mg-gocs/he)进行抗凝血性能测试，测试采用测量部分凝血活酶时间(aptt)的方法进行。新鲜人体全血离心后获得贫血小板血浆(ppp)，将ppp分别与原始镁合金(mg)、实施例1～3制备的表面固定gocs的镁合金材料(mg-gocs)在37℃条件下共培养15分钟，然后，取50μl培养的ppp加入到专用的测试管中，接着加入50μl的aptt检测试剂(aptt检测试剂盒，sysmex公司)，37℃培养三分钟后加入50μl的0.025mcacl2溶液，采用全自动凝血仪(ca-1500，sysmex公司)记录凝血时间。每个样品测量三次取平均值。从图5可以看出，载肝素后，材料的凝血时间显著延长，显示抗凝血性能得到明显改善。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。