鼠疫菌F1疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型的制作方法

本发明涉及一种小鼠吸入免疫模型的制备方法，尤其涉及鼠疫菌f1疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型。

背景技术：

鼠疫耶尔森氏菌是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科耶尔森氏菌属，可引起鼠疫爆发。鼠疫是一种流行于啮齿类动物间、通过跳蚤传播的自然疫源性疾病。在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，夺去了上亿人的生命。鼠疫耶尔森氏菌是鼠疫耶尔森氏菌属中能引起严重人类感染的细菌之一，会引起三种主要的综合征，表现肺鼠疫、败血症或腺鼠疫，肺鼠疫通过气溶胶飞沫传播；败血症的主要起因是被感染跳蚤的叮咬，若不采取治疗，致死率可达100％；腺鼠疫也由跳蚤传播，不采取治疗可导致40-60％的致死率。人接触了感染动物的血液和组织，或暴露在有菌气溶胶环境中均有可能被感染，甚至会导致人传染给人。

现在鼠疫感染在许多国家和地区仍然严重威胁着公共健康。疫苗是治疗鼠疫感染的一种可行方法，新型鼠疫疫苗的研发主要聚焦在鼠疫菌毒力相关的蛋白质，比如f1荚膜蛋白和v毒力蛋白。f1蛋白在鼠疫菌表面形成荚膜样结构，与菌逃避吞噬作用相关，v抗原蛋白与ⅲ型分泌系统作用相关，ⅲ型分泌系统在外膜蛋白yops进入宿主细胞过程中起作用。研究表明针对f1和v蛋白的抗体可以保护小鼠免受皮下或气溶胶方式的鼠疫菌感染。

目前，针对液体气溶胶或干粉气溶胶等的研究多采用口鼻暴露和全身暴露，这两种方法虽然对实验动物无创伤，但是无法精确定量给药剂量，样品在暴露塔与暴露舱中损耗巨大，不适合蛋白疫苗等昂贵、微量样品的吸入给药。而且相关的仪器设备体积大、价格不菲。经气管进行肺递送可以将样品直接到达肺部靶器官，作用直接，节约样品，因此经气管染毒或给药是动物毒理及免疫研究的不错手段。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种制备动物模型的方法。

本发明提供制备动物模型(动物免疫模型)的方法，包括如下步骤：先通过液体气溶胶的方式将免疫原递送至动物的肺部，再用免疫原对应的病原菌攻毒，得到动物模型。

上述方法中，

所述免疫原为疫苗；

或，所述疫苗为鼠疫菌疫苗；

或，所述免疫原对应的病原菌为鼠疫菌；

或所述动物为小鼠。

上述方法中，

所述递送为定量递送；

或，所述鼠疫菌疫苗的活性成分为鼠疫菌f1疫苗；

或，所述鼠疫菌疫苗的递送量为20μgf1疫苗/18-20g。

上述方法中，

所述鼠疫菌疫苗递送次数为2次，2次鼠疫菌疫苗递送间隔时间为4周；

或，所述鼠疫菌攻毒时间与第2次递送所述鼠疫菌疫苗后间隔4周；

所述鼠疫菌攻毒剂量为2000cfu/18-20g。

上述方法中，

所述鼠疫菌疫苗由鼠疫菌f1疫苗、cpg和含有体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水组成；其中，所述鼠疫菌f1疫苗和所述cpg的质量比为1:1；

或所述述鼠疫菌疫苗的递送量为20μg鼠疫菌f1疫苗/18-20g。

上述方法中，

所述通过液体气溶胶的方式将疫苗递送至动物的肺部为将疫苗通过液体气溶胶肺递送装置递送至动物的肺部。

上述方法制备的动物模型在筛选疫苗中的应用也是本发明保护的范围。

液体气溶胶肺递送装置在制备疫苗免疫动物模型中的应用也是本发明保护的范围；

或液体气溶胶肺递送、免疫原和病原菌在制备疫苗免疫动物模型中的应用也是本发明保护的范围。

本发明中实施经气管进行气溶胶肺递送时，借助小动物喉镜在视野内暴露小鼠会咽部位，将肺递送装置针头插入气管中，快速用力推动注射器针芯，使液体呈雾状。注意操作时动作轻柔、迅速，所有器械用后注意及时消毒除菌。

本发明直接将受试物以气溶胶形式递送至小鼠肺部，构建了一种新的小鼠免疫模型，该模型针对性强，重复性好，可以准确定量研究受试物对小鼠的免疫情况。本研究用balb/c小鼠验证了鼠疫菌f1蛋白作为疫苗的免疫原性和效力。经过两次f1蛋白免疫的小鼠，在被鼠疫菌91001(2000cfu/只)感染后，生存率可达100％。肺递送组和皮下组小鼠被鼠疫菌91001感染后无临床症状，滴鼻组小鼠只有轻微耸毛症状。相反，未经过f1蛋白免疫的小鼠则生存率为0％，可见f1蛋白作为亚单位疫苗有很好的保护效力。

附图说明

图1为小鼠生存曲线。

图2为小鼠血清和肺匀浆液中抗体滴度。

图3为小鼠脏器和血中细菌载量。

图4为小鼠血清及肺匀浆液中细胞因子。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

部分材料如下：bhi培养基(bd，中国)、50ml锥形瓶、玻璃珠、泊洛沙姆(sigma，p5556)、无菌生理盐水、6-8周龄spf级balb/c雌性小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)、cpg7909(sigma)、小鼠细胞因子检测试剂盒(ebioscience)、hrp标记的山羊抗鼠igg、igg1、ig2a、iga、igm抗体(abcam)、酶联板。

部分仪器如下：生物安全柜(nuaire)、摇床(太仓市豪城实验仪器制造有限公司)、分光光度计(uv-8000a)、恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、离心机(hitachi)、手持式液体气溶胶肺递送装置(penncentury)、小鼠固定台(北京慧荣和科技有限公司)、喉镜(北京慧荣和科技有限公司)、酶联仪(thermo)。

鼠疫菌91001(宋亚军，童宗中，王津等。鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析。解放军医学杂志，2004，29(3)：192-198)、鼠疫菌f1蛋白(鼠疫菌f1蛋白制备方法参考专利：鼠疫耶尔森氏菌天然f1抗原的提取、纯化方法；专利申请号：200810055697.7)、cpg7909(invivogen,cat.#tlrl-2006-1)。

下述实施例中统计分析：ld50的估算用到非线性拟合分析，比较小鼠急性期反应蛋白，脏器载菌量，小鼠血清及肺匀浆液抗体水平等指标时用到析因设计定量资料一元方差分析。

生理盐水为质量百分含量为0.9％的nacl水溶液；

含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水为将泊洛沙姆和生理盐水混匀得到的溶液，且泊洛沙姆在溶液中的体积百分含量为0.05％。

实施例1、一种液体气溶胶肺递送制备免疫小鼠模型的方法

一、鼠疫菌的培养及发生液的制备

(1)活化将-80度冰箱保存的甘油菌种化冻后吸取20μl接种于20ml的bhi肉汤中，26℃摇床200rpm培养36h，使鼠疫菌生长至平台期。此为第一代菌。

(2)预培养将菌液20倍稀释转接于20ml的bhi肉汤中，26℃摇床200rpm培养菌液至od600为1.0。此为第二代菌。

(3)正式培养将菌液100倍稀释转接于20ml的bhi肉汤中，26℃下200rpm培养菌液至od600为1.0，此为第三代菌。将第三代菌液转移至37℃摇床200rpm培养3h，此时菌体处于对数期中期。

(4)菌液制备收集适量(3)得到的菌液至无菌ep管中，3000g离心10min集菌，吸弃培养基上清，用含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水重悬菌体，并用含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水将菌液od600调整为1.0，按理论菌量10⁸cfu/ml稀释菌液至所需浓度进行后续实验。

同时将菌液5倍倍比稀释后涂bhi固体平板，平板在26℃倒置培养3天后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量。

二、鼠疫菌液体气溶胶气管插入肺递送免疫研究

1、免疫

本实验分为肺递送、滴鼻、皮下注射三种途径免疫小鼠，每种免疫途径分为f1疫苗实验组和含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水对照组，共分为6组，每组32只小鼠。

肺递送实验组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将免疫物递送至小鼠肺部；免疫物剂量为每只小鼠50μl，由20μgf1疫苗和20μg的cpg(佐剂)，溶解于50μl含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水制备而成；

肺递送对照组：借助喉镜使用手持式液体气溶胶肺递送装置将免疫物递送至小鼠肺部；免疫物剂量为每只小鼠50μl，由20μg的cpg溶解于50μl生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)制备而成；

滴鼻实验组：借助200μl枪头将免疫物递送至小鼠鼻孔处，免疫物剂量剂量为每只小鼠30μl，由20μgf1疫苗和20μg的cpg，溶解于30μl含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水制备而成；

滴鼻对照组：借助200μl枪头将免疫物递送至小鼠鼻孔处，免疫物剂量为每只小鼠30μl，由20μg的cpg溶解于30μl含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水制备而成；

皮下注射实验组：借助1ml注射器将免疫物递送至小鼠皮下，免疫物剂量为每只小鼠100μl，由20μg的f1疫苗和100μg的铝佐剂，溶解于100μl含体积百分含量0.05％泊洛沙姆的生理盐水制备而成；

皮下注射对照组：借助1ml注射器将免疫物递送至小鼠皮下，免疫物剂量为每只小鼠100μl，由100μg的铝佐剂溶解于100μl生理盐水(含0.05％泊洛沙姆)制备而成。

所有小鼠先按上述剂量初次免疫，第四周按相同剂量进行加强免疫，第八周以液体气溶胶肺递送方式给所有小鼠攻毒上述一制备的菌液，每只小鼠的攻毒剂量为2000cfu。

2、检测

1)、生存曲线绘制

攻毒后，每组取10只小鼠，在攻毒后0d、1d、2d、2.5d、3d、3.5d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d时间点，记录小鼠死亡只数，绘制生存曲线。

结果如图1所示，由菌落计数结果计算得出，实际攻毒剂量为每只小鼠2×10³cfu，攻毒后观察每组小鼠生存情况，肺递送、滴鼻和皮下实验组小鼠全部存活，对照组小鼠在4天内全部死亡。

2)、临床症状观察

肺递送、滴鼻和皮下对照组小鼠在攻毒后第二天均有耸毛现象，第三天部分症状严重小鼠可见眼角有分泌物、外部刺激后反应迟钝等症状，随后小鼠症状逐渐加重，可见强迫性腹部呼吸，最后小鼠死亡。肺递送、滴鼻和皮下实验组小鼠在攻毒后只有滴鼻实验组小鼠有轻微耸毛现象，其余两组无症状。

3)、各种指标检测

在第0周(初次免疫前2天，简称一免前2天)、第4周(加强免疫前2天，简称二免前2天)、第8周(攻毒后2天)、第10周(攻毒后2周)，每组从剩余的22只小鼠中随机取4只存活小鼠，摘眼球取小鼠全血，然后进行解剖，取小鼠脾和肺，脾和肺分别放入2ml无菌生理盐水中匀浆得到匀浆液。留出适量血和肺匀浆液用于涂板检测细菌载量，剩余血和肺匀浆液3000g离心10min，将上清分装至新的ep管中，于-20度冰箱保存。第10周时，如果相应组别存活小鼠不够4只，有多少只存活就取多少只，无存活就不做。

具体如下：

(1)特异性抗体检测

第0周(初次免疫前2天，简称一免前2天)、第4周(加强免疫前2天，简称二免前2天)、第8周(攻毒前2天)、第10周(攻毒后2周)这四个时间点，检测小鼠血清和肺匀浆液中5种特异性抗体(igg、igg1、igg2a、igm、iga)、17种细胞因子(ifngamma、il-12p70、il-13、il-1beta、il-2、il-4、il-5、il-6、tnfalpha、gm-csf、il-18、il-10、il-17a、il-22、il-23、il-27、il-9)的滴度。

酶联免疫吸附法检测特异性抗体：

1)吸取25μl浓度为2.0mg/ml的f1蛋白至50ml包被液中，震荡混匀后，用排枪每孔加100μl至elisa板中，37度孵育2h。

2)将包被液弃掉，并将板中液体扣干，每孔加入200μl封闭液，37度孵育2h。

3)将封闭液弃掉，并将板中液体扣干。

4)先将血清原液进行1:100稀释，混匀后，再进行2倍倍比稀释；肺匀浆上清原液2倍倍比稀释。稀释好的血清和肺匀浆液加至96孔板中，每孔100μl。

5)板在37度孵育1h。

6)将96孔板中的液体扣掉，用洗液洗板5次，在吸水纸上拍干。

7)在96孔板中加入稀释好的hrp标记的二抗，均是100μl/孔。

8)37度孵育30min。

9)将96孔板中的液体扣掉，用洗液洗板5次，在吸水纸上拍干。

10)每孔加入100μltmb显色液，37度孵育15min。

11)每孔加入100μl2m硫酸终止液。

12)利用elisa读板仪读板，波长od450nm和od630nm。

检测了一免前2天、二免前2天、攻毒前2天、攻毒后2周等4个时间点各组小鼠血清中特异性抗体igg和肺匀浆液中特异性抗体iga滴度。肺递送和滴鼻实验组血清中抗体igg滴度在二免前2天、攻毒前2天逐渐升高，在攻毒后2周有所下降，皮下实验组抗体igg滴度呈逐渐升高的趋势。肺递送实验组肺匀浆液中抗体iga滴度在二免前2天、攻毒前2天逐渐升高，在攻毒后2周有所下降，滴鼻实验组肺匀浆液中抗体iga滴度呈逐渐升高的趋势，皮下实验组肺匀浆液中无抗体iga(图2☆表示实验组和对照组相比有显著差异△表示和一免前2天相比有显著差异。a.血清中抗体igg滴度；b.肺匀浆液中抗体iga滴度。)。

(2)载菌量检测

第0周(初次免疫前2天)、第8周(攻毒前2天)、第8周(攻毒后2天)、第10周这四个时间点，测定小鼠全血、脾、肺中细菌载量。将全血、肺匀浆液和脾匀浆液用无菌生理盐水进行5倍倍比稀释后涂板计数，每个稀释度涂3个重复，每个重复涂10μl稀释液，将平板倒置于26度培养箱中培养3天，统计不同稀释度的菌落数。后面几个时间点需要多涂几个稀释度，避免菌量太多无法计数。

检测了一免前2天、二免前2天、攻毒后2天、攻毒后2周等4个时间点肺、脾和血中的细菌载量，结果如图3所示，☆表示实验组和对照组相比有显著差异，△表示和一免前2天相比有显著差异；a.肺载菌量；b.脾载菌量；c.血载菌量；可以看出，前两个时间点实验组脏器和血中均未检测到细菌，后两个时间点实验组血中也未检测到细菌。攻毒后2天，滴鼻组和皮下组肺中载菌量与对照组相比有显著差异(图3a)，肺递送组脾中载菌量与对照组相比有显著差异(图3b)，皮下组血中载菌量与对照组相比有显著差异(图3c)；攻毒后2周，滴鼻组血中载菌量与一免前2天有显著差异(图3c)；攻毒后2周相比于攻毒后2天，肺递送和滴鼻实验组肺和脾中细菌载量升高，皮下实验组无变化(图3a、b)，因攻毒后2周对照组小鼠已全部死亡，所以没有检测细菌载量。

(3)细胞因子检测

用试剂盒th1/th2/th9/th17/th22/tregcytokine17-plexmousepanel，货号epx170-26087-901，测定各个时间点的血清、肺匀浆上清中的17种细胞因子(ifngamma、il-12p70、il-13、il-1beta、il-2、il-4、il-5、il-6、tnfalpha、gm-csf、il-18、il-10、il-17a、il-22、il-23、il-27、il-9)的滴度。

检测了各组小鼠不同时间点血清和肺匀浆液中17种细胞因子水平，各组别在一免前2天、二免前2天、攻毒前2天这3个时间点，实验组和对照组细胞因子水平无明显差异；在攻毒后2周时间点，实验组细胞因子水平高于对照组；各实验组攻毒后2周细胞因子水平高于前面3个时间点的细胞因子水平(少数细胞因子除外)，尤其是肺递送实验组和滴鼻实验组il-6、il-18、il-22等细胞因子(图4，☆表示实验组和对照组相比有显著差异△表示和一免前2天相比有显著差异)。

鼠疫菌f1疫苗液体气溶胶肺递送免疫小鼠模型的应用：疫苗预防机制研究、疫苗效果评价与比较等。