本发明属于免疫领域，涉及二萜类化合物及其衍生物在细胞免疫治疗方面的应用，具体涉及一种stat3抑制剂在增强nk细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
背景技术：
近年来，肿瘤的免疫疗法在临床研究等方面取得了巨大的进展，但主要的研究都是针对特异性免疫系统中t细胞等展开的。然而，随着对属于固有免疫系统的自然杀伤(naturalkiller，nk)细胞研究的深入，其在肿瘤免疫疗法中的作用越来越受到重视。nk细胞是一类独立的淋巴细胞亚群，最近被发现是先天淋巴样细胞家族的初始成员。与t细胞和b细胞不同的是nk细胞不需要特异性的抗原刺激就可以杀伤靶细胞，具有免疫清除和免疫监视等功能。故nk细胞在抵御肿瘤，尤其是转移瘤细胞和微小肿瘤细胞的清除中起到重要作用。
stat3和stat5是jak-stat通路的重要组成部分。激活stat3会促进肿瘤细胞的增殖并减弱其对nk细胞等免疫细胞的敏感性。另外stat3的激活还会抑制nk细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，同时紊乱免疫细胞之间的调节，抑制免疫细胞向肿瘤的迁移。因此抑制肿瘤微环境内的stat3信号通路或许是治疗某些肿瘤的途径之一。stat5既可促进肿瘤细胞的生长发育又可促进nk细胞的发育和细胞毒性。抑制nk细胞的stat5水平不仅损害nk细胞的正常功能，而且促进肿瘤的生长。因而促进stat5在nk细胞中的表达有利于对肿瘤的治疗(参考文献：stat3、stat5在nk细胞中的抗肿瘤作用研究进展，转化医学电子杂志2017年第4期第5卷)。
flexibilina、flexibilinb为从一种珊瑚中分离得到的二萜类化合物，化学结构式如下(参考文献：flexibilinsa-c,newcembrane-typediterprnoidsfromtheformosansoftcoralsinulariaflexibillis.mardrugs,2013,11:1999-2012)。
现有技术没有报道过flexibilina、flexibilinb用作stat3抑制剂的用途，也没有报道过其可以提高nk细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种stat3抑制剂在增强nk细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
flexibilina或flexibilinb用作stat3抑制剂的用途。
flexibilina或flexibilinb用于增强nk细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途。
进一步地，所述肿瘤为胃癌。
一种stat3抑制剂，含有flexibilina或flexibilinb，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
一种用于增强nk细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有flexibilina或flexibilinb，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
进一步地，所述肿瘤为胃癌。
本发明的技术效果：
本发明发现，flexibilina或flexibilinb为stat3抑制剂，flexibilina或flexibilinb通过抑制stat3的表达进而提高nk细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
附图说明
图1为各组nk细胞stat3表达量及对胃癌细胞sgc-7901、bcg-823的杀伤力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
一、实验材料
rpmi-1640、胎牛血清(fbs)购自gibco公司；nk细胞培养基购自德国cellgro。
重组人白细胞介素2(rhil-2)购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自nycomedpharma。
人胃癌细胞sgc-7901、bcg-823购自中国科学院上海细胞库。
二、实验方法
1、单个核细胞分离、分组及nk细胞培养
采集健康志愿者外周血，ficoll密度梯度离心，分离获得外周血单个核细胞(pbmc)。day0，用含有5％自体血浆、80u/ml庆大霉素的nk细胞培养液将pbmc调至起始细胞数为1.0×106/l，将细胞均分为对照组和给药组，对照组常规培养：day0加入500u/ml的rhil-2，置于37℃，5％co2培养箱培养，以后每2天半量换液1次，将细胞数控制为1.0×106/l。给药组(flexibilina组、flexibilinb组、lobocrassine组)与对照组培养方法基本一致，仅在day0额外添加10μm的flexibilina、flexibilinb或lobocrassine。
2、westernblot测定各组nk细胞中stat3的表达量
收集day10各组nk细胞，用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。配制12％sds-丙烯酰胺凝胶，将蛋白与5×loadingbuffer混合后上样，浓缩胶中恒压60v，分离胶加至120v，待电泳完成，将蛋白转至pvdf膜上(恒流150ma，3h)。用5％脱脂牛奶将膜封闭2h后用tbst洗膜3次，每次10min，一抗以工作浓度1:500，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗(stat3为兔抗1:10000；β-actin为鼠抗1:12000)。孵育2h，用ecl发光剂压胶片发光、显影，以stat3与内参β-actin的灰度比值作为stat3表达量。将对照组stat3表达量归一化，计算各给药组stat3表达量的归一化值。
3、nk细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定
胃癌细胞sgc-7901的培养：从液氮中取出sgc-7901细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清rpmi-1640培养基的50ml培养瓶中，37℃，5％co2环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。
各组nk细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定：day10，以sgc-7901细胞为靶细胞(2×104/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于co2培养箱。18h后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续培养4h。酶标仪在450nm波长下检测吸光度，杀伤率用以下公式来计算：
杀伤率(％)＝(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值×100％。
4、nk细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定
胃癌细胞bcg-823的培养：从液氮中取出bcg-823细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清rpmi-1640培养基的50ml培养瓶中，37℃，5％co2环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。
各组nk细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定：day10，以对数生长期bcg-823细胞为靶细胞(2×104/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于co2培养箱。18h后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续培养4h。酶标仪在450nm波长下检测吸光度，杀伤率用以下公式来计算：杀伤率(％)＝(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值×100％。
5、统计学方法
采用spss19.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、各组nk细胞中stat3的表达量比较
flexibilina组、flexibilinb组nk细胞中stat3表达量显著低于对照组，作为对比的二萜化合物lobocrassine组nk细胞中stat3表达量与对照组无显著差异。
结果如表1所示。
2、各组nk细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定结果
flexibilina组、flexibilinb组nk细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力显著高于对照组，作为对比的二萜化合物lobocrassine组nk细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力与对照组无显著差异。结果如表1和图1所示。
3、各组nk细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定结果
flexibilina组、flexibilinb组nk细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力显著高于对照组，作为对比的二萜化合物lobocrassine组nk细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力与对照组无显著差异。结果如表1和图1所示。
表1各组nk细胞stat3表达量及对胃癌细胞sgc-7901、bcg-823的杀伤力
结果表明，flexibilina、flexibilinb为stat3抑制剂，flexibilina、flexibilinb通过抑制stat3表达激活nk细胞对肿瘤细胞的杀伤力；对比二萜lobocrassine不具备这种作用。
实施例2：
一种stat3抑制剂，含有flexibilina或flexibilinb，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
实施例3：
一种用于增强nk细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有flexibilina或flexibilinb，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。肿瘤细胞优选胃癌。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。