MiR-22在制备抑制鼻咽癌的迁移的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种药物用途。

背景技术：

鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，npc）是一种常见的头颈部肿瘤，来源于位于鼻咽部的上皮细胞。鼻咽癌作为一种多基因遗传疾病，主要发生在中国南部，东南亚和北非。鼻咽癌患者在疾病早期通过淋巴管和血管的转移潜能。随着精确成像和放疗的发展，鼻咽癌患者的预后更好。然而，远处转移仍然是鼻咽癌患者治疗不佳的主要原因。

微小rna（mirna）是内源性的〜22个核苷酸的rna，通过匹配蛋白质编码基因的mrna以指导它们的抑制[8]发挥重要作用，存在于许多有机体中。mirna涉及一些疾病和细胞功能，包含增殖和分化。据报道，在不同类型的癌症中mirna-22（mir-22）的表达水平不同。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种mir-22的新药物用途。

本发明的技术解决方案是：

一种mir-22在制备抑制鼻咽癌的迁移的药物中的应用。

本发明提供了mir-22的新药物用途，用于制备抑制鼻咽癌的迁移的药物，mir-22/trpm7通路可成为针对鼻咽癌的新型治疗策略。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是trpm7在鼻咽癌组织中的表达及trpm7在非癌性组织中的表达鼻咽组织和npc组织示意图。

其中：（a）trpm7在鼻咽癌组织中的表达：trpm7在非癌性鼻咽组织中的低表达（n），trpm7在鼻咽癌组织中的高表达，（b）trpm7在非癌性组织中的表达鼻咽组织和npc组织。

图2是trpm7中预测的mir-22的3'utr区域及转染野生型（wt）或突变型（突变型）trpm73'-utr荧光素酶报告质粒mir-22或阴性对照mirna（nc）转染至hek293细胞，并检测相对荧光素酶活性示意图。

其中：（a）trpm7中预测的mir-22的3'utr区域（b）转染野生型（wt）或突变型（突变型）trpm73'-utr荧光素酶报告质粒mir-22或阴性对照mirna（nc）转染至hek293细胞，并检测相对荧光素酶活性*p<0.05。

图3是在用mir-22抑制剂(mo)和前体(pre)孵育的cne2细胞中trpm7的蛋白质印迹分析示意图。

其中所显示的数据经至少三次独立实验测试。数据通过t检验分析*p<0.05，**p<0.01。

图4是mir-22减少cne2细胞的迁移示意图。

其中（a）transwell实验用于测试mir-22对cne2细胞的迁移能力影响、（b）将迁移的细胞进行统计、（d）细胞的相对迁移距离被测量（p<0.001）、（c）收集已转染的细胞，并且通过划痕实验测量迁移率。在0h和48h显示划痕的代表性图像。数据为平均值±sem，*p<0.05。所有实验至少进行三次。

图5是使用流式细胞术分析具有mir-22敲低和过表达的cne2细胞示意图。

数据是平均值±sem.p>0.05。

具体实施方式

一种mir-22在制备抑制鼻咽癌的迁移的药物中的应用。

材料和方法：

细胞系和细胞培养：

将cne2细胞系维持在rpmi-1640（gibcobrl，grandisland，ny，usa）

用10％fbs（gibco）处理。所有细胞在含有5％co2的37℃的环境中温育。

免疫组化：

使用trpm7抗体（santa，1：100）孵育石蜡包埋的鼻咽癌组织切片。使用dab检测试剂盒（增强聚合物）（zsgb-bio，中国）进行ihc，使用dab试剂盒（zsgb-bio，中国）和苏木精复染。使用免疫反应评分（irs）根据染色强度和分布对trpm7表达水平进行评分。irs=si（染色强度）*pp（阳性细胞的百分比）。si被确定为0=负值;1=弱;2=中等;和3=强。pp被定义为0，<1％;1,1％-10％;2，11％-50％;3，51％-80％;和4个>80％的阳性细胞。每个肿瘤的10个不同的领域被用于irs评估。使用正常的鼻咽上皮作为对照。

荧光素酶报告基因测定：

将hek293细胞接种在24孔板的内孔中。当细胞汇合达到70％时，我们使用lipofectamine2000（invitrogen）与80ng含有trpm7的野生型或突变体3'-utr和4ngprl-tk的pgl3载体质粒共转染细胞.mir-22模拟物或模拟物nc（biomicsbiotechnologiesco.ltd。（南通，中国））以50pmol的终浓度共转染。转染后48小时，使用双荧光素酶报告基因测定系统（promega，southampton）连续测量荧光素酶活性，英国）基于制造商的说明书，发光信号用作记录器活性的量度，用于转染效率的归一化。

蛋白质印迹：

使用含有蛋白酶抑制剂pmsf的ripa裂解缓冲液在冰上裂解转染的细胞。将20微克总蛋白质样品在10％sds-page凝胶上分离并转移至pvdf膜（millipore，billerica，ma，usa）。并在tris缓冲盐水（tbst）中的5％脱脂奶粉中封闭膜，在室温下孵育1小时。然后，将膜与第一抗体在4℃孵育过夜，然后在室温下与hrp标记的第二抗体孵育1小时。通过增强的化学发光系统（ecl，cellsignalingtechnologies）检测免疫反应性。使用imagej软件获得数据，并使用gapdh作为上样对照。我们使用抗trpm7（1：500;santacruzbiotechnology，santacruz，ca，抗gapdh（1：5000;cusabio，武汉，中国），抗鼠igg（1:5000;sangonbioco.ltd，中国上海）。所有实验重复至少三次。

划痕实验：

在6孔板上用吗啉或前体和mir-22的对照转染cne2细胞。当细胞达到90％汇合时，用100μl移液管尖制备伤口。将平板在37℃温育。通过显微镜每12小时观察一次，通过伤口距离测量在0小时测量迁移距离。

transwell分析：

使用transwell细胞培养箱测定cne2细胞的迁移活性。用mo-mir22和pre-mir22处理细胞36小时后，将200ul细胞（30000细胞）添加到在顶部transwell小室中修饰的fbs游离rpmi培养基中（8ul，康宁，中国）。底室含有500ul完全培养基。迁移的细胞用无水甲醇固定，并在20小时后用结晶紫染色。在3个随机区域中计数细胞并通过olympus显微镜用数码相机捕获图像。

细胞周期分析：

我们用mir-22的抑制剂和前体转染cne2细胞，48h后收集细胞，然后将细胞置于70％乙醇中，-20℃过夜。然后，用含1％tritonx-100的细胞孵育10分钟，加入1mg/mlrna酶a20分钟并用pi/rnase染色缓冲液（bdbiosciences，sandiego，ca）染色。之后使用cellquest采集和分析程序。

统计分析：

使用graphpadprism5进行统计分析。所有相同的实验进行至少三次，数据通过学生测试分析并显示为平均值±sem。

结果：

trpm7在npc中的表达：

我们通过免疫组织化学方法检测了患者鼻咽癌组织中trpm7在鼻咽癌组织中的表达情况。如前述研究[5]所示，鼻咽癌组织中鼻咽癌组织中的表达水平高于非癌性鼻咽癌组织（n）（图1）。a）。此外，我们总结了鼻咽癌患者的百分比，发现trpm7在鼻咽癌患者和0％非癌性鼻咽患者中的高表达率为100％（图1.b）。总之，我们证实了trpm7在鼻咽癌中的过表达。

mir-22是trpm7的上游：

为了进一步探索功能，我们试图预测trpm7的上游.trpm7的3'utr通过预测软件microrna.org-targets和expression含有mir-22的预测结合位点（图2.a）。据报道trpm7是帕金森病中mir-22的靶基因[15]。我们通过荧光素酶报告基因分析证实了靶基因的作用，trpm7结合了mir-22的3'utr区（图2.b）。

mir-22减少cne2细胞的迁移：

为了研究mir-22在鼻咽癌细胞中的功能，我们利用transwell迁移实验和划痕实验研究了mir-22对细胞迁移的影响。我们将mir-22抑制剂（mo）和前体（pre）转染到cne2细胞。首先，我们通过蛋白质印迹分析检测了转染效率。由于mir-22的过表达和敲低是有效的（图3.ab），它们被用于后续研究。我们通过transwell迁移实验和划痕实验研究了mir-22对细胞迁移的影响。有趣的是，mir-22的敲低增加了transwell小室中的细胞数量，而mir-22的过表达显示出相反的现象，与模拟组相比（图4.ab）。划痕实验测定也显示了类似的结果（图4.cd）。以上数据支持mir-22可能会减少细胞迁移。

mir-22与cne2细胞增殖的关系：

为进一步探讨mir-22在npc中的潜在生物学作用，我们对细胞周期的细胞实验进行了研究。我们发现，与对照组相比，用mir-22抑制剂和前体处理过的cne2细胞的g1期，s期和g2期无明显差异（图5）。我们认为mir-22对cne2细胞增殖的影响不明显。

讨论：

尽管鼻咽癌放疗和化疗已被广泛应用于患者，且已显示出良好的治疗效果，但转移的比例仍然很高[16]。鼻咽癌是一个以迁移和增殖为特征的复杂生物过程[17]。因此，重要的是鉴别npc转移的机制，进展和预后，有助于早期诊断，支持预后预测。在这项研究中，我们证明了mir-22减少了cne2细胞的迁移，这受到trpm7的调控。

trpm7是一种非选择性阳离子通道，在许多恶性肿瘤中过表达[18]。trpm7ca2+和mg2+通道调节人类癌症的迁移[19]，包括鼻咽癌[6]。研究报道trpm7在鼻咽癌发展过程中在增殖和迁移过程中发挥着多种功能作用[7]。但trpm7在npc中的作用机制有没有完全得到证明。

mirnas与治疗癌症的新型治疗药物有着密切的关系[20]。研究证实mir-22与癌症发展相关，如结直肠癌[21]，肝癌[22]，慢性心力衰竭[23]和非小细胞肺癌[24]。然而，在mir-22及其在npc中的靶标方面存在差异。

在目前的研究中，我们使用ihc来探索trpm7在npc样品中的表达，发现与非癌性鼻咽组织相比，trpm7在鼻咽癌组织中的过表达（图1）。通过激活，阻断和击穿离子通道，jianpengchen等发现trpm7通过介导ca2+内流来调节npc的转移过程[5,6]。而trpm7通道通过钙诱导钙释放（cicr）机制控制ca2+的释放[6]。但trpm7的上游调控尚不清楚。有趣的是，我们通过分析软件发现trpm7是mir-22的靶基因，我们的研究结果显示trpm7和mir-22的靶向结合（图2）。为了研究mir-22在体外的作用，我们转染mir-22的抑制剂和前体发现mir-22的敲低增加了cne2细胞的迁移，而mir-22的过表达降低了这一过程。但cne2细胞的增殖与mir-22关系不明显（图4）。未来还需要探索mir-22在鼻咽癌组织和细胞中的表达。

综上所述，我们发现mir-22抑制鼻咽癌细胞的迁移活性，证实trpm7作为mir-22的直接靶点在鼻咽癌组织中表达较高。结果表明mir-22/trpm7通路可能成为针对鼻咽癌的新型治疗策略。