本发明涉及一种药品，即一种蒙药沙蓬降糖成分及其提取工艺；也是一种治疗糖尿病的蒙药以及制造方法。
背景技术：
蒙药沙蓬，蒙古名译音“楚力格日”，为藜科(chenopodoaceae)沙蓬属（agriophyllumbieb.）一年生草本植物沙蓬agriophyllumsquarrosum（l.)moq.的干燥地上部分。几乎产于内蒙古全区，资源十分丰富。据史料记载，“本品味苦、涩，性糙、平。具有祛疫，清热，解毒，利尿功效”，亦用于消渴。临床实验以沙蓬治疗糖尿病，也获得了正面的效果。可是，沙蓬的降糖有效成分尚未明确。根据相关资料推测，沙蓬所含的黄酮类成分可能是降糖的因素，但一直未得到证实。由于药效成分不明，只能使用全株入药，量大效低，服用不便，且增大了人体的转化负担，表现出一定的副作用。因此，找到沙蓬治疗糖尿病的有效成分，是改进剂型，提高疗效，避免副作用的必由之路。
技术实现要素：
本发明的目的是提供沙蓬治疗糖尿病的有效成分及其获得方法，以增强治疗效果，避免副作用，合理利用沙蓬资源。
上述目的是由以下技术方案实现的：一种蒙药沙蓬的降糖成分，其特征在于：所述沙蓬的降糖成分是沙蓬低聚糖。
所述沙蓬低聚糖的提取工艺：沙蓬粉碎加乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，再加等体积水稀释，滤过，滤液通过吸附树脂柱，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩即得。
所述沙蓬低聚糖的提取工艺：取沙蓬粉碎成粗粉,依次加10、8倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，弃渣，脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味,再加等体积水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液通过d101型大孔吸附树脂柱，适量水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩，活性炭脱色，精制，减压浓缩至浸膏，减压干燥，粉碎即得。
所述活性炭脱色是取10mg/ml的沙蓬低聚糖水溶液，活性炭的添加量为0.5%，在50℃温度条件下，搅拌吸附脱色30min。
所述蒙药沙蓬的降糖成分的提取工艺，包括沙蓬低聚糖与沙蓬总黄酮的分离过程：取沙蓬粉碎成最粗粉,依次加10、8倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，弃渣；脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味,再加等体积水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液通过d101型大孔吸附树脂柱，适量水洗脱，再用70%乙醇解吸，收集水洗脱液，得沙蓬低聚糖，另收集醇解吸液，减压回收溶剂、浓缩，减压干燥，粉碎，即分离出沙蓬总黄酮。
所述蒙药沙蓬的降糖成分的提取工艺，包括沙蓬低聚糖与沙蓬总黄酮的分离过程：沙蓬的乙醇回流提取取沙蓬最粗粉5.04kg,置多能提取罐中，依次加50.40l,40.32l的95%乙醇回流提取2次，每次回流2小时，提取液合并，回收乙醇后弃；脱脂的药粉，依次加50.40l、40.32l、40.32l的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次各1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味,再加等体积纯净水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液再加纯净水调整体积至10.0l,冷藏；提取液通过d101大孔吸附树脂柱分离，取d101型大孔吸附树脂3.04kg，湿法装柱(90cm×100cm玻璃层析柱，ф:h=1:5)处理待用；上述提取液滤液分3次通过d101型大孔吸附树脂柱，每次取提取液滤3.33l，加纯净水稀释至4.2l，混匀，上样通过树脂柱，以1bv/h的流速，吸附4小时；吸附柱，用纯净水洗脱5小时，再用70%乙醇解吸5小时，流速均为1bv/h，收集水洗脱液，减压浓缩，减压干燥，粉碎，即得沙蓬粗低聚糖；收集醇解吸液,减压回收乙醇、浓缩，减压干燥，粉碎，即分离出沙蓬总黄酮。
所述沙蓬低聚糖的成人日用量为50—75g。
本发明的有益效果是：确定了沙蓬治疗糖尿病的有效成分是沙蓬低聚糖，改变了沙蓬降糖成分是沙蓬总黄酮的主流认知，并且提供了沙蓬低聚糖的提取工艺，以及去除总黄酮等杂质的方法，过程简单，成本低廉，适于大量生产。在此基础上制作药品，剂量小，药效高，服用方便，无毒副作用，可望成为新型主选药品。同时分离的沙蓬总黄酮，用途广泛，为合理利用沙蓬资源提供了条件。
附图说明
图1是沙蓬有效成分提取制备工艺流程图；
图2是葡萄糖对照品的标准曲线；
图3是芦丁对照品的标准曲线图；
图4是大孔吸附树脂载样量考察的泄露曲线图（↓↑所指处为泄漏点）；
图5是2种大孔吸附树脂柱的总黄酮动态水洗脱曲线图；
图6是2种大孔吸附树脂柱的总黄酮动态醇解吸曲线图。
具体实施方式
本发明总的构思是找到蒙药沙蓬治疗糖尿病的有效成分，也可以说是找到一种治疗糖尿病的蒙药。围绕这一构思，结合现有文献资料进行了大量的实验，证明了沙蓬治疗糖尿病的有效成分是沙蓬低聚糖。并且在多种沙蓬低聚糖的提取方式当中，找到了沙蓬总黄酮和低聚糖的分离的优化工艺。
沙蓬有效成分分离提取工艺：沙蓬粉碎加乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，再加等体积水稀释，滤过，滤液通过吸附树脂柱，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩即得。
上述工艺可以进一步优化：如图1所示，取沙蓬，粉碎成最粗粉,依次加10、8倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，弃渣；脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味（1g:1ml）,再加等体积水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液通过d101型大孔吸附树脂柱，适量水洗脱，再用70%乙醇解吸。收集水洗脱液，减压浓缩，活性炭脱色，精制，减压浓缩至浸膏，减压干燥，粉碎，得沙蓬低聚糖。另收集醇解吸液，减压回收溶剂、浓缩，减压干燥，粉碎，得沙蓬总黄酮。
实验简述：
一、工艺实验
1.乙醇提取工艺条件的优化。
沙蓬低聚糖采用乙醇热回流法提取，乙醇浓度、乙醇用量、提取次数及提取时间是影响提取效果的主要因素。因此，我们为上述因素各取3个水平，选用l9（34）正交表设计试验，以低聚糖的提取量（总糖）为评价指标，兼顾总黄酮浸出量，以及总浸出物，研究筛选最佳工艺条件。
⑴实验设计采用l9（34）正交表进行试验设计。见下表1、表2。
表1乙醇回流提取工艺正交试验因素水平表
⑵供试品溶液的制备根据表1、表4正交试验设计要求，精密称取沙蓬粗粉25g,置500ml圆底烧瓶中，加a浓度乙醇b倍量，电热套加热提取c次，每次回流d小时，抽滤，合并滤液于1000ml量瓶中，加a浓度乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml相当于原药材0.025g）。
⑶低聚糖含量的测定
低聚糖即总糖含量的测定采用苯酚-硫酸分光光度法。
对照品溶液的制备：精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，准确吸取5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置5ml具塞刻度试管中，各加水至1.0ml，摇匀。分别加5%苯酚溶液0.5ml，混匀，迅速加入硫酸3.5ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰水浴中冷却5分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法(附录va），在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表2、图2。
得标准曲线回归方程：a=9.6930c-0.1092，r=0.9998。
表2不同浓度葡萄糖对照品的吸光度
样品测定精密量取供试液0.6ml,置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml,置5ml具塞刻度试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加4%苯酚溶液0.5ml”起，依法测定吸光度，并计算含量。结果见表4。
⑷总黄酮的含量测定
总黄酮的含量测定采用nano2-al(no3)3-naoh比色法。
对照品溶液的制备取芦丁对照品，精密称定为10.4mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.208mg)。
标准曲线的绘制精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录ⅴa)，在500nm波长处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。结果见表3、图3。
得标准曲线回归方程：a=0.4679c-0.0045，r=0.9999。
表3不同浓度芦丁对照品的吸光度
样品测定准确量取供试品溶液4ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起同法操作，以未加氢氧化钠试液的供试品溶液为空白对照，测定吸收度，并按标准曲线法计算含量，即得。结果见表4。
⑸总浸出物的测定
分别准确吸取供试溶液40ml，按照《中国药典》（2010年版一部附录ⅹa）浸出物测定方法操作，并计算，即得。结果见表4：
表4乙醇回流提取工艺正交试验设计及结果（%）计算表
注：回流提取工艺正交试验三个评价指标，采用综合评分进行数据分析。低聚糖、总黄酮与浸出物的权重系数依次为0.6、0.2、0.2。*综合得分=xi/xmax×0.8+yi/ymax×0.2+zi/zmax×0.2
⑹实验数据统计分析
根据表4试验结果及计算结果进行方差分析。结果见表5。
表5正交试验结果方差分析表
f1-0.10(2,2)=9.00f1-0.05(2,2)=19.00f1-0.01(2,2)=99.00
正交试验评价指标综合得分以高者为佳。从表4结果直观分析，可见正交试验的5号方案，即a2b2c3d1组合，综合得分最高。表5方差分析结果表明，在本实验条件下提取次数（c）对回流提取效果的影响显著（p＜0.05），是主要因素；乙醇浓度（a），乙醇用量（b）影响不显著显著（p＞0.10，p＞0.05）；提取时间（d）影响甚微，故在本方差分析中被用作误差分析。因提取时间的影响甚微，可将其调整为第一次2小时，第二、第三次各1小时，以适当节省工时。
⑺验证试验
照以上优化的条件进行了3次乙醇回流提取工艺验证试验。结果见表6。验证试验结果与正交实验结果基本相近。
表6乙醇回流提取工艺验证实验结果
⑻结论
沙蓬乙醇回流提取的最佳工艺条件为:a2b2c3d1组合方案，即取药材最粗粉，依次加10、8、8倍量70%乙醇，须提取3次，依次回流2、1、1小时。沙蓬低聚糖提取量最高，总浸出物适中，同时被提出部分黄酮等“杂质”，应予去除。
2.大孔吸附树脂分离纯化工艺研究
大孔吸附树脂法作为一种常用的分离纯化方法，因其具有吸附容量大、吸附速度快、选择性好、再生简便等优点，而被广泛用于天然产物的分离纯化。
提取物水溶液在中性条件下通过适宜的非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，经水洗脱后，黄酮、生物碱、色素等有机亲脂性物质被吸附在大孔吸附树脂上，而糖类组分极性大不能吸附于大孔吸附树脂上，从而糖类组分得到进一步的纯化。吸附在大孔吸附树脂上的物质以乙醇进行梯度洗脱，可以将不同物质根据其极性的大小依次洗脱下来。以下实验欲通过比较几种大孔吸附树脂对沙蓬低聚糖的吸附纯化性能，寻找对沙蓬低聚糖提取液分离纯化效果良好的树脂，并对其分离纯化工艺进行优化，为沙蓬低聚糖分离纯化制备和进一步开发利用提供理论参考。
⑴沙蓬的提取液的制备
照前述沙蓬低聚糖的制备工艺，取沙蓬，粉碎成最粗粉,依次加10、8倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2h，去除叶绿素等脂溶性成分；脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味（1g:1ml）,再加等体积水稀释，低温放置过夜，滤过，既得提取液，冷藏。每1ml含生药0.5g。临用加水稀释至所需浓度。
⑵分析方法的确定
目前广泛应用的定量分析糖的苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法，是基于糖在浓硫酸作用下，水解脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛后，与苯酚缩合成一种橙红色化合物，或与蒽酮缩合成蓝绿色衍生物，在一定范围内其颜色深浅与糖溶液的浓度成正比，且于特定波长处有最大吸收，而用比色法在此波长下测定含量。沙蓬初提取物中含有的黄酮等苷类化合物在此含量测定过程中，在浓硫酸作用下水解成的糖，进一步水解而干扰低聚糖的测定结果。
所以，本试验主要以待分离去除的黄酮类成分为考查指标，适宜条件下考察测定总低聚糖，综合评价大孔吸附树脂分离除杂纯化制备其低聚糖的工艺。
总黄酮的含量测定采用nano2-al(no3)3-naoh比色法。
⑶大孔吸附树脂的筛选
①7种大孔吸附树脂的静态吸附、解吸试验
大孔吸附树脂的预处理分别取一定量的待选树脂，用95%的乙醇浸泡24h，然后用乙醇洗涤，直到洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇，继而依次用5%hci、4%na0h浸泡2～4h，分别用纯净水洗至中性，布氏漏斗抽滤，备用。待选7种大孔吸附树脂的物理性能参数见表7。
表77种大孔吸附树脂物理性能参数表
静态吸附量考察量取沙蓬初提取液40ml，加水稀释至1000ml，摇匀（0.2g生药/ml），测定总黄酮含量（c0）。称取大孔吸附树脂各三份，每份1g（w），置100ml的具塞三角烧瓶中，准确加入上述沙蓬初提取物水溶液40ml（v0），称定重量，置于摇床，摇24h后，再称定重量，加水补足损失重量，摇匀，过滤，滤液测定剩余总黄酮含量（c1），水洗树脂滤饼，洗液弃。并照下列公式计算各大孔吸附树脂的总黄酮吸附量（q）。结果见表8。
静态解吸率考察将吸附了沙蓬总黄酮的大孔吸脂再移入100ml的具塞三角烧瓶中，加入70%乙醇30ml（v1），称定重量，置于摇床，摇24h，称定重量，加70%乙醇补足损失重量，摇匀，过滤，滤液测定剩余总黄酮含量c2。并照下列公式计算各大孔吸附树脂的总黄酮解吸量（d）以及解吸率(e`)。结果见表8。
表87种大孔吸附树脂静态吸附及解吸性能表
小结表8所示试验结果表明，7种大孔吸附树脂静态吸附及解吸能力具有明显差异，静态吸附量与解吸量均最好者为d101型，其次为ab-8型；ads-7型吸附量虽较好，但解吸率较差而解吸量较低。故综合考量，选择d101型和ab-8型2种大孔吸附树脂继续进行动态吸附、解吸试验，以选择更优者。
②d101、ab-8型2种大孔吸附树脂动态吸附、解吸试验
大孔吸附树脂预处理在树脂柱(2cm×45cm玻璃层析柱；装柱ф:h=1:5)上进行，称取d101、ab-8大孔吸附树脂各约26g，分别置适宜容器，加乙醇浸泡12h，装柱，3倍柱床体积（bv）的乙醇洗脱，浸泡3h，2bv乙醇洗脱，浸泡3h，2bv乙醇洗脱；水洗至无乙醇味。各种处理溶剂或淋洗溶剂的流速均为2bv/h(1ml/min)。
树脂柱载样量考察取初提取液（0.2g生药/ml）上样，以2bv/h的流速，树脂床体积记为v，分部收集过柱流出液，每份0.5bv（vi），并测定每份（vi）总黄酮含量（ci）。直至过柱流出液和上样液中总黄酮含量相等时，照下列公式计算大孔吸附树脂柱的载样量(比上柱量saturationratio)与比吸附量(absorptionratio)。结果见图4～图6，表9。
载样量=(∑v0c0－∑vici)/v(w)（公式4）
比吸附量=(∑v0c0－∑vici－∑vh2och2o)/v(w)（公式5）
表92种大孔吸附树脂动态吸附与解吸试验结果表
小结图4所示2种大孔吸附树脂的泄露曲线表明d101型的泄漏点约在上样流量8bv，即上样4小时时；ab-8型的泄漏点约在上样流量9bv，即上样4.5小时时。提示d101型上样达饱和吸附量周期较ab-8型短。
根据上述泄漏点计算所得表9结果表明，大孔吸附树脂d101型的动态比吸附量、解吸量以及解吸率都较ab-8型高。
图6动态醇解吸曲线图显示，欲充分解吸树脂柱吸附至少需5bv的解吸液；d101型的动态解析效果也较ab-8型好。
所以，沙蓬提取液的分离“除杂”确定采用d101型大孔吸附树脂。
⑷d101型大孔吸附树脂分离纯化工艺条件的优化
①大孔吸附树脂预处理取d101型大孔吸附树脂约32g，照“2.⑶”项下相关方法操作，湿法装柱(2cm×45cm玻璃层析柱；ф:h=1:5)处理待用。
大孔吸附树脂的吸附性能，主要与总上样量，样液浓度、上样流速及其吸附时间等因素密切相关。上述树脂柱载样量考察所得d101型大孔吸附树脂的动态比吸附量0.84g/ml（药材计）为饱和吸附参数，照此量上样分离极易产生泄漏，影响分离效果。有文献记总上样量取比吸附量的0.5为宜，本试验此外为其增设0.7与0.9两个水平；上述其它因素也各取3个水平，选用l9（34）正交表设计试验，以总黄酮的吸附去除量和水洗脱液总糖含量，为考察指标，综合评价筛选最佳工艺条件。
②实验设计采用l9（34）正交表进行试验设计。见表10、表11。
表10大孔吸附树脂分离纯化工艺正交试验因素水平表
③供试品溶液的制备根据表2-11、表2-12正交试验设计要求，根据总上样量a准确量取沙蓬初提取液适量（46、36、26ml），加水稀释至b浓度，测定总黄酮，上样通过树脂柱，以c流速，循环吸附d小时；以1bv/h流速水洗脱5小时，再以1bv/h流速70%乙醇解吸5小时；分别收集水洗脱液和醇解吸液，分别定容250ml。
④样品测定
低聚糖测定参照苯酚-硫酸比色法，测定水洗脱液中低聚糖的含量，并计算低聚糖药材比得量。
总黄酮测定照nano2-al(no3)3-naoh比色法测定乙醇解吸液中总黄酮含量，并计算解吸率。结果见表11。
表11大孔吸附树脂分离纯化工艺正交试验设计及结果（%）计算表
注：大孔吸附树脂分离纯化工艺正交试验两个评价指标，采用综合评分进行数据分析。低聚糖、总黄酮的权重系数依次为0.6、0.4。*综合得分=xi/xmax×0.6+yi/ymax×0.4
⑤实验数据统计分析
根据表11试验结果及计算结果进行方差分析。结果见表12。
表12正交试验结果方差分析表
f1-0.10(2,2)=9.00f1-0.05(2,2)=19.00f1-0.01(2,2)=99.00
正交试验评价指标综合得分以高者为佳。从表11结果直观分析，可见正交试验的5号方案，即a2b2c3d1组合，综合得分最高。表12方差分析结果表明，在本实验条件下总上样量（a）对效果的影响显著（p＜0.05），是主要因素；样液浓度（b），上样速度（c）影响不显著（p＞0.10）；吸附时间（d）影响甚微，故在本方差分析中被用作误差分析。
⑥验证试验
照以上优化的条件进行了3次d101大孔吸附树脂的分离纯化工艺验证试验。表13结果显示，验证试验药材比低聚糖的得率与总黄酮的上样吸附、解吸回收率结果与正交实验结果基本相近。
表13d101大孔吸附树脂的分离纯化工艺验证实验结果
⑸结论
筛选确定的d101大孔吸附树脂分离纯化沙蓬提取液的最佳工艺条件为:a2b2c3d2组合方案，即树脂柱上样总量（药材计）应取其比吸附量0.84g/ml的0.7；样液浓度为每ml含药材0.4g；上样过柱以1bv/h的流速，吸附4小时；吸附柱以1bv/h流速，纯净水洗脱5小时，再以1bv/h流速，70%乙醇解吸5小时。分别收集水洗脱液和醇解吸液,待进一步处理。
3.沙蓬乙醇提取及d101大孔吸附树脂分离工艺的放大试验
根据上述优化的工艺条件，进行了沙蓬的乙醇回流提取和d101大孔吸附树脂分离纯化工艺的放大试验。考察工艺的稳定性与可行性，并为“沙蓬低聚糖和沙蓬总黄酮对自发性2型糖尿病gk大鼠降血糖作用的对比考察”和“沙蓬低聚糖降血糖作用的主要药效学研究”提供样品
⑴沙蓬的乙醇回流提取取沙蓬最粗粉5.04kg,置小型多能提取罐（电加热100l）中，依次加50.40l,40.32l的95%乙醇回流提取2次，每次回流2小时，提取液合并，回收乙醇后弃；脱脂的药粉，依次加50.40l、40.32l、40.32l的70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次各1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味（1g:1ml）,再加等体积纯净水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液再加纯净水调整体积至10.0l,冷藏。⑵提取液的通过d101大孔吸附树脂柱分离取d101型大孔吸附树脂约3.04kg，照“2.⑶”项下相关方法操作，湿法装柱(90cm×100cm玻璃层析柱，ф:h=1:5)处理待用。上述提取液滤液分3次通过d101型大孔吸附树脂柱。每次取提取液滤3.33l，加纯净水稀释至4.2l，混匀，上样通过树脂柱，以1bv/h的流速，吸附4小时；吸附柱，用纯净水洗脱5小时，再用70%乙醇解吸5小时，流速均为1bv/h。收集水洗脱液，减压浓缩，减压干燥，粉碎，即得沙蓬粗低聚糖（简称aos）;收集醇解吸液,减压回收乙醇、浓缩，减压干燥，粉碎，即得沙蓬粗总黄酮（简称atf）。
⑶结果沙蓬的乙醇回流和d101大孔吸附树脂分离纯化工艺的放大试验的基本参数与结果详见表14、表15。表明优化选定的沙蓬的提取及树脂柱分离工艺基本稳定、可行。
表14乙醇提取和大孔吸附树脂分离纯化工艺的放大试验基本参数
表15乙醇提取和大孔吸附树脂分离纯化工艺的放大试验结果
4.沙蓬低聚糖的活性炭脱色工艺实验
在低聚糖的提取、分离、纯化以及结构研究中，脱色是一个重要环节。目前，低聚糖脱色方法在实验室纯化中常用deae-纤维素法、双氧水法和吸附脱色法。吸附脱色法中的活性炭有巨大的比表面积，对杂质的吸附能力很强，脱色成本低、效果好、且不会影响提取物的生物活性，得到了广泛的应用，尤其是在工业化生产中经常采用活性碳吸附法去除多糖色素［20-22］。本试验采用正交试验设计研究活性炭吸附法对沙蓬低聚糖脱色效果的影响，确定沙蓬低聚糖活性碳脱色的最优工艺条件，为沙蓬低聚糖的纯化和进一步开发利用提供理论和试验依据。
⑴材料与仪器见前述材料与仪器。
⑵方法
①沙蓬低聚糖样品溶液的制备准确称取沙蓬低聚糖（aos）供试品7.50g，置500ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，混匀，作为母液（15mg/ml）；量取母液200ml加水稀释至300ml混匀（10mg/ml）；再量取母液100ml加水稀释至300ml混匀（5mg/ml），即得。
②实验设计
沙蓬低聚糖采用活性炭脱色，活性炭用量、加热温度、吸附脱色时间、低聚糖溶液的浓度是影响脱色效果的主要因素。因此，我们为上述因素各取3个水平，选用l9（34）正交表设计试验，以低聚糖的保留率和脱色率为综合评价指标，研究筛选最佳工艺条件。
采用l9（34）正交表进行试验设计。见表16、表17。
表16沙蓬低聚糖活性炭脱色工艺正交试验因素水平表
③供试品溶液的制备根据表16、表17正交试验设计要求，准确量取(d)浓度的样品溶液40ml，置50ml具盖离心试管中，加(a)量活性炭粉，(b)℃，恒温振荡脱色(c)min，离心沉淀，取上清液，测定吸光度a，计算脱色率、低聚糖保留率。
④供试品溶液的测定
活性炭脱色率的测定取沙蓬低聚糖样品溶液（10mg/ml），以水为空白对照于400～500nm波长范围进行光谱扫描，结果表明，本样品溶液在445nm波长处有最大吸收。故以445nm作为测定本样品溶液脱色率的检测波长。以水空白对照，测定吸光度a，并按下列公式6计算活性炭的脱色率。
低聚糖保留率的测定按照苯酚-硫酸分光光度法，测定低聚糖即总糖含量，再按下列公式7计算低聚糖保留率。
⑶结果见表17。
表17沙蓬低聚糖活性炭脱色工艺正交试验设计及结果（%）计算表
注：活性炭脱色工艺正交试验两个评价指标，采用综合评分进行数据分析。脱色率、低聚糖保留率的权重系数依次为0.6、0.4。*综合得分=xi/xmax×0.6+yi/ymax×0.4
⑷实验数据统计分析
根据表17试验结果及计算结果进行方差分析。结果见表18。
表18正交试验结果方差分析表
f1-0.10(2,2)=9.00f1-0.05(2,2)=19.00f1-0.01(2,2)=99.00
正交试验评价指标综合得分以高者为佳。从表17结果直观分析，可见正交试验的5号方案，即a1b1c1d1组合，综合得分最高。表18方差分析结果表明，在本实验条件下活性炭粉用量（a）对脱色效果的影响显著（p＜0.05），是主要因素；加热温度（b），样液浓度（d）影响不显著（p＞0.05、p＞0.10）；吸附时间（c）影响甚微，故在本方差分析中被用作误差分析。因样液浓度（d）影响不显著，为提高生产效率，将较佳组合中（d1）调整为（d2）。
即脱色样液选用10mg/ml浓度为宜。
⑸验证试验
照以上优化的a1b1c1d2条件进行了3次沙蓬低聚糖活性炭脱色工艺验证试验。表19结果显示，验证试验结果与正交实验结果基本相近。
表19沙蓬低聚糖活性炭脱色工艺验证实验结果
⑹结论沙蓬低聚糖活性炭脱色的最佳工艺条件为a1b1c1d2方案，即取10mg/ml的沙蓬低聚糖水溶液，活性炭的添加量为0.5%，在50℃温度条件下，搅拌吸附脱色30min，可获得最佳的脱色效果。低聚糖保留率82.6%，脱色率65%；成品低聚糖含量达72.6%。为沙蓬低聚糖的进一步分离纯化和深入开发利用提供了实验依据。
二、药效实验
按照一般资料，低聚糖本身不会引起人体血糖的升高，适于作高血糖患者的食品，但并没有降低血糖以及治疗糖尿病的功效。而黄酮类物质确有降糖作用的报道。而低聚糖和黄酮类物质作为沙蓬的主要成分，其降糖作用由何而来，目前尚无定论。为此作以下实验。
1.实验目的：应用沙蓬低聚糖（aos）和沙蓬总黄酮（atf）干预gk大鼠，观察其对gk大鼠血糖及糖耐量的影响，筛选确定活性成分，为后续研究奠定基础。
2.实验场所:华北理工大学实验动物中心屏蔽实验室（合格证号：syxk（冀）2010-0038）。动物实验时饲养室、垫料等用品及环境均用紫外线消毒。饲料为c060照射，饮水为无菌水。
3.实验材料
（1）实验动物雄性，145只spf（specificpathogenfree)级自发性2型糖尿病gk大鼠，体重210-240g，10-13周；购自上海斯莱克斯实验动物责任有限公司，许可证号：scxk（沪）2012-0002；均于华北理工大学动物实验中心spf级屏障实验室,以5只/笼进行饲养。
雄性，15只spf级wistar大鼠，体重230-240g，12-13周；购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：scxk（京）2014-0002；
大鼠饲料购自中国解放军军事医学科学院，许可证号：scxk（军）2014-0001。高脂饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：scxk（京）2009—0008。
（2）受试药物aos、atf药，由内蒙古民族大学蒙医药学院提供，批号为：20141103。原药材临床用法与用量：一日取65g，水煎，煎液分2~3次口服。
（3）对照药物盐酸二甲双胍片，性状：本品为白色片剂，无味。批号：140628，有效期至：2016年5月，生产厂家：天津亚宝药业科技有限公司。
格列苯脲，性状：本品为白色片剂，无味。批号：1301120，有效期至：2016年10月，生产厂家：天津太平洋制药有限公司。
（4）试剂羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20140122）；糖化血红蛋白检测试剂盒（axis-shieldpocas,批号:20141204）；水合氯醛（西安藻露堂药业集团康复医药有限公司，批号20131015）；无水酒精（德州市富凯化工有限责任公司，批号20141020）；pbs粉末（北京雅安达生物技术有限公司，批号：20120101）；纯净水由超纯水系统所制
（5）试验仪器电子天平，型号fa2104n，上海菁海仪器有限公司；高速低温离心机，型号5180r，德国eppendorf公司；实验室超纯水制备系统，型号rodi-p，上海和泰仪器有限公司；生物安全柜，型号bsc-1300iia2，上海博讯实业有限公司；糖化血红蛋白检测仪，型号nycocardreader2，挪威安迅时特有限公司，罗氏血糖仪及试纸；德国罗氏诊断有限公；电冰箱，型号bcd-
539wt，青岛海尔股份有限公司。
4.实验方法
（1）剂量与给药途径设计
受试药物aos:14.4g生药/g药粉，原药材临床用法与用量为65g/d生药量，相当于1.083g生药/kg（成人体重按60kg计算），成人s药粉用量为0.075g/kg。大鼠与人的等效剂量比为6.3:1，故大鼠治疗的等效剂量为6.83g生药/kg，相当于药粉0.475g/kg（0.48）。大鼠实验时采用三个剂量，分别相当于人临床用量的2倍、1倍（等倍）及0.5倍。给药量分别为药粉0.96、0.48、0.24g/kg（相当生药量13.66g/kg/d，6.83g/kg/d，3.42g/kg/d）。给药途径为口服（灌胃），容量为5ml/kg，每天一次，均为上午8:00～10:00点给药。
atf：28.7g生药/g药粉，原药材临床用法与用量为65g/d生药量，相当于1.083g生药/kg（成人体重按60kg计算），成人atf药粉用量为0.038g/kg。大鼠与人的等效剂量比为6.3:1，故大鼠治疗的等效剂量为6.83g生药/kg，相当于药粉0.2377g/kg（0.24）。大鼠实验时采用三个剂量，分别相当于人临床用量的2倍、1倍（等倍）及0.5倍。给药量分别为药粉0.48、0.24、0.12g/kg（相当生药量13.66g/kg/d，6.83g/kg/d，3.42g/kg/d）。给药途径为口服（灌胃），容量为5ml/kg，每天一次，均为上午8:00～10:00点给药。
阳性对照药物二甲双胍，白色片剂，规格：0.5g/片:成人每次0.5g，每日2次，或0.85g，每日1次。人日用剂量为1.0g（0.85g），即0.016(0.014)g/kg；大鼠给药剂量为0.105(0.089)g/kg（为人用量6.3倍，相当于人等效量），因此大鼠按0.1g/kg剂量灌胃，给药容积为5ml/kg
格列苯脲，为白色片剂，规格：2.5mg/片，口服一般用量为每日5～10mg，最大用量每日不超过15mg。人每日用剂量按12mg，即0.2mg/kg；大鼠给药剂量为1.2mg/kg（为人用量6.3倍，相当于人等效量），因此大鼠按1.2mg/kg剂量灌胃，给药容积为5ml/kg。
（2）2型糖尿病模型的确定标准
大鼠随机血糖及糖负荷2小时血糖均高于11.1mol/l，即认为已形成2型糖尿病。购回后由于gk大鼠空腹血糖升高不明显（在4-8mol/l），随机血糖有1/2在11.1mol/l，糖负荷2h有3/4血糖在11.1mol/l以上，因此随机血糖在11.1mol/l以下大鼠给予高脂饲料诱导4-5周。145只gk大鼠经5w的高脂饲料诱导，有126只（86.9%）大鼠随机血糖及糖耐量2小时血糖均高于11.1mol/l，即符合2型糖尿病模型。
（3）分组与给药
将符合成摸标准的96只大鼠，剔除体重较低或较高及血糖过高的6只大鼠，余下90只，按随机数字表法分为9组，加上正常对照组共103组，每组10只。分别为：模型对照组、二甲双胍组、atf药高、中、低剂量组、aos药高、中、低剂量组、格列苯脲组、正常对照组。
分组后，按剂量设计灌胃给予相应药物，给药容积为5ml/kg；二甲双胍0.1g/kg剂量灌胃，给药容积为5ml/kg（为人用量6.3倍，相当于人等效量）；格列苯脲1.2mg/kg（为人用量6.3倍，相当于人等效量），给药容积为5ml/kg；模型对照组与正常对照组每天灌胃同容积蒸馏水。各组均在上午8:00～10:00点灌胃给药，每天1次，连续8w。
（4）观察及检测指标
①各组大鼠一般状态期间每天观察各组大鼠精神状态、活动、毛色、饮食、饮水、体重及大小便等有无改变。每周测定体重、进食量、饮水量1次。
②各组大鼠血糖动态变化测定gk大鼠空腹血糖升高不明显，所以分别于给药第0、2、4、6、8w测定随机血糖（上午给药后30min）；8周末（处死前）尾静脉取5μl全血，用糖化血红蛋白仪测定糖化血红蛋白含量。
③糖耐量测定与给药前、第一次给药及给药8周后（处死之前），测定灌胃葡萄糖耐量（ogtt），即前一天晚上断食不断水，更换垫料，断食16h后，固定待测gk大鼠，采血针刺破尾端静脉取血一滴，用罗氏血糖仪检测0点血糖值，灌胃葡萄糖（2.5g/kg）后30min、60min、120min血糖值（各时间点检测时重新刺破采血）。
于给药第6周进行非禁食情况下（上午8:00点）灌胃给药，分别于给药前（0min）及给药后60min和120min眼球取血用血糖仪测定血糖，同时分离血清测定0min、60min、120min的血清胰岛素和c肽变化情况，目的是观察药物对胰岛素、c肽释放的影响及与血糖关系。
（5）统计分析方法
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，用spss17.0版软件对数据进行分析，分析方法为单因素方差分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。
5.结果
（1）各组大鼠一般状态
正常对照组大鼠活动自如，反应机敏，毛色白而有光泽，大便成形，色泽正常；gk对照组大鼠（模型）活动自如，但反应迟钝，毛色发黄无光泽，随着时间推移，毛色变黄和反应迟钝更明显，大便成形，色泽正常；各用药组大鼠毛色变黄减轻，有一定色泽，反应迟钝现象减轻，大便成形，色泽正常，未见脓血便或腹泻，鼻、眼、口腔无异常分泌物等情况。
（2）各组大鼠随机血糖动态观察
表20结果显示，给药前所有gk大鼠随机血糖均明显高于正常对照组，给药期间正常组大鼠随机血糖比较平稳，基本无变化；给药8w期间，gk模型组大鼠随机血糖随着时间推移逐渐升高，各药物干予组大鼠血糖有不同程度的降低，其中，格列苯脲和二甲双胍降低作用最明显(p<0.01)，有明显时间效应关系；高、中、低剂量aos药干预组大鼠随机血糖值也有显著降低，其中在给药4w降低效果最好，血糖值与格列苯脲及二甲双胍接近，但在6w～8w随机血糖值又有所回升，但明显低于模型组（p<0.01)，aos药三个剂量之间无明显量效关系，血糖水平无明显差异（p>0.05），但以中剂量效果更好。atf药低剂量在给药第6周随机血糖低于模型组(p<0.05)，但到第8w随机血糖与模型组比较无差异(p>0.05）。
表20s药对gk大鼠随机血糖的影响（x±s，n=10）mmol·l-1
注：与正常组比较，△p<0.05，△△p<0.01；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01
（3）各组大鼠糖化血红蛋白（hbalc）含量
从表21可见，模型组大鼠糖化血红蛋白和糖化血清蛋白均明显高于正常对照组；与模型组比较，二甲双胍组和格列苯脲组大鼠血清中的hbalc和gsp明显下降（p<0.01），特别是gsp降低更明显，接近正常对照组；aos高、中、低剂量组大鼠血清中的hbalc和gsp含量明显低于模型组，以aos高、中剂量组降低作用更明显，但aos药组间无统计学差异（p>0.05）。高、中、低剂量的atf药各组血清糖化血红蛋白含量与模型组无明显差异（p>0.05）。
与正常组比较，△△p<0.01；与模型比较，*p<0.05，**p<0.01
（4）各组大鼠糖耐量
表22为给药前各组大鼠糖耐量结果，各组gk大鼠糖耐量各点血糖值均明显高于正常对照组，表中可见，空腹16h后gk大鼠血糖值虽然高于正常大鼠血糖值，但升高并不特别明显,糖负荷后,大鼠各点血糖值均明显升高，以糖负荷60min达高点，糖负荷120min后血糖值有所下降，但仍明显高于正常对照组。
表23为第一次给药进行的葡萄糖耐量实验结果，在禁食16h后进行灌胃给药，给药后30min进行糖负荷。结果与模型组比较，格列本脲和aos药对葡萄糖负荷后的血糖升高均有不同程度的降低，atf药作用不明显。在糖负荷30min：以aos高、中剂量降低幅度最高，其次是aos低剂量和格列本脲；atf药各剂量组和二甲双胍降低不明显，与模型组比较（p>0.05）。在糖负荷60min：aos高、中、低剂量组和格列本脲均能明显抑制血糖值的升高（p<0.01），aos高、中剂量降低幅度最高，其次是aos低剂量、格列本脲和二甲双胍；高、中、低剂量atf药无降低作用，与模型组比较（p>0.05）。在糖负荷120min：除atf药，其它各组血糖值均低于模型组，以格列本脲组血糖降低幅度最大，其次是aos高、中、低剂量和二甲双胍组。
表24为给药8w末各组大鼠口服糖耐量结果，其糖负荷后各点血糖值变化趋势与第一次给药后糖耐量结果基本一致。
从表23、表24可见，s给药组大鼠各点血糖值及血糖升高速度和幅度均明显低于模型组，特别是aos中、高剂量组作用更明显（p<0.01），在降糖幅度上与格列苯脲组相近，但降糖速度上早于格列苯脲，即aos药给药30～60分钟血糖明显降低。而格列苯脲给药120分钟血糖降低明显。在改善糖耐量上优于二甲双胍，aos药高剂量和中剂量作用差异不明显。atf药对糖耐量无影响。
表22给药前各组大鼠糖耐量结果（x±s，n=10）mmol·l-1
与正常组比较，△△p<0.01
表23s药第一次给药糖耐量结果（x±s，n=10）mmol·l-1
与正常组比较，△△p<0.01；与模型比较，*p<0.05，**p<0.01。
表24给药8w各组大鼠糖耐量结果（x±s，n=10）mmol·l-1
与正常组比较，△△p<0.01；与模型比较，*p<0.05，**p<0.01
6.分析与讨论
本实验以aos、atf药低（相当临床人用量0.5倍）、中（相当临床人用量）、高（相当临床人用量2倍）剂量组干预gk大鼠，选用10只同源同周龄健康雄性wistar大鼠作为正常对照组，同时设格列本脲和二甲双胍为阳性对照药。结果表明，本实验用gk大鼠特点与文献报道一致，空腹12～16h血糖略有升高，但随机血糖及糖负荷后血糖明显升高，糖化血红蛋白明显升高，糖耐量明显降低，胰岛素抵抗明显。
沙蓬低聚糖(aos)aos药对gk大鼠随机血糖明显降低，而gk模型组大鼠随机血糖随着时间推移逐渐升高，aos药物干予组大鼠血糖有不同程度的降低，其中在给药4w降低效果最好，血糖值与格列苯脲及二甲双胍接近，在6w～8w随机血糖值又有所回升，但明显低于模型组（p<0.01)，aos药三个剂量之间无明显量效关系，各组血糖水平无明显差异（p>0.05），但以中剂量效果更好。
aos药高、中、低剂量组大鼠血清中的hbalc含量明显低于模型组（p<0.05），以aos高、中剂量组降低作用更明显，aos药组间无统计学差异（p>0.05）。但aos药降低hbalc作用弱于二甲双胍组和格列苯脲。同时显示，随机血糖水平与hbalc含量呈正相关。
aos药第一次给药进行的葡萄糖耐量实验中，在禁食16h后进行灌胃给药，30分钟后进行糖负荷。结果与模型组比较，各药物对葡萄糖负荷后的血糖升高均有不同程度的降低；在糖负荷30min以aos高、中剂量降低幅度最明显，其次是aos低剂量和格列本脲，二甲双胍降低不明显；在糖负荷60min各组血糖值均明显低于模型组（p<0.01），aos高、中剂量降低幅度最高，其次是aos低剂量，格列本脲和二甲双胍降低不明显；在糖负荷120min各组血糖值均明显低于模型组，以格列本脲组血糖降低幅度最大，其次是aos高、中剂量；显示了aos给药组大鼠各点血糖值及血糖升高速度和幅度均明显低于模型组，特别是aos中、高剂量组作用更明显（p<0.01），在降糖幅度上与格列苯脲组相近，但降糖速度上早于格列苯脲，即给药30-60分钟血糖明显降低。而格列苯脲给药120分钟血糖降低明显。在改善糖耐量上优于二甲双胍。aos药高剂量和中剂量作用差异不明显。血糖越高，aos药降糖作用越明显。
沙蓬总黄酮（atf）atf药不论在随机血糖、糖化血红蛋白，还是糖耐量方面与模型组比较均无显著性差异，因此认为，atf药对自发糖尿病gk大鼠无降血糖作用。
7.结论
综合分析上述实验结果认为沙蓬低聚糖(aos)对自发性2型糖尿病gk大鼠有明显降低随机血糖、改善糖耐量、降低胰岛素抵抗作用。
沙蓬总黄酮（atf）对自发性2型糖尿病gk大鼠血糖无影响。