本发明属于生物制药领域，涉及一种a、b、e、f型肉毒毒素四价疫苗及其制备方法。
背景技术：
肉毒毒素是肉毒梭菌产生的外毒素，是目前已知最毒的蛋白质，分为七种血清型(a-g)，其中自然存在的a、b、e和f型毒素能够造成人类中毒，c、d型则常引起动物、禽类中毒，g型引起人类中毒的报道较少。a型毒性最强，其小鼠致死剂量介于0.1-1ng/kg体重水平，而少至0.1-1μg的毒素就可导致成人中毒死亡，其毒性是有机磷神经毒剂沙林的10万倍。肉毒毒素曾被多个国家制备成生物战剂，同时也引起了恐怖组织的浓厚兴趣。因此肉毒毒素被美国cdc等机构列为六个最主要的生物战剂之一，属于危害性最高的a类生物剂。肉毒毒素中毒在人群中发病机率小，但其毒性大，致死率高，对公共卫生安全危害极大，必须引起人们的高度重视。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在，并且其芽孢对外界环境具有较强的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一个十分严重的公共卫生问题。因此，进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全，公共卫生安全，还是对人们的生命健康安全都具有重要的实际意义。
疫苗是预防肉毒中毒最有效的方法。美国的a、b、c、d和e型五价类毒素疫苗(pentavalentbotulinumtoxoid，pbt)于1959年首次接种于实验室工作人员，到目前已使用了50年，全球多个国家超过20,000名高危人群接种免疫这种疫苗。美军对发动沙漠风暴(desertstorm,90/91)行动的580名军人进行pbt免疫接种，到2002年共有8,000名军队服役人员进行了pbt疫苗接种。美国对维护国家生物安全、参与反恐行动的人员也进行了pbt疫苗接种。但目前以类毒素作为免疫原研发的肉毒毒素疫苗如五价类毒素疫苗(pbt)、单价e和f型类毒素疫苗以及七价类毒素疫苗，由于存在许多缺点(包括副作用大、免疫周期长等)，均未能获得fda批准上市。
在继续进行类毒素疫苗更新换代外的同时，一些发达国家尤其是美国，更注重研究第二代疫苗，如亚单位疫苗、核酸疫苗和其他基因工程载体疫苗等，其中最有前景的是亚单位疫苗。肉毒毒素重组受体结合区hc(50×103，mr)参与神经特异性结合，免疫学实验已证明此受体结合区是保护性抗原，可作为亚单位疫苗。此类新型疫苗较类毒素疫苗有以下优点：费用低，生产过程较安全，多次免疫后可以激发机体产生较强的免疫应答。美国多个科研单位利用大肠杆菌或酵母表达系统表达各型肉毒毒素重组蛋白以研发重组亚单位疫苗。同时英国、法国、瑞士、日本、澳大利亚和伊朗等国家科研人员也在相继开展这方面的研究工作。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种a、b、e、f型四价疫苗制剂及其制备方法与应用。
第一方面，本发明要求保护一种a、b、e、f型肉毒毒素四价疫苗。
本发明所提供的a、b、e、f型肉毒毒素四价疫苗，包括四种抗原、佐剂和缓冲体系；
所述四种抗原为a型肉毒毒素重组hc蛋白、b型肉毒毒素重组hc蛋白、e型肉毒毒素重组hc蛋白和f型肉毒毒素重组hc蛋白；
所述佐剂为铝佐剂，如可为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂；
所述缓冲体系为ph6.0的磷酸盐缓冲溶液或者ph5.5的醋酸盐缓冲溶液。
其中，所述ph6.0的磷酸盐缓冲溶液的溶剂为水，溶质为磷酸盐，浓度为20-50mmol/l(如20mmol/l)。所述ph5.5的醋酸盐缓冲溶液的溶剂为水，溶质为醋酸盐，浓度为20-50mmol/l(如20mmol/l)。
进一步地，在所述四价疫苗中，所述a型肉毒毒素重组hc蛋白、所述b型肉毒毒素重组hc蛋白、所述e型肉毒毒素重组hc蛋白、所述f型肉毒毒素重组hc蛋白和所述氢氧化铝佐剂的质量配比可为(20-80)μg：(20-80)μg：(20-80)μg：(20-80)μg：2mg。如(40-80)μg：(40-80)μg：(40-80)μg：(40-80)μg：2mg；更具体的如40μg：40μg：40μg：40μg：2mg或者80μg：80μg：80μg：80μg：2mg。
当所述疫苗为液体制剂时；所述a型肉毒毒素重组hc蛋白、所述b型肉毒毒素重组hc蛋白、所述e型肉毒毒素重组hc蛋白和所述f型肉毒毒素重组hc蛋白在所述液体制剂中的终浓度均可为20-80μg/ml(如40-80μg/ml，更具体的如40μg/ml或者80μg/ml)；所述氢氧化铝佐剂在所述液体制剂中的终浓度可为1-3mg/ml(如2mg/ml)。其中，所述氢氧化铝佐剂中铝含量(质量)占约一半。当抗原量降低时，铝佐剂量也可相应比例降低，并且研究结果也表明减少50％铝含量时其的吸附能力能够吸附相应浓度的抗原，因此1-3mg/ml所述氢氧化铝佐剂也能够用于上述制剂中。
进一步地，在所述四价疫苗中，还可含有保护剂和/或防腐剂；所述保护剂具体可为甘露醇或其他糖类或醇类物质。所述防腐剂可为间甲酚。
更进一步地，当所述疫苗为液体制剂时，所述甘露醇在所述液体制剂中的体积百分含量可为3～10％(如5％，甘露醇的作用一是保护剂，二是调整制剂的渗透压在等渗透压附近)；所述间甲酚在所述液体制剂中的终浓度可为2-2.5g/l(如2g/l)。
在本发明的具体实施方式中，所述四价疫苗由前文所述的四种抗原、所述佐剂、所述缓冲体系、所述保护剂和所述防腐剂组成。
第二方面，本发明要求保护前文所述四价疫苗的制备方法。
本发明所提供的前文所述四价疫苗的制备方法，可包括如下步骤：将所述四种抗原分别与其他组分混合，制得所述四价疫苗；所述其他组分为所述铝佐剂、所述缓冲体系、所述保护剂和所述防腐剂。
更进一步地，所述方法具体可包括如下步骤：
(a)将所述四种抗原分别与其他组分混合，制得四种单价疫苗；所述其他组分为所述铝佐剂、所述缓冲体系、所述保护剂和所述防腐剂；
(b)将所述四种单价疫苗制剂混合获得所述四价疫苗。
由该方法制备获得的所述四价疫苗中各组分的配比和/或含量符合上述第一方面中的相关描述。
第三方面，本发明要求保护一种用于制备前文所述四价疫苗的试剂盒。
本发明所提供的用于制备前文所述四价疫苗的试剂盒，含有前文所述a型肉毒毒素重组hc蛋白、所述b型肉毒毒素重组hc蛋白、所述e型肉毒毒素重组hc蛋白、所述f型肉毒毒素重组hc蛋白、所述铝佐剂、所述缓冲体系、所述保护剂和所述防腐剂。
所述试剂盒中各组分的配比和/或含量符合上述第一方面中的相关描述。
第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
(a)a型肉毒毒素重组hc蛋白、b型肉毒毒素重组hc蛋白、e型肉毒毒素重组hc蛋白和f型肉毒毒素重组hc蛋白在制备前文所述四价疫苗中的应用；
(b)前文所述试剂盒在制备前文所述四价疫苗中的应用；
(c)前文所述四价疫苗在预防由肉毒毒素所引起的肉毒中毒的应用。
其中，(c)中所述的肉毒毒素为a、b、e和/或f型肉毒毒素。
在上述第一至四方面中，所述a型肉毒毒素重组hc蛋白的氨基酸序列均具体如seqidno.1所示；所述b型肉毒毒素重组hc蛋白的氨基酸序列均具体如seqidno.2所示；所述e型肉毒毒素重组hc蛋白的氨基酸序列均具体如seqidno.3所示；所述f型肉毒毒素重组hc蛋白的氨基酸序列均具体如seqidno.4所示。
进一步地，所述a型肉毒毒素重组hc蛋白是将seqidno.5所示的a型肉毒毒素重组hc蛋白的编码基因进行原核表达(大肠杆菌表达系统)后得到的；所述b型肉毒毒素重组hc蛋白是将seqidno.6所示的b型肉毒毒素重组hc蛋白的编码基因进行真核表达(酵母表达系统)后得到的；所述e型肉毒毒素重组hc蛋白是将seqidno.7所示的e型肉毒毒素重组hc蛋白的编码基因进行原核表达(大肠杆菌表达系统)后得到的；所述f型肉毒毒素重组hc蛋白是将seqidno.8所示的f型肉毒毒素重组hc蛋白的编码基因进行原核表达(大肠杆菌表达系统)后得到的。
实验证明，在本发明的四价疫苗制剂配方条件下，四种抗原均能与铝佐剂结合很好。本发明所提供的用于预防a、b、e、f型肉毒毒素中毒的四价疫苗样品，能对四种毒素同时起到预防作用。鉴于a、b、e和f型毒素能够造成人类中毒，并考虑到各型肉毒毒素都可能作为生物恐怖剂使用，因此制备多价及四价预防疫苗是非常有必要的，可全面保护各型肉毒素中毒。
附图说明
图1为四型肉毒毒素重组抗原的发酵和纯化的中试工艺。
图2为中试生产工艺纯化的a、b、e和f型肉毒毒素重组hc蛋白抗原sds-page电泳检定结果。ahc：从左至右第1泳道，低分子量蛋白marker；第2-3泳道，sp柱纯化产物；第4-5泳道，q柱纯化产物；第7-8泳道，疏水柱纯化产物。bhc：从左至右第1-2泳道，mmc柱后产物；第3-4泳道，第一次source30s柱后产物；第5-6泳道，第二次source30s柱后产物；第7泳道，低分子量蛋白marker。ehc：从左至右第1泳道，低分子量蛋白marker；第2泳道，sp柱纯化产物；第3泳道，q柱纯化产物；第4泳道，source30s柱后产物。fhc：从左至右第1-3泳道，sp柱纯化产物；第4-6泳道，q柱纯化产物；第7-9泳道，source30s柱后产物；第10泳道，低分子量蛋白marker。
图3为ph6.0磷酸盐缓冲体系四价疫苗抗原被铝佐剂结合后sds-page电泳检测结果。1：低分子量蛋白marker；2：ab120、ef80al；3：abef80al；4：abef40al；5：ab120、ef80上清；6：abef80上清；7：abef40上清。其中a、b、e和f表示四种抗原；40、80和120表示相应抗原在四价疫苗中的浓度，单位μg/ml；al表示吸附了抗原的铝沉淀样品。
图4为四价疫苗制剂稳定性评价结果的sds-page电泳检测。a为四价疫苗制剂1个月稳定性结果：1，四价40μg/ml铝沉淀；2，四价80μg/ml铝沉淀；3，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml铝沉淀；4，四价40μg/ml上清；5，四价80μg/ml上清；6，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml上清。b为四价疫苗3个月稳定性结果：1，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml铝沉淀；2，四价80μg/ml铝沉淀；3，四价40μg/ml铝沉淀；4，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml上清；5，四价80μg/ml上清；6，四价40μg/ml上清。c为四价疫苗6个月稳定性结果：1，四价40μg/ml铝沉淀；2，四价80μg/ml铝沉淀；3，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml铝沉淀；4，四价40μg/ml上清；5，四价80μg/ml上清；6，a/b120μg/ml、e/f80μg/ml上清。d为四价疫苗12个月稳定性结果：1，四价40μg/ml铝沉淀；2，四价80μg/ml铝沉淀；3，四价40μg/ml上清；4，四价80μg/ml上清。
图5为中试四价疫苗配制与原液检定。a为配制的四价疫苗成品。b为四价疫苗原液sds-page检定：1，2为氢氧化铝佐剂沉淀；3、4为上清。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)和《中华人民共和国药典》(国家药典委员会编，2015年三部，化学工业出版社)。
实施例1、中试制备各型肉毒毒素重组蛋白
a型肉毒毒素重组hc蛋白：编码基因如seqidno.5所示(经过密码子优化)，编码seqidno.1所示蛋白质(命名为ahc)。
b型肉毒毒素重组hc蛋白：编码基因如seqidno.6所示(经过密码子优化)，编码seqidno.2所示蛋白质(命名为bhc)。
e型肉毒毒素重组hc蛋白：编码基因如seqidno.7所示(经过密码子优化)，编码seqidno.3所示蛋白质(命名为ehc)。
f型肉毒毒素重组hc蛋白：编码基因如seqidno.8所示(经过密码子优化)，编码seqidno.4所示蛋白质(命名为fhc)。
一、a、e和f型肉毒毒素重组hc蛋白中试制备
a、e、f型重组hc蛋白利用原核表达系统表达。三个原核表达载体分别是ptig-trx-ahc、ptig-trx-ehc和ptig-trx-fhc(即将ahc、ehc和fhc的编码基因分别插入到ptig-trx载体的酶切位点ecori和xhoi之间后得到的三个重组载体，其中ptig-trx载体的构建方法参见zl200910079258.4)，含无标签的ahc、ehc和fhc三个基因，能够表达重组ahc、ehc和fhc三个蛋白。转化该表达载体到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(tiangen公司)中，对此大肠杆菌进行培养，经过iptg诱导表达后，收集菌体破碎后收取上清进行各目的蛋白hc的纯化。利用图1所示工艺方案，进行了a、e和f型肉毒毒素重组抗原的发酵和纯化的中试工艺研究，获得了大量高纯度、高浓度的中试抗原(图2)，对抗原原液进行质量检定，确保原液质量合格。
二、b型肉毒毒素重组hc蛋白中试制备
由于前期原核表达的bhc蛋白表达产物不稳定且主要为涵体，其活性经证实不能够产生强的保护作用，因此选择酵母表达系统。但在酵母表达系统中表达会产生糖基化修饰，影响重组蛋白的免疫原性，无法产生较强的免疫保护作用，因此对b型肉毒毒素hc基因进行点突变将n957突变为q957(seqidno.2和seqidno.6所示序列为突变后序列)，以去掉糖基化位点，然后进行基因的克隆和蛋白的纯化。构建了ppiczαa-pre-mbhc酵母表达载体(即将seqidno.6所示dna片段插入到ppiczαa-pre载体(记载于“liub,shidy,changsh,gongx,yuyz,sunzw,wuj.characterizationandimmunologicalactivityofdifferentformsofrecombinantsecretedhcofbotulinumneurotoxinserotypebproductsexpressedinyeast.scientificreports,2015,5:7678”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)的酶切位点xhoi和noti之间后得到的重组载体)，并转化到毕赤酵母gs115中进行表达，表达结束后离心收集表达产物上清进行纯化。利用下列工艺方案(图1)，进行了b型肉毒毒素重组抗原的发酵和纯化的中试工艺研究，获得了大量高纯度、高浓度的中试抗原(图2)，对抗原原液进行质量检定，确保原液质量合格。
表1各型肉毒毒素重组hc抗原信息一览表
实施例2、各中试重组hc蛋白免疫小鼠后抗体水平检测及对各型肉毒毒素的保护作用
将以上实施例1制备所得的各重组抗原分别免疫小鼠，检验其免疫原性。具体方法为：将balb/c小鼠(6-8周，雌性，spf级，购自军事医学研究院实验动物中心)随机分组，每组8只，免疫剂量分别为1μg和10μg抗原蛋白每只小鼠，与终浓度为2mg/ml的氢氧化铝佐剂(alhydrogeltm2.0％，邦泰(brenntagbiosector)公司产品)混合，间隔3周加强免疫(抗原蛋白和铝佐剂的用量同上)，两或三次免疫后对小鼠采血，然后攻毒评价抗原的保护作用(观察一周，统计结果)，并用elisa法检测小鼠血清抗体滴度和用经典的体内中和实验测定中和效价，结果如表2至表5所示。
表2至表5所示结果表明，各重组hc抗原均具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生很强的免疫性保护反应，均可以作为重组亚单位疫苗的抗原，用于预防各型毒素中毒。
表2a型肉毒毒素重组hc蛋白免疫小鼠后的免疫原性和保护水平
注：gmt±sd表示每组的抗体滴度几何平均数(标准误)；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用105ld50/只a型肉毒毒素攻击进行保护性实验。
表3b型肉毒毒素重组hc蛋白免疫小鼠后的免疫原性和保护水平
注：gmt±sd表示每组的抗体滴度几何平均数(标准误)；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用104ld50/只b型肉毒毒素攻击进行保护性实验。
表4e型肉毒毒素重组hc蛋白免疫小鼠后的免疫原性和保护水平
注：gmt±sd表示每组的抗体滴度几何平均数(标准误)；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用103ld50/只e型肉毒毒素攻击进行保护性实验。
表5f型肉毒毒素重组hc蛋白免疫小鼠后的免疫原性和保护水平
注：gmt±sd表示每组的抗体滴度几何平均数(标准误)；2×表示二次免疫组，3×表示三次免疫组；最后一次免疫后3周，用103ld50/只f型肉毒毒素攻击进行保护性实验。
实施例3、重组抗原蛋白被氢氧化铝佐剂吸附的最佳缓冲液条件研究
以实施例1中所制备的各重组蛋白为抗原进行四价疫苗配制，首先研究抗原被氢氧化铝佐剂吸附的最佳条件。
一、ahc蛋白在不同缓冲条件下被铝佐剂吸附能力试验研究
为确定四价疫苗的最佳缓冲盐体系，对不同缓冲盐体系下ahc抗原被氢氧化铝佐剂吸附的效果进行了实验研究，各个缓冲盐浓度均选择20mm，考虑四种重组hc抗原的等电点ahc9.1、bhc6.9、ehc9.1、fhc8.9，选择偏酸性的缓冲盐条件进行了研究。将终浓度320μg/mlahc蛋白在不同缓冲条件下与终浓度为2mg/ml的氢氧化铝佐剂混合，缓冲盐体系选择磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐和琥珀酸盐，ph选择偏酸性条件(具体如下)。室温孵育1小时后离心，检测沉淀与上清中的蛋白含量，确定氢氧化铝佐剂结合各抗原蛋白的吸附率(表6)。
ph7.0和ph6.0的磷酸盐缓冲溶液：溶剂为水；溶质为磷酸盐，浓度为20mm。
ph5.5和ph7.0的醋酸盐缓冲溶液：溶剂为水；溶质为醋酸盐，浓度为20mm。
ph5.5的柠檬酸盐缓冲溶液：溶剂为水；溶质为柠檬酸盐，浓度为20mm。
ph5.5和ph4.5的琥珀酸盐缓冲溶液：溶剂为水；溶质为琥珀酸盐，浓度为20mm。
其中，重组蛋白被氢氧化铝佐剂吸附效率测定方法如下：
(1)为确定最佳的四价疫苗缓冲盐体系，进行不同体系下抗原被氢氧化铝佐剂吸附的实验。疫苗制剂配方包括缓冲盐、氢氧化铝佐剂2mg/ml、保护剂5％(体积百分含量)甘露醇、防腐剂2g/l间甲酚和抗原。预先配制好需要研究的各种10×缓冲溶液以及15％(体积百分含量)的甘露醇和4g/l的间甲酚，然后将抗原按照预定的终浓度与氢氧化铝佐剂混合，同时加入其它成分，并加入注射用水补足体积，配制成疫苗制剂，在室温条件下孵育1h后，11500rpm离心5min，取出上清液，收集吸附了抗原的铝沉淀并等体积重悬，sds电泳检测上清液和铝沉淀中的蛋白含量，并定量测定上清液中的蛋白，确定抗原被氢氧化铝佐剂吸附的结果，进行定性分析，从而选定最佳的缓冲体系。
(2)分光光度计测定法，用nanodrop紫外分光光度计，在proteina280模式下，对蛋白含量进行定量检测。可以测定抗原被氢氧化铝佐剂吸附实验上清中蛋白含量，并与无铝佐剂时原液进行对比，然后计算吸附率，进行定量分析。
表6ahc抗原在各个缓冲条件下吸附率(ahc终浓度320μg/ml)
以上结果表明，ph6.0磷酸盐缓冲体系吸附效果最好，吸附率达到93.1％；ph5.5的醋酸盐缓冲条件下吸附率也达到90.9％；而其他缓冲条件下吸附率较差。因此，选择ph6.0磷酸盐和ph5.5醋酸两个缓冲条件下进行下一步研究，以确定四价疫苗制剂。
二、各型重组蛋白在ph6磷酸盐和ph5.5醋酸盐缓冲液条件下吸附实验
根据步骤一的结果，选择ph6磷酸盐和ph5.5醋酸盐两个缓冲条件，对四型重组蛋白被铝佐剂吸附结果分别进行研究，确定不同抗原的结合率和最大结合量。将各抗原与终浓度为2mg/ml氢氧化铝佐剂混合，抗原终浓度调整到200、300、400、500、600μg/ml，室温孵育1h后检测吸附结果，定量测定上清中抗原含量确定吸附效率，从而计算出最大吸附量，结果如表7和表8所示。该结果表明各型抗原在终浓度较高时均会有部分无法被吸附。通过定量结果确定，随着抗原浓度的提高，吸附效率逐渐降低，说明单位质量氢氧化铝佐剂吸附抗原的量有一个最大值。在两种缓冲条件下四种抗原均能与被氢氧化铝佐剂很好的吸附。a、b、f型抗原最大吸附量达到400μg抗原/mg佐剂。e型最大吸附量较低，也达到300μg抗原/mg佐剂，能够满足研制四价疫苗的要求。因此，这两种缓冲条件均可。
表7各型重组抗原在ph6磷酸盐与醋酸盐条件下最大吸附量
表8各型重组抗原在ph5.5磷酸盐与醋酸盐条件下吸附率
三、四价疫苗制剂配制研究
疫苗制剂配方包括缓冲盐、氢氧化铝佐剂2mg/ml、保护剂5％(体积百分含量)甘露醇、防腐剂2g/l间甲酚和抗原(以上各浓度为相应物质在疫苗制剂中的终浓度)。选择了ph6.0磷酸盐和ph5.5醋酸盐两个缓冲盐体系，各型抗原终浓度为各40μg/ml进行了小试四价疫苗的配制。配四价疫苗时首先配制各型的单价疫苗，待各型重组hc抗原与氢氧化铝佐剂结合后，再将四种单价疫苗混合得到最终的制剂。经过实验研究，结果表明这两种缓冲盐体系小试配制的四价疫苗是可行的，确定了四种抗原能够同时与氢氧化铝佐剂结合。
为进一步确定不同抗原浓度四价疫苗的效果，进行了不同规格四价疫苗的配制。仅仅选择ph6.0磷酸盐缓冲体系下，各型抗原终浓度为各40μg/ml、80μg/ml，和a、b型抗原120μg/ml及e、f型抗原80μg/ml三个规格进行四价疫苗的配制。其余制剂配方以及配制方法同上。结果如图3所示，由图可见三种规格的四价疫苗制剂中各型抗原均能够被铝结合，并且上清中无相应抗原蛋白，这一结果说明各型抗原蛋白基本上均能够被铝佐剂结合。
实施例4、四价疫苗制剂稳定性研究
对实施例3步骤三配制的四价疫苗样品(对应图3的四价疫苗样品)进行稳定性研究。在4℃存放1、3、6和12个月后分别取样，检测抗原稳定性及与氢氧化铝佐剂结合的情况。结果如图4所示，由图可见四价疫苗制剂中各型重组抗原均能被铝佐剂结合，上清中无抗原游离，并且存放12各月后能够一直保持被氢氧化铝佐剂吸附，以上结果表明四价疫苗制剂具有很好的稳定性，进一步验证了该疫苗配方的可行性。
实施例5、四价疫苗制剂有效性研究
四价疫苗制剂配方包括磷酸盐缓冲体系、氢氧化铝佐剂2mg/ml、保护剂5％(体积百分含量)甘露醇、防腐剂2g/l间甲酚和抗原。四价疫苗制剂中四种抗原终浓度均为40/80μg/ml(以上各浓度为相应物质在疫苗制剂中的终浓度)。
用以上配制的四价疫苗制剂免疫小鼠，具体方法为：将balb/c小鼠(6-8周，雌性，spf级，购自军事医学研究院实验动物中心)随机分组，每组8只，免疫组分别免疫四价疫苗不同规格的制剂。而对照组免疫不含重组蛋白的缓冲体系原液。免疫二到三次，免疫剂量为每只小鼠肌肉注射100μl四价疫苗制剂，间隔三周进行加强免疫，剂量和方法同上。每次免疫前，以及最后一次免疫后第2周，小鼠尾部采血，分离血清，对小鼠进行攻毒观察小鼠存活结果，确定保护效果。最后测定小鼠血清针对各型毒素的中和效价。
用elisa法(用酶联免疫板包被各型hc抗原，浓度为2μg/ml，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以hrp标记羊抗鼠igg(santacruzbiotechnology,inc.)为二抗)测定血清抗体。终末稀释elisa法测定免疫动物血清中的特异性抗体滴度。以空对照组小鼠血清为阴性对照(即n)，四价疫苗免疫组的od492值(即p)达到0.5以上，并且p/n≥2.1为阳性。elisa检测结果：免疫后，各免疫组血清抗体平均滴度达到较高水平(>4.53)(表9)，免疫剂量与抗体滴度成相关性，高剂量组抗体滴度高，而对照组血清与免疫前相比始终为阴性。上述检测结果表明四价疫苗免疫小鼠后可使其体内产生针对四种抗原的较高滴度的特异性抗体。
为评价四价疫苗的保护效果，对免疫后的小鼠进行肉毒毒素攻毒(表9)。在二次免疫三周后对各个实验组和对照组分别进行四种毒素攻毒，攻毒剂量为a型105ld50每只，b型104ld50每只，e和f型103ld50/只。每组每种毒素攻毒8只。将各型毒素稀释到相应浓度后，攻毒方式为每只小鼠腹腔注射500μl，每24h观察小鼠存活情况，观察一周记录小鼠存活数。两次免疫后能够完全保护105ld50a型毒素攻毒、104ld50b型毒素攻毒、103ld50e和f型毒素攻毒。证明这两个规格的四价疫苗具有很好的有效性，能够刺激机体产生针对各型毒素的中和抗体，保护机体抵御肉毒毒素。
表9四价疫苗免疫小鼠后的免疫原性和保护水平
注：1.两次免疫后进行评价，a型毒素攻毒剂量为105ld50/只，b型毒素攻毒剂量为104ld50/只，e、f型毒素攻毒剂量为103ld50/只。2.每组的平均抗体滴度以每组单个血清样品抗体滴度的几何平均数(gmt±sd)表示。3.血清中和抗体用经典的体内中和实验测定。
此外，还用经典的体内中和实验测定了免疫小鼠血清抗体的体内中和活性及中和抗体效价，免疫后的小鼠血清中含有有效的中和抗体，中和抗体能够和毒素的受体结合区结合，从而封闭了该受体结合位点，使其不能结合到细胞受体而未能进入细胞，从而避免了对机体的毒害作用。根据药典2015版3510肉毒抗毒素效价测定法，设计如下方案测定小鼠血清中和效价。血清抗体滴度以每毫升国际单位(iu/ml)报告，一个iu定义为中和104ld50a、b、f毒素或者103ld50e毒素的中和抗体。
(1)毒素与待测样品稀释。将毒素稀释到100ld50/ml。然后将小鼠血清按照预计的效价稀释到与对应毒素相当的倍数，如预计2iu/ml的血清，稀释200倍到0.01iu/ml。同时将抗毒素标准品稀释到相应浓度。
(2)毒素与待测样品体外结合。将稀释后的1ml毒素与不同体积的稀释后血清或者标准品混合，每组设置5个梯度。用稀释液补齐至所有终体积为2.5ml，将毒素和抗体混合均匀，置于37℃温箱孵育15min，使毒素和抗体充分反应。
(3)动物给药与观察。将15-18g的spf级雌性km小鼠随机分组，每组4只。将孵育后的毒素与抗毒素结合样品腹腔注射到小鼠体内，注射剂量500μl/只，每个样品的每个稀释度给药4只。每天观察动物发病及死亡情况，连续7天。以标准品动物组50％死亡终点比较实验组动物的50％保护终点，推算出血清的效价。
四价疫苗两次免疫后小鼠血清中和效价到达1iu/ml以上(表9)，说明血清中含有较高水平的针对四型毒素的中和抗体，该中和抗体可用于制备抗毒素用于体内中和各型肉毒毒素治疗中毒。
以上结果表明，本发明的肉毒四价疫苗能够使四种抗原同时有效，免疫动物能够产生针对四型毒素的高水平中和抗体。
实施例6、四价疫苗制剂药效稳定性研究
四价疫苗制剂配方包括磷酸盐缓冲体系、氢氧化铝佐剂2mg/ml、保护剂5％(体积百分含量)甘露醇、防腐剂2g/l间甲酚和抗原。四价疫苗制剂中四种抗原终浓度均为80μg/ml(以上各浓度为相应物质在疫苗制剂中的终浓度)。
对4℃存放一年后的四价疫苗制剂进行有效性评价，选择80μg/ml规格的四价疫苗免疫动物，两次免疫后采血攻毒评价保护效果，并测量血清抗体滴度和中和效价，结果如表10所示。4℃存放一年后的四价疫苗仍具有很好的有效性，两次免疫后能够完全保护各型毒素攻毒，免疫后血清抗体滴度和中和抗体水平与原液配制的疫苗样品相比没有明显差异(p>0.05)，证明四价疫苗配方能够使四种抗原保持长期有效。
表10四价疫苗4℃放置一年后有效性评价结果
注：1.两次免疫后进行评价，a型毒素攻毒剂量为105ld50/只，b型毒素攻毒剂量为104ld50/只，e、f型毒素攻毒剂量为103ld50/只。
实施例7、四价疫苗样品中试配制与评价
四价疫苗制剂配方包括磷酸盐缓冲体系、氢氧化铝佐剂2mg/ml、保护剂5％(体积百分含量)甘露醇、防腐剂2g/l间甲酚和抗原。四价疫苗制剂中四种抗原终浓度均为40/80μg/ml(以上各浓度为相应物质在疫苗制剂中的终浓度)。
在中试条件下进行了中试四价疫苗的配制，选择各型重组hc抗原40μg/ml和80μg/ml两个规格(图5)。先配制各型的抗原浓度160μg/ml和320μg/ml单价疫苗，待抗原被完全吸附后进行等体积混合，配制成两个规格的四价疫苗制剂，然后按照每支0.5ml分装到西林瓶中密封保存四度长期存放。对四价疫苗进行了原液检定和有效性评价(表11)。
表11制备的中试四价疫苗有效性评价结果
注：1.两次免疫后进行评价，a型毒素攻毒剂量为105ld50/只，b型毒素攻毒剂量为104ld50/只，e、f型毒素攻毒剂量为103ld50/只。
用中试的四价疫苗免疫动物进行了有效性评价(表11)。两次免疫后能够完全保护105ld50a型毒素攻毒、104ld50b型毒素攻毒、103ld50e、f型毒素攻毒。免疫后小鼠血清中针对各型抗体的抗体滴度达到较高水平(>4.45)，中和效价达到1iu/ml以上。证明这两个规格的四价疫苗具有很好的有效性，能够刺激机体产生针对各型毒素的中和抗体，保护机体抵御肉毒毒素。
<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120>一种a、b、e、f型肉毒毒素四价疫苗及其制备方法
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