本发明涉及软骨修复
技术领域：
，尤其涉及一种软骨修复用海藻提取物及其制备方法。
背景技术：
：软骨是关节的防弹衣，是一类具有弹性光滑表面，执行关节承载功能的无血管组织。其主要由水、蛋白聚糖、粘多糖和it型胶原蛋白等细胞基质及其嵌入细胞外基质的软骨细胞组成。在软骨组织中软骨细胞是一种增殖能力较弱的终末分化细胞，其分泌的细胞外基质具有一定的生物学特性，在关节运动中具有降低磨损和缓冲振荡的作用。软骨损伤可以分为三类：(1)软骨浅层的损伤，是指损伤在软骨浅层的范围不超过10％～15％，在损伤早期肉眼无法看见，只能在电镜下看见一些绒毛，之后是粗糙，纵行裂隙加深，最后形成软骨表层的损伤。(2)软骨被钝性损伤，反复损伤造成软骨损坏，软骨细胞坏死，基质裂开，软骨下骨发生增生，软骨应力及应变方面的改变从而导致骨关节炎。(3)软骨及软骨下骨同时损伤，软骨下骨损伤后，血凝块和炎性细胞长入，在产生生长因子的同时有毛细血管未分化的细胞的迁入，形成基质而形成新生骨或纤维组织或软骨加基质。海藻，是生长在海洋里的低等隐花植物，分为蓝藻、红藻、绿藻和褐藻四大类8000余种。海藻不但可以食用，还是医药行业和农业领域可利用的一大类资源。生活在波涛汹涌的海水中，经受着深海低温和压力以及高盐分海水折磨的海藻，不仅植株体内汇聚了比陆生植物丰富得多的矿质元素，还含有人体必须的蛋白质、脂肪、碳水化合物、多种微生物。但是海藻中含有的甲硫醚、萜类物质具有异味，而且海藻提取液的粘度高，活性物质分子量大，为海藻提取物的生产加工和推广应用带来一定的困难。技术实现要素：根据本发明的一个方面，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种软骨修复用海藻提取物的制备方法。本发明公开一种软骨修复用海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取海藻粉，加入无水乙醇，回流脱脂，过滤取滤渣，得到脱脂海藻粉；步骤2：称取脱脂海藻粉，加入水，回流提取，离心，收集上清液；步骤3：向上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，搅拌，离心，取沉淀；将沉淀洗涤后，干燥即得。作为本发明优选的技术方案，所述软骨修复用海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取海藻粉，加入海藻粉重量5～10倍的无水乙醇，混合均匀，于60～70℃水浴回流脱脂10～30分钟，过滤，取滤渣，置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂海藻粉；步骤2：称取脱脂海藻粉，以物料比1：(20～35)(g/ml)加入煮沸后冷却至80～90℃的水，于80～90℃保温回流提取2～4小时，而后自然冷却至30～40℃，离心10～25分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入300～370ml浓度为0.01～0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌；加料完毕后，离心10～25分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，干燥即得。作为本发明另一优选的技术方案，所述软骨修复用海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取海藻粉，加入海藻粉重量5～10倍的无水乙醇，混合均匀，于60～70℃水浴回流脱脂10～30分钟，过滤，取滤渣，置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂海藻粉；步骤2：称取脱脂海藻粉，以物料比1：(20～35)(g/ml)加入煮沸后冷却至80～90℃的水，于80～90℃保温回流提取2～4小时，而后自然冷却至30～40℃，离心10～25分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入20～70ml浓度0.05～0.1g/ml的三氯乙酸溶液，于2～4℃放置12～16小时后，离心10～20分钟，取上清液b；将上清液b在蠕动泵的推送下通过截流分子量10～13kda的超滤膜，维持压力0.1～0.3mpa，收集透过液；步骤4：向步骤3收集得到的透过液中加入200～300ml浓度为0.01～0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌；加料完毕后，离心10～25分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，干燥即得。所述海藻粉采用以下方法得到：将海藻用自来水冲洗干净，干燥，粉碎，过筛，得到海藻粉；优选地，将海藻用自来水冲洗干净，干燥，粉碎，得到粗粉；将粗粉置于ph值为2～3的盐酸溶液中浸泡12～24小时进行一次水解，过滤收集滤饼ⅰ；滤饼ⅰ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，再置于ph值为4～5的盐酸溶液中浸泡12～24小时进行二次水解，过滤收集滤饼ⅱ；将滤饼ⅱ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，干燥，粉碎，过筛，得到海藻粉。在本发明中，所述海藻包括褐藻、红藻、绿藻、蓝藻；褐藻包括水云、团扇藻、海带、裙带菜、囊藻、马尾藻；红藻包括紫球藻、多管藻；绿藻包括衣藻、鼓藻、团藻、水绵藻、伞藻、蕨藻；蓝藻包括篮球藻、颤藻、念珠藻和发菜。作为本发明另一优选的技术方案，所述软骨修复用海藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取海藻粉，加入海藻粉重量5～10倍的无水乙醇，混合均匀，于60～70℃水浴回流脱脂10～30分钟，过滤，取滤渣，置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂海藻粉；步骤2：称取脱脂海藻粉，以物料比1：(20～35)(g/ml)加入煮沸后冷却至80～90℃的水，于80～90℃保温回流提取2～4小时，而后自然冷却至30～40℃，离心10～25分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入20～70ml浓度0.05～0.1g/ml的三氯乙酸溶液，于2～4℃放置12～16小时后，离心10～20分钟，取上清液b；将上清液b在蠕动泵的推送下通过截流分子量10～13kda的超滤膜，维持压力0.1～0.3mpa，收集透过液；步骤4：向步骤3收集得到的透过液中加入200～300ml浓度为0.01～0.02g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌；加料完毕后，离心10～25分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，干燥，将得到的固体物质保留备用；步骤5：将步骤4得到的固体物质使用蒸馏水配制成为浓度5～10mg/ml的溶液；取200～300ml上述溶液放入聚四氟乙烯消解罐中，加入50～90ml浓度4～12％的双氧水，于50～70℃超声降解6～12小时；将降解后的反应液用0.01～0.1mol/l的氢氧化钠水溶液中和至中性，经过孔径0.3～0.45μm的水膜过滤，除去固体杂质，保留滤液；向滤液中加入3～4倍体积的无水乙醇，混合均匀，于2～4℃放置12～24小时，过滤，取滤渣；滤渣用无水乙醇洗涤，干燥，得到所述海藻提取物。本发明所要解决的技术问题之二是提供一种软骨修复用海藻提取物，采用上述任一种软骨修复用海藻提取物的制备方法加工得到。作为本发明特别优选的实施方式，所述软骨修复用海藻提取物包括褐藻提取物10～30重量份、紫球藻提取物10～30重量份、蓝藻提取物10～30重量份。所述软骨修复用海藻提取物的剂型为凝胶、固形物、胶囊、乳膏。本发明所要解决的技术问题之三是公开了软骨修复用海藻提取物在制备治疗关节炎的药物中的应用。本发明所述软骨修复用海藻提取物，尤其适用于膝、肩、肘、髋、踝等软骨关节疾病和颈椎、腰椎等纤维软骨关节类疾病。本发明所述软骨修复用海藻提取物，经人体吸收后可以选择性地作用于患者病变关节破损的关节软骨及滑膜部位，修复破损，使之恢复弹性及抗压性等正常的运动生理机能，可以被用于治疗和预防全身各种关节的骨性关节炎，包括膝关节、肩关节、髋关节、手腕关节、颈及脊椎关节和踝关节等。具体实施方式实施例中原料介绍如下：实施例中褐藻，具体采用马尾藻。实施例中纱布，南通诚通纺织有限公司提供，材质为棉，纱支40*40。使用纱布过滤时，将8层纱布层叠使用。实施例中醋酸钠饱和乙醇溶液，指醋酸钠饱和于体积分数95％的乙醇中的溶液。实施例中孔径0.45μm的水膜，杭州富强化工仪器有限公司提供。实施例中红藻，具体采用紫球藻。实施例中蓝藻，具体采用念珠藻。对比例软骨修复用褐藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取褐藻粉100g，加入褐藻粉重量5倍的无水乙醇，混合均匀，于65℃水浴回流脱脂30分钟，使用纱布过滤，取滤渣；将滤渣置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂褐藻粉；步骤2：称取脱脂褐藻粉30g，以物料比1：20(g/ml)加入有机提取溶剂，于25℃搅拌提取12小时，搅拌转速100转/分钟，而后以4500转/分钟离心10分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入340ml浓度为0.01g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌，转速为100转/分钟；加料完毕后，以7000转/分钟离心10分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，沉淀和醋酸钠饱和乙醇溶液以及无水乙醇的物料比为1：30：50(g/ml/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，即得。所述褐藻粉采用以下方法得到：将褐藻用自来水冲洗干净，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到褐藻粉。植物活性成分提取的常用浸提溶剂有：石油醚、正己烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、二氯甲烷、正丁醇、乙酸丁酯、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇。对比例中挑选四种极性有一定差异的有机溶剂石油醚、氯仿、乙醚、甲醇作为提取溶剂进行试验，并计算海藻提取物的提取率。提取率的计算公式为：提取率(％)＝海藻提取物的质量/海藻粉原料的质量×100％。提取率统计结果见表1。表1不同有机提取溶剂的提取率统计表石油醚氯仿乙醚甲醇提取率(％)2.68.93.57.1从上述的数据可以看出，海藻中活性物质在氯仿相和甲醇相中溶解的成分相对较多，而在石油醚和乙醚相的溶解的成分相对较少。但是，总的来说，海藻内细胞物质的活性成分主要集中在剩余的残渣中。所以得出以下结论：海藻活性物质的提取并不适合使用有机溶剂提取，推测这可能与海藻主要成分为蛋白质和碳水化合物等有关。实施例1软骨修复用褐藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取褐藻粉100g，加入褐藻粉重量5倍的无水乙醇，混合均匀，于65℃水浴回流脱脂30分钟，使用纱布过滤，取滤渣；将滤渣置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂褐藻粉；步骤2：称取脱脂褐藻粉30g，以物料比1：20(g/ml)加入煮沸后冷却至90℃的水，于90℃保温回流提取2小时，而后自然冷却至30℃，以4500转/分钟离心10分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入340ml浓度为0.01g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌，转速为100转/分钟；加料完毕后，以7000转/分钟离心10分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，沉淀和醋酸钠饱和乙醇溶液以及无水乙醇的物料比为1：30：50(g/ml/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，即得。所述褐藻粉采用以下方法得到：将褐藻用自来水冲洗干净，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到褐藻粉。实施例2软骨修复用褐藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取褐藻粉100g，加入褐藻粉重量5倍的无水乙醇，混合均匀，于65℃水浴回流脱脂30分钟，使用纱布过滤，取滤渣；将滤渣置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂褐藻粉；步骤2：称取脱脂褐藻粉30g，以物料比1：20(g/ml)加入煮沸后冷却至90℃的水，于90℃保温回流提取2小时，而后自然冷却至30℃，以4500转/分钟离心10分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入40ml浓度0.05g/ml的三氯乙酸溶液，于4℃放置12小时后，以4500转/分钟离心20分钟，取上清液b；将上清液b在蠕动泵的推送下通过截流分子量10kda的超滤膜，维持压力在0.2mpa，收集透过液；步骤4：向步骤3收集得到的透过液中加入260ml浓度为0.01g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌，转速为100转/分钟；加料完毕后，以7000转/分钟离心10分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，沉淀和醋酸钠饱和乙醇溶液以及无水乙醇的物料比为1：30：50(g/ml/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，即得。所述褐藻粉采用以下方法得到：将褐藻用自来水冲洗干净，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到褐藻粉。实施例3软骨修复用褐藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取褐藻粉100g，加入褐藻粉重量5倍的无水乙醇，混合均匀，于65℃水浴回流脱脂30分钟，使用纱布过滤，取滤渣；将滤渣置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂褐藻粉；步骤2：称取脱脂褐藻粉30g，以物料比1：20(g/ml)加入煮沸后冷却至90℃的水，于90℃保温回流提取2小时，而后自然冷却至30℃，以4500转/分钟离心10分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入40ml浓度0.05g/ml的三氯乙酸溶液，于4℃放置12小时后，以4500转/分钟离心20分钟，取上清液b；将上清液b在蠕动泵的推送下通过截流分子量10kda的超滤膜，维持压力在0.2mpa，收集透过液；步骤4：向步骤3收集得到的透过液中加入260ml浓度为0.01g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌，转速为100转/分钟；加料完毕后，以7000转/分钟离心10分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，沉淀和醋酸钠饱和乙醇溶液以及无水乙醇的物料比为1：30：50(g/ml/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，即得。所述褐藻粉采用以下方法得到：将褐藻用自来水冲洗干净，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到粗粉；将粗粉置于ph值为2.5的盐酸溶液中浸泡24小时进行一次水解，粗粉和盐酸溶液的物料比为1：3(g/ml)，用纱布过滤收集滤饼ⅰ；滤饼ⅰ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，再置于ph值为4.5的盐酸溶液中浸泡12小时进行二次水解，滤饼ⅰ和盐酸溶液的物料比为1：3(g/ml)，用纱布过滤收集滤饼ⅱ；将滤饼ⅱ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到褐藻粉。实施例4软骨修复用褐藻提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤1：称取褐藻粉100g，加入褐藻粉重量5倍的无水乙醇，混合均匀，于65℃水浴回流脱脂30分钟，使用纱布过滤，取滤渣；将滤渣置于通风处使乙醇完全挥发，得到脱脂褐藻粉；步骤2：称取脱脂褐藻粉30g，以物料比1：20(g/ml)加入煮沸后冷却至90℃的水，于90℃保温回流提取2小时，而后自然冷却至30℃，以4500转/分钟离心10分钟，收集上清液a；步骤3：向步骤2得到的上清液a中加入40ml浓度0.05g/ml的三氯乙酸溶液，于4℃放置12小时后，以4500转/分钟离心20分钟，取上清液b；将上清液b在蠕动泵的推送下通过截流分子量10kda的超滤膜，维持压力在0.2mpa，收集透过液；步骤4：向步骤3收集得到的透过液中加入260ml浓度为0.01g/ml的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入过程中保持搅拌，转速为100转/分钟；加料完毕后，以7000转/分钟离心10分钟，取沉淀；将沉淀依次用醋酸钠饱和乙醇溶液、无水乙醇洗涤，沉淀和醋酸钠饱和乙醇溶液以及无水乙醇的物料比为1：30：50(g/ml/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，将得到的固体物质保留备用；步骤5：将步骤4得到的固体物质使用蒸馏水配制成为浓度6mg/ml的溶液；取200ml上述溶液放入聚四氟乙烯消解罐中，加入50ml浓度8％的双氧水，于50℃超声降解6小时，超声功率1200w；将降解后的反应液用0.01mol/l的氢氧化钠水溶液中和至中性，经过孔径0.45μm的水膜过滤，除去固体杂质，保留滤液；向滤液中加入3倍体积的无水乙醇，混合均匀，于4℃放置12小时，用纱布过滤，取滤渣；滤渣用无水乙醇洗涤，滤渣和无水乙醇的物料比为1：10(g/ml)，于40℃、绝对压强0.03mpa的真空干燥箱中烘干至恒重，得到所述海藻提取物。所述褐藻粉采用以下方法得到：将褐藻用自来水冲洗干净，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到粗粉；将粗粉置于ph值为2.5的盐酸溶液中浸泡24小时进行一次水解，粗粉和盐酸溶液的物料比为1：3(g/ml)，用纱布过滤收集滤饼ⅰ；滤饼ⅰ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，再置于ph值为4.5的盐酸溶液中浸泡12小时进行二次水解，滤饼ⅰ和盐酸溶液的物料比为1：3(g/ml)，用纱布过滤收集滤饼ⅱ；将滤饼ⅱ用蒸馏水冲洗至洗液呈中性，于105℃干燥2小时，粉碎，过40目筛，得到褐藻粉。实施例1～4的硫酸酯含量和提取率测试1、硫酸酯含量测试原理：水解的硫酸盐基团以硫酸钡形式沉淀，通过称量沉淀物的质量根据公式算出硫酸酯的质量分数。试剂和溶液：6mol/l的盐酸溶，0.1mol/l的氯化钡溶液。测定步骤：称取海藻提取物样品，经105℃烘干至恒重；将其装于有塞玻璃管中，加入20ml浓度6mol/l的盐酸溶液，密封后放进105℃的烘箱中水解6小时；然后取出，用定性滤纸过滤，并用热水反复洗涤至洗出液无氯离子为止；将得到的滤液与洗出液混合煮沸，在玻璃棒不断搅拌下滴入浓度为0.1mol/l的氯化钡溶液10ml，保持近沸腾状态2小时后，用定量滤纸过滤，并用热水洗涤脱氯；将沉淀连同滤纸放进已经煅烧至恒重的有盖坩埚中，置于高温炉内，先在200～300℃下炭化滤纸，然后升温至750～800℃煅烧40分钟，待炉温降至200℃后，取出坩埚置于干燥器内，冷却至室温后，称重。硫酸酯质量分数按下式进行计算：x(％)＝(m1-m2)×0.4116×100/m；x—样品中硫酸酯质量分数(以硫酸根离子计)，％；m1—瓷坩埚加残渣的质量，单位为克(g)；m2—瓷坩埚的质量，单位为克(g)；0.4116—硫酸钡折算成硫酸根离子的系数；m—样品的质量，单位为克(g)。2、提取率的计算公式为：提取率(％)＝海藻提取物的质量/海藻粉原料的质量×100％。表2海藻提取物硫酸酯含量和提取率测试结果表实施例1～4软骨修复效果测试试验动物：2月龄健康雄性sd大鼠，体质量310～360g，由广东省医学实验动物中心提供。软骨组织细胞的分离和培养：取新生3天龄sd大鼠乳鼠2只，颈椎脱臼处死后，在无菌条件下取双侧膝关节胫骨平台以及股骨内外侧的软骨组织；将软骨组织用磷酸盐缓冲液漂洗，用手术刀将漂洗后的软骨组织切成尺寸约为1mm×1mm×1mm大小的碎片；将碎片用磷酸盐缓冲液漂洗3次后，放入2.5％的胰蛋白酶中消化30分钟，置入盛有10ml含3g/mlⅱ型胶原酶的dmem培养基的培养皿中过夜，用70μm孔径细胞过滤器过滤消化液，获得软骨细胞团；将软骨细胞团用磷酸盐缓冲液漂洗后再次过滤，将细胞团置入dmem混悬后转至100ml培养瓶中，在37℃、5％co2培养箱中培养，每3天换液一次；当软骨细胞生长至90～100％融合时，加入0.25％胰蛋白酶2ml消化，按照1:2传代，取第2代细胞备用。软骨细胞-海藻提取物凝胶的制备：以磷酸盐缓冲液为溶剂，配置质量分数为0.5％的海藻提取物溶液，搅拌溶解后静置除去气泡。取培养好的第2代软骨细胞，以1×106/ml加入海藻提取物溶液中，混合均匀。取混合溶液，用4号针头滴入质量分数0.2％的氯化钙溶液中，静置15分钟，形成凝胶球。将凝胶球滤出，使用磷酸盐缓冲液漂洗后，置入含dmem的6孔板中备用。颅骨缺损模型的建立和分组：取2月龄健康雄性sd大鼠，随机分组，称大鼠质量后，用4％的水合氯醛按照1ml/100g剂量进行腹腔麻醉，备皮消毒。随后在颅骨顶侧做长约2.5cm的正中纵切口，暴露术区，用直径5mm圆形孔钻在顶骨做直径为5mm的全层缺损，钻孔过程中用冷藏生理盐水持续冲洗，形成颅骨缺损模型。在大鼠颅骨缺损的部位植入凝胶球，充分止血后缝合切口，肌注抗生素，术后第2、4天追加抗生素。手术6周后，采用二氧化碳窒息法处死试验大鼠，切开头皮，暴露颅骨实验区域，取下整块头盖骨。以颅骨圆形缺损圆心为中点，创建一个直径5mm、高1mm的圆柱形，能够包含整个缺损部位。统计该区域内的骨组织体积分数、骨矿物质密度、骨小梁数目。具体测试结果表见表3。表3软骨修复效果测试结果表从上述数据可以看出，实施例3～4的软骨修复效果明显高于实施例1～2，差异具有统计学意义(p＜0.01)。而且，在术后恢复时间，没有发生动物死亡或者病变的情况，试验大鼠饮食、活动良好，没有红肿开裂的现象。这说明本发明所述海藻提取物具有良好的软骨修复效果。其中实施例4的软骨修复效果最佳，推测是由于实施例4采用二次酸解后的海藻粉作为原料，有利于海藻细胞内活性物质的释放，然后在双氧水作用下超声降解，提高生物体对海藻提取率的吸收利用率。实施例1～4的平均分子量测定海藻提取物的平均分子量使用液质联用法测定，色谱条件如下：电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪(brukermaxisuhr-tof)；柱子：aglientsec-5，4.6×150mm，5μm；流动相：50mm乙酸铵，ph7.0；流速：350μl/min；进样体积：10μl；离子源：电喷雾离子源，正离子模式；千燥气：雾化气6.0l/min：毛细管温度：180℃；扫描范围：300～2900m/z；测定时，将样品以流动相制成浓度为1mg/ml的溶液，取10μl注入质谱仪。实施例1～4的平均分子量为1398da、1199da、802da、203da。实施例5软骨修复用海藻提取物，包括褐藻提取物30重量份、红藻提取物30重量份、蓝藻提取物30重量份。褐藻提取物采用实施例4的方法得到。红藻提取物和蓝藻提取物参考实施例4的方法得到，将原料由褐藻分别替换为红藻和蓝藻即得到。实施例6软骨修复用海藻提取物，包括褐藻提取物45重量份、红藻提取物45重量份。褐藻提取物采用实施例4的方法得到。红藻提取物参考实施例4的方法得到，将原料由褐藻替换为红藻即得到。实施例7软骨修复用海藻提取物，包括褐藻提取物45重量份、蓝藻提取物45重量份。褐藻提取物采用实施例4的方法得到。蓝藻提取物参考实施例4的方法得到，将原料由褐藻替换为蓝藻即得到。关节炎治疗效果测试类风湿关节炎是一种以慢性进行性关节破坏为主的自身免疫性疾病，其基本病理特征为滑膜炎及血管翳形成，炎症滑膜中成纤维样滑膜细胞数量异常增多，是类风湿性关节炎的主要原因之一。成纤维样滑膜组织标本收集：取自类风湿性关节炎患者。类风湿性关节炎诊断符合1987年美国风湿病协会修订的分类标准。标本收集在征得试验者知情同意后进行。成纤维样滑膜组织体外培养：采用改良组织块培养法对活检滑膜组织进行原代培养，试验用第4代成纤维样滑膜组织。试验时，使用含10％fbs的dmem/f12培养基(武汉谱诺赛生物科技有限公司提供)将软骨修复用海藻提取物配置成浓度20mg/ml的溶液。cck-8比色法检测软骨修复用海藻提取物对成纤维样滑膜组织增殖的影响：将成纤维样滑膜组织以5000个/孔接种于96孔板，使用浓度20mg/ml的软骨修复用海藻提取物溶液干预5天后终止培养，加入cck-8孵育3小时后取出96孔板，于酶标分析仪(492nm)处测定吸光度(a值)，计算细胞增殖抑制率。计算公式为：细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组a值/对照组a值)×100％。每个实施例设置5个复孔，试验重复3次。具体测试结果见表4。表4关节炎治疗效果测试结果表从表4中可以看出，实施例5相较于实施例6和实施例7，海藻提取物对成纤维样滑膜细胞的增殖抑制率最高，说明通过褐藻提取物、红藻提取物、蓝藻提取物的有机配伍，软骨修复用海藻提取物提供多种外源性营养成分，促进软骨细胞的增殖和分化。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12