一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法及该海藻发酵液在化妆品中的应用与流程

本发明属于微生物发酵海藻技术领域，尤其涉及一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法及该海藻发酵液在制备化妆品中的应用。

背景技术：

海藻种类繁多，资源丰富，是重要的海洋资源。在我国，海藻主要以海带为主。海带又名昆布、纶布，常作为食品和中药原料，不仅含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质，还含有如褐藻酸、褐藻糖胶、褐藻淀粉、褐藻纤维、甘露醇、海带氨酸、高不饱和脂舫酸、岩藻黄质和甾醇类化合物等丰富的生理活性物质。然而，目前我国海带的开发主要集中于海带食品、海藻(带)肥料和碘、海藻酸、甘露醇等化工原料的提取，均属于海藻的浅加工，技术含量低，产品附加值低，尚没有对海藻进行深度加工，高效综合利用海藻中的活性物质。

海藻具有生长环境纯净、生命力强、活性成分含量高等优点，在欧美国家已成为被广泛认可的护肤品领域的主要功能性原料，众多一线护肤品牌均开发了海藻元素类护肤品，然而目前海藻液的提取多是基于酸、碱法，该方法不仅提取率低，更重要的是酸碱的使用带来一系列污废处理的问题，提高成本的同时对环境污染破坏严重。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种安全性高、无污染的益生菌发酵制备海藻发酵液的方法及该海藻发酵液在制备化妆品中的应用，所述方法制备获得的海藻发酵液活性成分种类和含量高，护肤效果好、稳定性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法，包括以下步骤：1)海藻超微粉碎后获得粒度为1～100μm的海藻粉；2)将所述海藻粉与芽孢杆菌发酵液混合，进行第一发酵24～48h，去除芽孢杆菌菌体后获得第一海藻发酵液；3)向所述第一海藻发酵液中接种酵母菌，进行第二发酵48～72h，获得第二海藻发酵液；4)向所述第二海藻发酵液中接种乳酸菌，进行第三发酵48～72h，获得第三海藻发酵液；5)将所述第三海藻发酵液置于8～12℃后熟15～60d，固液分离，液相组分获得海藻发酵液。

优选的，步骤1)中所述海藻原料为干燥海藻时，在超微粉碎前包括浸泡和烘干步骤；所述浸泡用水为干海藻质量的10～20倍，所述浸泡的时间为2～5h。

优选的，步骤1)中所述烘干的温度为45～70℃；所述烘干后海藻的含水量≤5％。

优选的，步骤2)中芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌中的一种或多种；所述芽孢杆菌发酵液中的活菌数为0.5～9.5×10⁹cfu/ml。

优选的，步骤2)中海藻粉的质量为芽孢杆菌发酵液质量的6～10％。

优选的，步骤3)中所述的酵母菌为布拉氏酵母菌、酿酒酵母菌、增香酵母菌、魏氏酵母、异常汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、粉状毕赤酵母、产甘油假丝酵母和产朊假丝酵母中的一种或多种。

优选的，步骤4)中所述的乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和蜷曲乳杆菌中的一种或几种；

优选的，所述乳酸菌替换为小牛葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌。

优选的，步骤3)中所述的酵母菌和步骤4)中所述的乳酸菌的接种量独立的为4～6％(体积)。

本发明还提供了所述方法制备获得的海藻发酵液，所述海藻发酵液中褐藻酸含量为海藻原料干重的1.2～1.8％，岩藻多糖硫酸酯的含量为海藻原料干重的0.6～1.0％。

本发明还提供了所述的海藻发酵液在制备化妆品中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的益生菌发酵制备海藻发酵液的方法，通过芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌依次发酵海藻粉获得，发酵所用的菌株均为食品级益生菌，更安全，采用微生物发酵的方法避免了化学酸碱法中化学试剂的使用，减少污染。本发明所述方法制备获得的海藻发酵液中活性成分种类和含量高，本发明使用的益生菌具有卓越的褐藻发酵能力，使海藻中活性成分完整保留并充分释放，同时所述的益生菌菌株自身会产生谷胱甘肽、伽马氨基丁酸等活性成分，增加发酵产物中活性成分种类和含量。本发明所述方法制备获得的海藻发酵液具有很好的皮肤细胞修复和再生的功效，稳定性高，根据实施例记载，通过成纤维细胞增殖实验、细胞划痕实验和胶原蛋白合成实验显示，所述海藻发酵液具有显著的细胞增殖能力，卓越的细胞修复能力和促进胶原蛋白合成能力；经过防腐挑战实验和原料的加速稳定挑战实验证实所述海藻发酵液具有良好的稳定性。

附图说明

图1为实施例4中海藻发酵液划痕挑战实验结果图；

图2为添加稀释200倍海藻发酵液的成纤维细胞生长曲线；

图3为与海藻发酵液混合的细胞的一型前胶原蛋白酶反转录结果；

图4为与海藻发酵液混合的细胞的三型前胶原蛋白酶反转录结果。

具体实施方式

本发明提供了一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法，包括以下步骤：1)海藻经超微粉碎后获得粒度为1～100μm的海藻粉；2)将所述海藻粉与芽孢杆菌发酵液混合，进行第一发酵24～48h，去除芽孢杆菌菌体后获得第一海藻发酵液；3)向所述第一海藻发酵液中接种酵母菌，进行第二发酵48～72h，获得第二海藻发酵液；4)向所述第二海藻发酵液中接种乳酸菌，进行第三发酵48～72h，获得第三海藻发酵液；5)将所述第三海藻发酵液置于8～12℃后熟15～60d，固液分离，液相组分为海藻发酵液。

本发明对所述海藻的来源没有限定，采用本领域常规海藻即可。在本发明中，所述海藻优选为海带。在本发明中，所述海带优选为干海带，本发明对所述干海带的来源没有限定，采用常规市售的干海带即可。在本发明中，将所述干海带浸泡；所述浸泡用水优选为纯净水，所述浸泡用水的量优选为干海带质量的10～20倍，更优选的为14～16倍，最优选的为15倍。本发明中所述浸泡的温度优选的为20～30℃，更优选的为22～28℃；所述浸泡的时间优选的为2～5h，更优选的为3～4h。本发明中所述浸泡的目的为使干海带充分泡发。本发明在所述浸泡后，优选的用纯净水反复冲洗2～5次，每次冲洗的时间优选的为10～15min；所述冲洗的目的为洗掉海带表面的泥沙和盐分。

本发明获得浸泡后的海带后，将所述浸泡后的海带烘干，在本发明中，所述烘干的温度优选为45～70℃，更优选的为50～65℃，本发明对所述烘干的时间没有特殊限定，以烘干后海带的含水量来确定；所述烘干后海带的含水量优选的≤5％。本发明采用较低的温度对海带进行烘干，目的在于低温烘干不会破坏褐藻中所含活性成分的种类、含量及结构。

本发明在所述海带烘干后，对其进行超微粉碎获得海藻粉。本发明中所述超微粉碎采用本领域常规的超微粉碎设备即可，在本发明具体实施过程中，所述超微粉碎采用北京开创同和科技发展有限公司的kc-701植物超微粉碎机进行。

在本发明中，所述超微粉碎的时间优选的为10～20min，更优选的为12～18min；所述超微粉碎的粒度优选的为1～100μm，更优选的为10～50μm。

本发明在获得海藻粉后，优选的对海藻粉进行灭菌；所述灭菌优选的采用辐照灭菌，辐照灭菌委托山东泉港辐射科技发展有限公司进行；所述辐照灭菌的计量优选的为1000～2500千拉德，所述辐照灭菌的时间优选的为1.5～2.5h，更优选的为2h。

本发明在获得海藻粉后，将所述海藻粉与芽孢杆菌发酵液混合，进行第一发酵24～48h，去除芽孢杆菌菌体后获得第一海藻发酵液。在本发明中所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌中的一种或多种；本发明中所述芽孢杆菌均为益生菌，本发明对所述芽孢杆菌的来源没有限定，采用本领域常规上述芽孢杆菌即可。本发明中所述芽孢杆菌发酵液中的活菌数优选为为0.5～9.5×10⁹cfu/ml，更优选的为1.0～6.0×10⁹cfu/ml。

在本发明中，所述芽孢杆菌发酵液通过以下方法获得：活化培养所述芽孢杆菌，然后将所述活化后的芽孢杆菌接种到发酵培养基中进行发酵培养获得芽孢杆菌发酵液。

在本发明中，所述活化培养的培养基优选的为肉汤培养基，所述活化培养的温度优选的为35～38℃，更优选的为37℃；所述活化培养的时间优选的为20～28h，更优选的为22～26h，最优选的为24h；所述活化培养的转速优选的为180～220rpm，更优选的为200rpm。

本发明在所述活化培养后，将活化后的芽孢杆菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，在本发明中，所述发酵培养的条件与上述技术方案所述活化培养一致，所述发酵培养基优选的包括以下质量百分比的组分：1.5～2.5％葡萄糖，1.0～2.0％蛋白胨，0.04～0.06％的氯化钠，0.04～0.06％的牛肉膏和余量的水；更优选的包括12％葡萄糖，1.5％蛋白胨，0.05％的氯化钠，0.05％的牛肉膏和余量的水。

本发明在获得芽孢杆菌发酵液后，将所述的海藻粉与芽孢杆菌发酵液混合，进行第一发酵。在本发明中，所述海藻粉的质量优选的为芽孢杆菌发酵液质量的4～6％，更优选的为5％。在本发明中，所述第一发酵的温度优选为35～38℃，更优选为37℃；所述第一发酵的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm；所述第一发酵的时间优选为24～48h，更优选为28～44h。在所述第一发酵期间，所述海藻粉伴随芽孢杆菌生长产生的多种酶类进行降解，发酵料液的粘度逐渐增大。本发明在所述第一发酵结束后，对发酵料液进行固液分离以去除芽孢杆菌菌体，获得第一海藻发酵液。在本发明中所述固液分离的方法优选的为离心，所述离心的转速优选的为5000～7000rpm，更优选的为5500～6500rpm；所述离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min。

本发明在获得第一海藻发酵液后，向所述第一海藻发酵液中接种酵母菌，进行第二发酵48～72h，获得第二海藻发酵液。在本发明中，所述的酵母菌优选的为布拉氏酵母菌、酿酒酵母菌、增香酵母菌、魏氏酵母、异常汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、粉状毕赤酵母、产甘油假丝酵母和产朊假丝酵母中的一种或多种。在本发明中，所述酵母菌优选的经过活化培养后进行接种；在本发明中，所述酵母菌活化培养的培养基优选的为麦芽汁培养基，所述活化培养的温度优选的为28～32℃，更优选的为30℃；所述活化培养的时间优选的为44～52h，更优选的为48h；所述活化培养优选的为静置培养。在本发明中，所述酵母菌的接种量优选的为4～6％(体积)，更优选的为5％(体积)。在本发明中，所述第二发酵的温度优选为28～33℃，更优选为30℃；所述第二发酵优选为静置发酵；所述第二发酵的时间优选为48～72h，更优选为62～68h。本发明中，第二发酵过程中，由于酵母菌株自溶裂解后，会释放细胞内容物，所述细胞内容物含有较多的氨基酸、小肽、核苷酸等活性物质，对皮肤的新陈代谢具有促进作用。本发明在所述第二发酵结束后，不进行固液分离，保留酵母菌菌体。

本发明在获得所述第二海藻发酵液后，向所述第二海藻发酵液中接种乳酸菌，进行第三发酵48～72h，获得第三海藻发酵液。本发明中，所述乳酸菌优选的为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌、格氏乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和蜷曲乳杆菌中的一种或几种。在本发明中，所述乳酸菌优选的经过活化培养后进行接种；在本发明中，所述乳酸菌活化培养的培养基优选的为mrs培养基，所述活化培养的温度优选的为28～32℃，更优选的为30℃；所述活化培养的时间优选的为32～40h，更优选的为36h；所述活化培养优选的为静置培养。本发明中所述的乳酸菌的接种量优选为4～6％(体积)，更优选为5％(体积)。在本发明中，所述第三发酵的温度优选为28～33℃，更优选为30℃；所述第三发酵优选为静置发酵；所述第三发酵的时间优选为48～72h，更优选为62～68h。

在本发明中，上述技术方案所述乳酸菌也可替换为葡萄球菌，具体为小牛葡萄球菌和/或木糖葡萄球菌。

本发明在获得所述第三海藻发酵液后，将所述第三海藻发酵液置于8～12℃后熟15～60d，固液分离，收集液相组分获得海藻发酵液。在本发明中，所述后熟的温度优选的为10℃，所述后熟的时间优选为20～50d；本发明中所述后熟的作用为通过低温后熟转化使发酵液中的活性成分趋于稳定。

本发明在所述后熟结束后，进行固液分离，所述固液分离优选的包括依次进行的离心和膜过滤。在本发明中所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选的为10000rpm；所述离心的时间优选的为5～20min，更优选的为8～15min。本发明在所述离心后，收集上清液，然后将所述上清液进行膜过滤，收集滤过组分为海藻发酵液。在本发明中所述膜过滤的滤膜直径优选的为0.2～0.3μm，更优选的为0.22μm。

本发明还提供了所述方法制备获得的海藻发酵液，所述海藻发酵液中褐藻酸含量为海藻原料干重的1.2～1.8％，优选为1.5％，岩藻多糖硫酸酯含量为海藻原料干重的0.6～1.0％，优选为0.7％，以上两种成分都具有明显的促进细胞增殖的作用，促进胶原蛋白合成，能够延缓和抵抗细胞衰老。

本发明还提供了所述的海藻发酵液在制备化妆品中的应用。在本发明中，所述海藻发酵液作为原料与其他活性原料和赋形剂混合制备化妆品。在本发明中，所述海藻发酵液无需浓缩，可以直接添加到化妆品配方中，添加量优选为2％～50％，具体根据化妆品的用途及成本决定。

在本发明中，所述化妆品为本领域常规化妆品，包括护肤水、护肤乳液、润肤霜、精华素、面膜。

下面结合实施例对本发明提供的一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法及该海藻发酵液在制备化妆品中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：

1)干海带用纯净水浸泡，取1份海带和15份水；干海带充分浸泡后用纯净水反复冲洗，洗掉海带表面的泥沙和盐分；

2)干净的海带低温烘干，烘干的海带超微粉碎粉粒径低于50μm；

3)将发酵所用的菌株进行活化，其中发酵所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌；布拉氏酵母菌、酿酒酵母菌、增香酵母菌；嗜酸乳杆菌、蜷曲乳杆菌。

4)将低温烘干的海带进行辐照灭菌，1000～2500千拉德辐照2小时；

5)将活化好的解淀粉芽孢杆菌用发酵培养基进行培养，培养基配方为：1l蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏。芽孢杆菌培养至细胞活菌数达到10⁹cfu/ml后，将超微粉碎并灭菌的海带粉按照5％的比例接入发酵液，继续培养芽孢杆菌；

6)海带粉伴随芽孢杆菌生长产生的多种酶类进行降解，海带及培养基逐渐变成粘度较大的发酵海带液，发酵24小时后，停止发酵；

7)发酵结束后，用6000rpm/min离心10分钟，去除芽孢杆菌菌体，再按照5％总接菌量分别接入布拉氏酵母菌1％、酿酒酵母菌2％和2％增香酵母菌进行二次发酵，发酵条件为30度静置培养72小时；

8)酵母菌发酵结束后，按照5％的接菌量接入乳酸菌进行第三次发酵，发酵条件为30度静置培养48小时；

9)三种菌株混合发酵混合发酵结束后，将发酵液放入10度低温环境进行后熟转化，后熟时间为15天；

10)后熟结束后，将液体进行离心，收集上清液，离心条件为10000rpm/min离心10分钟；

11)将离心上清用0.22um滤膜进行过滤，所得清液进行防腐挑战实验，得出该发酵海带上清的防腐配方为0.6％pe9010；

将所得海藻发酵液进行划痕挑战实验，以纯水作为对照。试验方法如下：①将成纤维细胞hsf-nih3t3以1×10⁵个/ml密度接种于六孔板内，培养液为含10％发酵海带的dmem,待细胞80％融合后，用自制刮刀在单细胞层纵向划痕，造成细胞创口模型；②划痕后随机分成发酵海带和对照组，对照组培养液更换为无血清dmem，在倒置显微镜下拍摄照片作为0h；③创口形成后6h，12h，48h拍摄照片。

图1中4为添加海藻发酵液的细胞培养照片，图1中7为未添加发酵海藻液的对照。由图1可以看出，细胞经过48小时培养，看到纵向划痕明显减小，细胞伤口愈合，具有显著的细胞修复能力。而对照组的划痕无明显变化。

实施例2：

1)干海带用纯净水浸泡，取1份海带和10份水；干海带充分浸泡后用纯净水反复冲洗，洗掉海带表面的泥沙和盐分；

2)干净的海带低温烘干，烘干的海带超微粉碎粉粒径低于70um；

3)将发酵所用的菌株进行活化，其中发酵所用的菌株为纳豆芽孢杆菌；黏红酵母、粉状毕赤酵母；格氏乳杆菌、双歧杆菌；

4)将低温烘干的海带进行辐照灭菌，1000～2500千拉德辐照2小时；

5)将活化好的纳豆芽孢杆菌用发酵培养基进行培养，培养基配方为：1l蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏。纳豆芽孢杆菌培养至细胞活菌数达到10⁹cfu/ml后，将超微粉碎并灭菌的海带粉按照5％的比例接入发酵液，继续培养芽孢杆菌；

6)海带粉伴随芽孢杆菌生长产生的多种酶类进行降解，海带及培养基逐渐变成粘度较大的发酵海带液，发酵36小时后，停止发酵；

7)发酵结束后，用6000rpm/min离心10分钟，去除芽孢杆菌菌体，再按照5％接菌量接黏红酵母和粉状毕赤酵母进行二次发酵，发酵条件为30度静置培养48小时；

8)酵母菌发酵结束后，按照5％的接菌量接入格氏乳杆菌、双歧杆菌进行第三次发酵，发酵条件为30度静置培养56小时；

9)三种菌株混合发酵混合发酵结束后，将发酵液放入10度低温环境进行后熟转化，后熟时间为30天；

10)后熟结束后，将液体进行离心，收集上清液，离心条件为10000rpm/min离心10分钟；

11)将离心上清用0.22um滤膜进行过滤，所得清液进行防腐挑战实验，得出该发酵海带上清得防腐配方为0.6％pe9010；

将所得海藻发酵液分别稀释进行成纤维细胞的增殖实验。实验步骤如下：将皮肤成纤维细胞种于96孔板中，每孔200ul，浓度为5×10⁴，培养一天，第二天将海藻发酵液稀释10倍，50倍，100倍，200倍，加入96孔板中，每孔100μl，培养一天，第三天加入cck8进行检测。图2为添加稀释200倍发酵海带原料的成纤维细胞生长曲线。由图2可以看出，海藻发酵液具有明显的促进细胞增殖的作用。成纤维细胞的增殖和细胞衰老密切相关，因此，发酵海带原料具有潜在的抵抗细胞衰老的功效。

实施例3：

1)干海带用纯净水浸泡，取1份海带和17份水；干海带充分浸泡后用纯净水反复冲洗，洗掉海带表面的泥沙和盐分；

2)干净的海带低温烘干，烘干的海带超微粉碎粉粒径低于100um；

3)将发酵所用的菌株进行活化，其中发酵所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌；产朊假丝酵母；嗜热链球菌、干酪乳杆菌；

4)将低温烘干的海带进行辐照灭菌，1000～2500千拉德辐照2小时；

5)将活化好的解淀粉芽孢杆菌用发酵培养基进行培养，培养基配方为：1l蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏。解淀粉芽孢杆菌培养至细胞活菌数达到10⁹cfu/ml后，将超微粉碎并灭菌的海带粉按照5％的比例接入发酵液，继续培养解淀粉芽孢杆菌；

6)海带粉伴随芽孢杆菌生长产生的多种酶类进行降解，海带及培养基逐渐变成粘度较大的发酵海带液，发酵48小时后，停止发酵；

7)发酵结束后，用6000rpm/min离心10分钟，去除芽孢杆菌菌体，再按照5％接菌量接产朊假丝酵母进行二次发酵，发酵条件为30度静置培养56小时；

8)产朊假丝酵母菌发酵结束后，按照5％的接菌量接入嗜热链球菌和干酪乳杆菌进行第三次发酵，发酵条件为30度静置培养72小时；

9)三种菌株混合发酵混合发酵结束后，将发酵液放入10度低温环境进行后熟转化，后熟时间为45天；

10)后熟结束后，将液体进行离心，收集上清液，离心条件为10000rpm/min离心10分钟；

11)将离心上清用0.22um滤膜进行过滤，所得清液进行防腐挑战实验，得出该海藻发酵液的防腐配方为0.6％pe9010；

对所得海藻发酵液进行胶原蛋白合成促进能力检测。试验方法为：将细胞种在2个六孔板中，每孔2ml细胞悬液。3个样品分别标记发酵海带，水，空白(水+0.6％pe9010)，细胞在培养箱培养一天，第二天标记发酵海带孔中加入500μl发酵海带原料，其余孔添加水、空白，培养两天，第四天收集细胞提取rna，提取rna后进行反转录，以与胶原蛋白合成相关的两个关键酶一型前胶原蛋白酶和三型前胶原蛋白酶为研究对象，以gadph为内参，结果如图3/4所示：添加入发酵海带原料的一型及三型胶原蛋白反转录表达量有了明显提高，即显著促进里胶原蛋白合成两个关键酶的表达，因此，本发明所述方法制备获得的海藻发酵液具有潜在的促进胶原蛋白合成，延缓皮肤衰老的功效。

由上述实施例可知，本发明提供的益生菌发酵制备海藻发酵液的方法，制备获得的海藻发酵液中活性成分种类和含量高，所述海藻发酵液中褐藻酸含量为海藻原料干重的1.5％，岩藻多糖硫酸酯含量为海藻原料干重的0.7％，且具有很好的护肤效果，稳定性高，通过成纤维细胞增殖实验、细胞划痕实验和胶原蛋白合成实验显示，所述海藻发酵液具有显著的细胞增殖能力，卓越的细胞修复能力和促进胶原蛋白合成能力；经过防腐挑战实验和原料的加速稳定挑战实验证实所述海藻发酵液具有良好的稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。