本发明涉及医药技术领域，具体涉及利巴韦林单用或联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。
背景技术
近年来随着医疗技术的快速发展，广谱抗生素、糖皮质激素类药物和免疫抑制剂在临床的使用，体内介入性治疗、器官移植等技术的开展，使侵袭性真菌感染的发病率不断上升(kriengkauykiatj,itoji,dadwalss.epidemiologyandtreatmentapproachesinmanagementofinvasivefungalinfections.clinicalepidemiology.2011；3:175-91)。目前，临床常用的抗真菌药物仅有有限的几类，如唑类、多烯类、棘白菌素类和烯丙胺类(cuij,renb,tongy,daih,zhangl.synergisticcombinationsofantifungalsandanti-virulenceagentstofightagainstcandidaalbicans.virulence.2015；6:362-71)。随着这些药物的广泛使用，真菌的耐药现象也越来越普遍，特别是对唑类药物(cowenle,steinbachwj.stress,drugs,andevolution:theroleofcellularsignalinginfungaldrugresistance.eukaryoticcell.2008；7:747-64)。另外，抗真菌药物中存在的严重不良反应或毒性也限制了它们在临床实践中的应用(campoys,adriojl.antifungals.biochemicalpharmacology.2017；133:86-96)。这些问题对侵袭性真菌感染的临床治疗提出了严峻的挑战。
发现新的抗真菌药物或联合用药克服真菌耐药性已成为抗真菌领域的研究热点。开发新的抗真菌药物需要巨额的资金投入，强大的科研队伍及较长的研究周期；而联合用药前期投入少、效果显著，受到国内外的关注。氟康唑(flc)作为安全、有效、价格低廉的唑类抗真菌药物，临床应用非常广泛，但随之而来的耐药株的不断出现使临床治疗变得棘手。因此，寻找非抗真菌药与flc联合应用克服真菌耐药成为研究的热点。
利巴韦林(ribavirin)又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是广谱强效的抗病毒药物，属合成核苷类药，对许多dna和rna病毒有抑制作用，其机理尚不清楚。利巴韦林已被美国食品药物管理局(fda)批准用于配合长效干扰素治疗丙肝、人类呼吸道融合病毒(rsv)，和某些出血热(who)的治疗。目前临床上广泛应用于病毒性疾病的防治，对于其是否具有抗真菌作用，尚无报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种利巴韦林单用或联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品，利巴韦林单用或与抗真菌类药物flc联合应用可以产生协同抗真菌作用。本发明意外研究发现利巴韦林单用具有良好的抗真菌活性；且与flc联合应用能够显著增强flc对耐药白色念珠菌的抗真菌作用，明显降低flc用药时的最低有效浓度，二者表现的协同抗真菌作用。
本发明的目的之一是提供了一种利巴韦林在制备抗真菌产品中的新应用。
本发明的目的之二是提供了一种利巴韦林联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。
本发明的目的之三是提供了一种包含利巴韦林的抗真菌产品。
本发明的目的之四是提供了一种包含利巴韦林和氟康唑的抗真菌产品。
为实现上述发明目的，具体的，本发明公开了下述技术方案：
首先，本发明公开了一种利巴韦林在制备抗真菌产品中的应用。
优选的，所述真菌为白色念珠菌。
优选的，所述产品为药物。
优选的，利巴韦林单用抗白色念珠菌的有效浓度为2～8μg/ml。
其次，本发明公开了一种利巴韦林联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。
优选的，所述产品为药物。
优选的，利巴韦林与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：利巴韦林＝0.25～1:1(μg/ml)。
优选的，联合应用时利巴韦林与氟康唑的最低抑菌浓度为：1μg/ml与0.25～1μg/ml。
再次，本发明公开了一种包含利巴韦林的抗真菌产品。
优选的，所述真菌为白色念珠菌。
优选的，所述产品为药物。
最后，本发明还公开了一种包含利巴韦林和氟康唑的抗真菌产品。
优选的，所述抗真菌产品还包含药学上可接受的辅料。
进一步优选的，所述辅料为药物制剂中的常规辅料，如润滑剂、黏合剂、崩解剂等。
本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：
(1)本发明定量评价了临床常用的抗病毒药物(利巴韦林)单用或与flc的联合抗真菌作用，分析了其对flc的增敏效果，并进行了静态的系统评价。
(2)本发明采用敏感与耐药的白色念珠菌细胞进行研究，利用液体定量法，测定利巴韦林单用或与flc联合用药时最低有效浓度，并以fici法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。
(3)本发明发现了一种非抗真菌药物利巴韦林具有抗真菌活性，且为临床提供了利巴韦林与flc联合用药作为治疗耐药真菌感染的治疗方案。有研究报道，gtp从头生物合成对新生隐球菌毒力因素的表达及发病机制是至关重要的。利巴韦林是一种次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(impdh)抑制剂，其中impdh是嘌呤生物合成的关键酶，它将次黄嘌呤核苷酸(imp)氧化为黄嘌呤核苷酸(xmp)，xmp在gmp合成酶的催化下生成gmp(鸟嘌呤核苷酸)，揭示了利巴韦林的抗真菌作用机制可能与鸟嘌呤核苷酸的从头合成途径有关，为研究抗真菌药物作用的新靶点提供思路。
(4)本发明表明，利巴韦林单用对敏感或耐药的白色念珠菌都具有抗真菌作用，利巴韦林的mic值为2～8μg/ml。利巴韦林与flc联用时，对flc耐药的白色念珠菌(micflc＞512μg/ml)可以产生协同抗真菌作用，1μg/ml的利巴韦林与0.25～1μg/mlflc联合应用均可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，抗真菌效果更强。
(5)本发明表明，破坏鸟嘌呤核苷酸的从头合成途径可能是联合抗真菌作用的机制，为新药的开发及老药新用提供可能的研究方向。
(6)本发明表明，利巴韦林在临床上广泛应用于病毒性疾病的防治，其对flc抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低flc的最低有效浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中常用抗真菌药物具有固有耐药或较快获得耐药性，给临床成功治疗念珠菌感染带来了挑战。因此亟需寻找一种新的抗念珠菌的有效成分。本发明的目的就是为了克服目前真菌感染和三唑类抗真菌药物耐药率增加问题，提供一种利巴韦林单用或联合flc的抗真菌产品及其应用。
鉴于此，本发明的一种典型实施方式中，提供一种利巴韦林在制备抗真菌产品中的应用。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明优选的实施方式中，对于不同敏感性的菌株(包括敏感株和耐药株)，利巴韦林单用抗白色念珠菌的有效浓度为2～8μg/ml。
在本发明的又一种典型的实施方式中，提供了一种利巴韦林联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
flc与利巴韦林联用时，对flc耐药的白色念珠菌菌株(micflc>512μg/ml)可以产生协同抗真菌作用，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低。在本发明优选的实施方式中，利巴韦林与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：利巴韦林＝0.25～1:1(μg/ml)。
在本发明优选的实施方式中，联合应用时利巴韦林与氟康唑的最低抑菌浓度为：1μg/ml与0.25～1μg/ml。
结果表明，大于2～8μg/ml利巴韦林单独应用时具有抗真菌活性；大于1μg/ml利巴韦林与大于0.25～1μg/ml的flc联合应用均有效。
在本发明的又一种典型的实施方式中，还提供了一种包含利巴韦林的抗真菌产品。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明的又一种典型的实施方式中，还提供一种包含利巴韦林和氟康唑的抗真菌产品。
在本发明优选的实施方式中，所述真菌为白色念珠菌。
在本发明优选的实施方式中，所述产品为药物。
在本发明优选的实施方式中，所述抗真菌产品还包含药学上可接受的辅料，所述辅料为药物制剂中的常规辅料，如润滑剂、黏合剂、崩解剂等，优选为淀粉、羧甲基纤维素钠、甘油、甜菜碱等其中的一种或多种。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例利巴韦林单用或联合氟康唑抗真菌作用测定
1.材料
1.1药品与试剂
氟康唑(fluconazole，flc)，山东诚创医药科技发展有限公司；
利巴韦林(ribavirin，rbv)，美仑生物有限公司；
科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
ttc-沙保罗琼脂，杭州天和微生物试剂有限公司；
氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；
磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132；
rpmi1640原料药粉，美国gibco公司；
3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)，济南朋远生物技术有限公司；
甲萘醌(menadione)，美国sigma公司；
xtt(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；
乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；
丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；
xtt(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)-甲萘醌溶液的配制：取xtt粉末0.0500g，溶解于100ml已灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μl的10mmol/l的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为1μmol/l，摇匀，2℃～8℃避光保存。
药物溶液：氟康唑与利巴韦林用无菌蒸馏水溶解，分别配成2560μg/ml的储备液，过滤(0.22μm)分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。
pbs(磷酸盐缓冲液)：用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的pbs磷酸盐缓冲剂(粉剂)，小包装一袋溶于1l蒸馏水中，即配成0.01m，ph7.4的pbs磷酸盐缓冲液，121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却备用。
rpmi(roswellparkmemorialinstitute)1640液体培养液：取rpmi1640(含l-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及mops(3-(n-吗啉基)丙磺酸)粉6.906g，加蒸馏水至200ml，混合均匀后在22℃用1mol/l的naoh溶液调ph为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。
1.2仪器
1.3实验菌株
质控菌株：白念珠菌atcc10231，山东大学药理教研室惠赠；
实验菌株：省立医院、千佛山医院临床分离的白色念珠菌；
菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色所有菌株，再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。
菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到ttc-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24～48h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，pbs配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×106cfu/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
2.内容与方法
2.1利巴韦林单用或与氟康唑联合抗真菌作用测定
2.1.1药物单用抗白色念珠菌菌株的作用研究
根据美国临床与试验标准化协会clsim27-a3方案，测定利巴韦林单用时对氟康唑敏感的白色念珠菌(ca4、ca5、ca8、ca14、ca20和ca129)和对氟康唑耐药的白色念珠菌(ca10、ca16、ca103、ca632、ca20003和ca137)的最小抑菌浓度(minimμminhibitoryconcentrations,mic)。采用二倍稀释法配制利巴韦林为工作浓度范围32-0.5μg/ml的四倍。利用96孔培养板进行测定，每行的第一列作为空白对照，药物浓度为0，最后一列为200μl1640液体培养基对照。用微量移液枪吸取50μl的利巴韦林溶液分别加入到96孔培养板的第2-11列行中，再用微量移液枪吸取50μl的rpmi1640液体培养基加入96孔培养板，重复3次，每个孔中加入100μl事先配制好的终浓度为2.0×103cfu/ml的白色念珠菌混悬液。不足200μl的用rpmi1640液体培养基补足。将96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，用xtt负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
用上述方法测定利巴韦林单用抗白色念珠菌作用。
2.1.2利巴韦林联合氟康唑抗耐药白色念珠菌的静态作用进行研究
根据clsim27-a3方案的棋盘法，以rpmi-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选flc和rbv浓度应用范围，即flc的终浓度为64～0.125μg/ml，rbv为32～0.5μg/ml。按浓度从低到高的顺序吸取flc药液50μl，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取rbv药液50μl，分别加入96孔平板的第g～a行，上述已加药的每个孔再各加菌液100μl使得每个孔加液体积为200μl，其余不足200μl的孔用rpmi-1640培养液补足。第12列的各个孔分别加200μlrpmi-1640培养液，作为空白对照组；h1为生长对照组，只含100μl菌液和100μlrpmi-1640培养液。将96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，用xtt负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。
2.1.3利巴韦林与氟康唑联用抗白色念珠菌生物膜最小抑菌浓度(sessileminimuminhibitoryconcentrations,smic)的测定
根据前期的实验，1.0×103cfu/ml浓度的念珠菌4小时就能形成生物膜，所以本实验选取4h、8h、12h和24h形成的生物膜，使用flc单用、rbv单用flc/rbv联用进行干预，测定smic值以药物对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。用微量移液枪吸取提前配制的浓度为1.0×103cfu/ml的白色念珠菌混悬液100μl加入到96孔培养板的1-11列，第12列为rpmi-1640液体培养空白对照组。把96孔板放入35℃恒温培养分别培养4h，8h，12h和24h，制得4h，8h，12h和24h生物膜。在以上时间点分别用微量移液枪轻轻吸取96孔培养板每孔的菌液，注意防止触碰96孔板底部生物膜，再用200μlpbs磷酸盐缓冲溶液冲洗96孔板三次以去除浮游菌。
将工作浓度为2560μg/ml的flc和rbv溶液分别二倍浓度稀释后加入按照由低到高的浓度顺序加入到96孔板的2-11列及g-a行，每孔100μl。不足200μl的孔用rpmi-1640液体培养基补齐，恒温箱培养24小时后，将预先配置好的xtt溶液加入到96孔培养板中，恒温培养箱中35℃恒温避光培养2h，用酶标仪检测96孔培养板每个孔的od值，对实验结果进行评价。数据取重复3次实验的平均值。以fici法评价利巴韦林与氟康唑的协同抗白色念珠菌生物膜作用。
2.2评价方法与结果判定
2.2.1la理论：loeweadditivity(la)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractionalinhibitoryconcentrationindex,fici)，表述如下：
σfic＝fica+ficb＝ca/mica+cb/micb
mica和micb分别是药物a和b单用时的最小抑菌浓度，ca与cb为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。fici＞4为拮抗作用，fici在0.5与4之间为相加或无关作用，fici≤0.5定义为协同作用。
2.2.2xtt法(二甲氧唑黄比色法)
在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上混匀，吸取100μl某体系内的菌悬液加入到96孔平底培养板内，在以100μl无菌rpmi1640液体培养基为空白对照的情况下，再分别向每个加样后的孔内加入100μl配制好的xtt-甲萘醌溶液，培养板在35℃下避光培养2小时，酶标仪设置单孔空白，在492nm处测各孔的od值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。
3.结果
3.1利巴韦林单用抗真菌作用结果
利巴韦林单用对敏感白色念珠菌、耐药白色念珠菌都有良好的抗菌活性。由测定结果可见，rbv单独应用时对白色念珠菌的最低抑菌浓度为2-8μg/ml(表1)。
表1利巴韦林抗白色念珠菌静态作用研究
注解：ca：白色念珠菌；药物最小抑菌浓度(mic)：与空白对照孔进行对比，可以抑制白色念珠菌80％生长的最低的药物浓度；flc，氟康唑；rbv，利巴韦林。
3.2利巴韦林与氟康唑的联合抗真菌作用结果
三次重复性实验所得结果见表2。由测定结果可见，rbv与flc联合应用时，对耐药白色念珠菌的作用fici均<0.5，呈现协同作用。而对敏感白色念珠菌的fici值则在0.5和2之间，呈现无关作用。
表2以fici法评flc与rbv联合用药抗真菌作用
注解：ca：白色念珠菌；药物最小抑菌浓度(mic)：与空白对照孔进行对比，可以抑制念珠菌80％生长的最低的药物浓度；micflc：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；micrbv：药物单用时利巴韦林的最低抑菌浓度；cflc：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；crbv：药物联用时利巴韦林的最低抑菌浓度。
3.3利巴韦林与氟康唑联用对白色念珠菌生物膜的smic值
三次重复性实验所得结果见表3。由测定结果可见，rbv与flc联合应用时，对白色念珠菌的作用fici均<0.5，呈现协同作用。而对敏感白色念珠菌的fici值则在0.5和2之间，呈现无关作用。
表3smic值
注解：ca：白色念珠菌；时间：指的是白色念珠菌生物膜形成时间；smic的终点判读标准为，与生长对照孔相比，使白色念珠菌生物膜生长80％受到抑制的最低药物浓度；micflc：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；micrbv：药物单用时利巴韦林的最低抑菌浓度；cflc：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；crbv：药物联用时利巴韦林的最低抑菌浓度。
4.结论
面对临床应用中抗真菌药物较少且出现耐药现象的现状，研制新型的抗真菌药物是解决这一问题的途径之一，同时在非抗真菌药物中寻找具有抗真菌活性的药物及通过联合用药的方式来增加真菌对现有抗真菌药物的敏感性也是较好的选择。利巴韦林是一种是广谱抗病毒药物，临床上广泛应用于病毒性疾病的防治，本发明表明利巴韦林单独使用时具有抗真菌活性；且与flc联用抗耐药白色念珠菌也能显著的降低flc的mic值，表现强协同作用。目前已有文献报道gtp的从头合成途径与真菌的毒力有关。作为鸟嘌呤核苷酸从头合成途径中关键酶抑制剂rbv的抗真菌机制及与flc的协同作用机制是否也与影响鸟嘌呤核苷酸从头合成途径有关，有待进一步研究。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。