一种周围神经支架及其制备方法与流程

本发明涉及组织工程和仿生结构技术领域，尤其是一种周围神经支架及其制备方法。

背景技术

周围神经的解剖结构复杂，分为神经外膜区、神经束区和神经束间区等，各个区域内还分布有微血管、结缔组织等功能结构。此外，不同区域的组成成分及空间分布也非常复杂。目前文献报道的神经修复材料(或导管)主要采用单一均质材料制备(如合成材料、天然材料、去细胞基质材料)，依据神经再生的原理，导管的结构与组成也进行了仿生设计(如神经生长因子梯度分布等)，但是这类支架在组成及结构依然较为单一，无法体现天然神经的复杂组成及结构。

生物3d打印技术相比传统加工技术，对于复杂组织结构的制造及不同组分空间分布具有显著优势。3d打印最为重要的是生物墨水。热塑性的可降解聚醚酯材料，虽然打印工艺成熟，打印后稳定，但其与周围神经的力学性质差异较大，且高温的打印条件难以实现对细胞或活性蛋白的负载。而适于细胞生长的生物墨水材料强度普遍较低、稳定性不佳，难以满足直接打印成型及后期使用中稳定性的需求。目前尚没有较为完善的使用生物相容性良好的水凝胶类墨水材料3d打印周围神经支架的工艺。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于镁合金外结构和3d打印技术的周围神经支架，其兼具生物活性功能和结构稳定性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种周围神经支架，包括外套管和设于所述外套管内的填充物，所述填充物是纱网卷曲而成的三维骨架，所述纱网采用生物墨水制成。

其中，(二维)纱网的网格结构为矩形，根据需要还可以调整为棱形、正方形、平行四边形等,通过调节纱网网格的大小和形状，可改变伞为骨架的强度、纵向和横向的通透性(提供引导轴突定向生长物理信号)；填充物的结构仿制了神经再生区域；三维骨架具有多孔结构，有利于具有一定生物功能的凝胶材料或溶液的浸入，从而引入特定生物功能或微观结构。

优选地，所述外套管为镁合金套管。其中，镁合金套管的制备通过五金加工或镁合金丝编织制造，可参考专利cn103598927和cn104107096a，其结构仿制神经外膜。

优选地，所述纱网采用3d打印方法制成。

优选地，所述生物墨水含有丙烯酸双键端基改性peg制备的水凝胶、天然材料以及组织脱细胞水凝胶中的至少一种。

优选地，所述天然材料为丙烯酸或降冰片烯改性的透明质酸、明胶或胶原。

优选地，所述组织为周围神经、脊髓、小肠粘膜下层、脐带、胎盘或羊膜。更优选地，组织源自人或猪。

优选地，所述三维骨架上灌注或浸润有可促进轴突生长或血管化的凝胶或溶液。其中，促进血管化的凝胶或溶液优选含有vegf。

优选地，所述三维骨架上灌注或浸润有含有β-ngf的溶液，以促进轴突生长；或者猪来源的周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶。

作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种周围神经支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供镁合金外套管；

(2)采用具有温度、紫外光双敏感特性的墨水和3d打印方法制备二维纱网，其中，3d打印料筒温度为24～28℃，成型区域温度控制为4～12℃；

(3)保持步骤(2)所得二维纱网在上述低温环境，采用光强为0.1～3mv/cm2的365nmuv辐照8s～2min；然后，通过卷曲或裁剪叠加，制得三维骨架；由此，打印成型的二维纱网结构中聚合物可以化学交联，提高打印出的二维纱网软模型的稳定性；

(4)采用浓度为100pg/ml～10μg/ml的神经生长因子β-ngf的溶液或/和质量浓度为0.1～10％的猪来源周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶浸润或者灌注到步骤(3)所得三维骨架，然后装填到所述镁合金外套管中，制得所述周围神经支架。

其中，墨水含有丙烯酸双键端基改性peg制备的水凝胶、天然材料以及组织脱细胞水凝胶中的至少一种；天然材料优选为丙烯酸或降冰片烯改性的透明质酸、明胶或胶原；步骤(2)中，可以根据需求设计打印二维纱网模型，初始利用墨水的温度敏感性打印成型；步骤(4)中，经过浸润或者灌注，对支架进行生物学的修饰，以利于神经轴突的延伸生长。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)本发明的周围神经支架具有天然周围神经的结构及组成的仿生要素；

(2)镁合金外套管保证生物相容基础上，提供支架充分结构稳定性，填充物在制造过程中可以降低对墨水成型强度要求，扩大了填充物的选材范围，以便墨水可以选择更多的生物功能；

(3)采用3d打印二维纱网，然后叠加或卷曲作为填充物骨架，可以准确调控骨架的结构及通透性；

(4)本发明通过对骨架灌注或浸润特定功能组分，为填充物提供相应的生物学特性，比如促进轴突的生长、促进血管化；

(5)本发明的结构及制备方法简单、易实现。

附图说明

图1为本发明的周围神经支架的制备流程示意图；

其中，1、外套管，2、三维骨架，3、纱网，4、3d打印机。

具体实施方式

本申请的发明人利用3d打印技术制造二维纱网结构，其中，结构单元根据需求可进行设计为不同形状，随后，通过卷曲或叠加实现三维骨架的制备；为维持打印的三维骨架结构内环境的稳定，减少疤痕的产生，提高临床应用的可操作性，将3d打印的骨架结构与镁合金外套管装配成具有管芯结构的支架；为提高支架的生物功能，可进一步通过灌注或浸润具有一定生物功能的凝胶材料或溶液。

本申请的3d打印填充物是能促进轴突生长的软的凝胶墨水材料，用此墨水打印出的0-5cm细长的周围神经支架的自支撑和稳定性，均无法达到试验及临床对结构稳定性的要求，所以，与镁合金外套管匹配，将3d打印填充物置于外套管内，装配成具有管芯结构的周围神经支架。

本申请利用3d打印技术，通过仿生技术制备了兼具生物功能和结构稳定性的周围神经支架；具体地，本发明的周围神经支架具有以下优点：

1、结构仿生，外套管是维持支架形状稳定性和便于临床缝合操作，填充物为神经再生提供微环境；

2、外套管选用镁合金，兼顾生物相容性和结构稳定性；镁合金易于加工，可以精确调节参数，比如镁合金组成、多孔结构的孔直径、致密度等；

3、选取与周围神经力学性质匹配的生物相容性更好的软材料作为3d打印墨水，传统工艺制备的周围神经导管则必须满足一定力学性质以维持稳定性，因此，其力学性质一般要远高于天然的周围神经。此外，本发明中的复合墨水包括利于成型的改性凝胶和周围神经去细胞组织水凝胶，兼顾了3d可打印性质和特异的生物活性；

4、由于组织工程支架要充分考虑营养的输送，本申请中结构单元的设计可以调节材料的通透性(通过网格)，利于物质的输送；此外，三维骨架可以均匀或梯度的负载生物信号分子，实现信号的空间分布，引导轴突定向延伸；

5、可以根据需要调节支架的结构及通透性；

6、本发明的三维骨架中还可加入能促进轴突生长活力或提高血管长入速度的生物活性分子，以提高早期细胞的存活增殖，利于长段神经缺损修复。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中的技术，例如镁合金套管的制备和3d打印技术，均属于本领域公知技术，本领域普通技术人员结合公知技术和本申请中的相关技术方案，不需要付出创造性的工作，即可实现相应的结构或产品。

实施例1

如图1所示，本发明的周围神经支架的一种实施例，包括外套管1和设于外套管1内的填充物，填充物是纱网3卷曲而成的三维骨架2，纱网3采用生物墨水制成，外套管1为镁合金套管，纱网3采用3d打印方法制成。

其中，生物墨水为丙烯酸双键端基改性peg制备的水凝胶；三维骨架上灌注或浸润有可促进轴突生长的溶液，其中含有β-ngf。

上述周围神经支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供镁合金外套管；

(2)采用具有温度、紫外光双敏感特性的墨水(即生物墨水)和3d打印方法制备二维纱网，其中，3d打印料筒温度为24℃，成型区域温度控制为6℃；

(3)保持步骤(2)所得二维纱网在上述低温环境，采用光强为3mv/cm²的365nmuv辐照8s；然后，通过卷曲或裁剪叠加，制得三维骨架；

(4)采用浓度为100pg/ml的神经生长因子β-ngf的溶液浸润或者灌注到步骤(3)所得三维骨架，然后装填到所述镁合金外套管中，制得所述周围神经支架。

之后，将周围神经支架冷冻干燥，通过扫描电子显微镜(sem)观察周围神经支架宏、微观结构；周围神经支架置于37℃的pbs中持续观察其形貌稳定性，结果显示，本实施例的周围神经支架在pbs中可以稳定存在6天以上。

实施例2

本发明的周围神经支架的一种实施例，包括外套管1和设于外套管1内的填充物，填充物是纱网3卷曲而成的三维骨架2，纱网3采用生物墨水制成，外套管1为镁合金套管，纱网采用3d打印方法制成。

其中，生物墨水为丙烯酸或降冰片烯改性的透明质酸；三维骨架上灌注或浸润有猪来源的周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶。

上述周围神经支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供镁合金外套管；

(2)采用具有温度、紫外光双敏感特性的墨水(即生物墨水)和3d打印方法制备二维纱网，其中，3d打印料筒温度为25℃，成型区域温度控制为4℃；

(3)保持步骤(2)所得二维纱网在上述低温环境，采用光强为1.5mv/cm²的365nmuv辐照25s；然后，通过卷曲或裁剪叠加，制得三维骨架；

(4)采用质量浓度为0.1～10％的猪来源周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶浸润或者灌注到步骤(3)所得三维骨架，然后装填到所述镁合金外套管中，制得所述周围神经支架。

之后，将周围神经支架冷冻干燥，通过扫描电子显微镜(sem)观察周围神经支架宏、微观结构；周围神经支架置于37℃的pbs中持续观察其形貌稳定性，结果显示，本实施例的周围神经支架在pbs中可以稳定存在7天以上。

实施例3

本发明的周围神经支架的一种实施例，包括外套管1和设于外套管1内的填充物，填充物是纱网卷曲而成的三维骨架2，纱网3采用生物墨水制成，外套管1为镁合金套管，纱网采用3d打印方法制成。

其中，生物墨水为组织脱细胞水凝胶；组织为猪来源的周围神经、脊髓、小肠粘膜下层、脐带、胎盘或羊膜；三维骨架上灌注或浸润有可促进轴突生长的含有β-ngf的溶液。

上述周围神经支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供镁合金外套管；

(2)采用具有温度、紫外光双敏感特性的墨水(即生物墨水)和3d打印方法制备二维纱网，其中，3d打印料筒温度为27℃，成型区域温度控制为12℃；

(3)保持步骤(2)所得二维纱网在上述低温环境，采用光强为0.7mv/cm²的365nmuv辐照1min；然后，通过卷曲或裁剪叠加，制得三维骨架；

(4)采用浓度为1μg/ml的神经生长因子β-ngf的溶液浸润或者灌注到步骤(3)所得三维骨架，然后装填到所述镁合金外套管中，制得所述周围神经支架。

之后，将周围神经支架冷冻干燥，通过扫描电子显微镜(sem)观察周围神经支架宏、微观结构；周围神经支架置于37℃的pbs中持续观察其形貌稳定性，结果显示，本实施例的周围神经支架在pbs中可以稳定存在12天以上。

实施例4

本发明的周围神经支架的一种实施例，包括外套管1和设于外套管1内的填充物，填充物是纱网3卷曲而成的三维骨架2，纱网3采用生物墨水制成，外套管1为镁合金套管，纱网3采用3d打印方法制成。

其中，生物墨水含有丙烯酸双键端基改性peg制备的水凝胶以及组织脱细胞水凝胶；组织为猪来源的周围神经、脊髓、小肠粘膜下层、脐带、胎盘或羊膜；三维骨架上灌注或浸润有可促进轴突生长的含有β-ngf的溶液，以及猪来源的周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶。

上述周围神经支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)提供镁合金外套管；

(2)采用具有温度、紫外光双敏感特性的墨水(即生物墨水)和3d打印方法制备二维纱网，其中，3d打印料筒温度为28℃，成型区域温度控制为9℃；

(3)保持步骤(2)所得二维纱网在上述低温环境，采用光强为0.1mv/cm²的365nmuv辐照2min；然后，通过卷曲或裁剪叠加，制得三维骨架；

(4)采用浓度为10μg/ml的神经生长因子β-ngf的溶液以及质量浓度为0.1～10％的猪来源周围神经经过脱细胞、粉碎后经胃蛋白酶消化得到的水凝胶浸润或者灌注到步骤(3)所得三维骨架，然后装填到所述镁合金外套管中，制得所述周围神经支架。

之后，将周围神经支架冷冻干燥，通过扫描电子显微镜(sem)观察周围神经支架宏、微观结构；周围神经支架置于37℃的pbs中持续观察其形貌稳定性，结果显示，本实施例的周围神经支架在pbs中可以稳定存在8天以上。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。