西黄丸在制备治疗乳腺癌紫杉醇耐药性药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医学和制药领域，具体涉及西黄丸在制备治疗乳腺癌紫杉醇耐药性药物中的应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全部女性恶性肿瘤的25.2％，目前，化疗仍是乳腺癌的主要治疗手段，紫杉醇类药物则是乳腺癌化疗的最主要的药物之一。然而紫杉醇药物在乳腺癌治疗的有效率为32％～62％，其中紫杉醇化疗耐药是导致患者化疗失败的重要原因。紫杉醇是一种促微管聚合和稳定，抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。紫杉醇化疗耐药机制复杂，研究表明，与紫杉醇耐药相关的机制主要包括：p-糖蛋白等药物泵出蛋白表达增加；促调亡因子基因及蛋白表达减低，或抗凋亡因子基因及蛋白表达升高，使肿瘤多药耐药细胞抵抗和逃逸抗肿瘤药物诱导的凋亡；微管蛋白亚型表达的改变或其与药物结合位点的基因突变，导致微管聚合临界浓度的提高或微管与药物结合受阻；细胞周期改变及肿瘤微环境改变等等。所以，寻找治疗乳腺癌紫杉醇耐药性的药物，包括逆转乳腺癌紫杉醇耐药性或提高乳腺癌细胞对于紫杉醇化疗敏感性的药物，显得尤其重要。中医药作为肿瘤综合治疗的重要组成部分，以其安全、有效、副作用小等特点在预防和阻断肿瘤的发生发展中，有重要的疗效和独特的优势。西黄丸处方来源于部颁中药成方制剂9册71页，标准号为ws3-b-1734-94，其功能主治为清热解毒，和营消肿，用于痈疽疔毒，瘰疬，流注，癌肿等。该西黄丸处方如下：【处方】牛黄15g、麝香15g、乳香(醋制)550g、没药(醋制)550g【制法】以上四味，牛黄、麝香研细，另取黄米350g，蒸熟烘干，与乳香、没药粉碎成细粉，过筛，再与牛黄、麝香粉末配研，过筛，混匀。用水泛丸，置通风干燥处阴干，即得。目前已有研究表明，西黄丸能提高化疗疗效，并对多种恶性肿瘤具有抑制作用。如西黄丸联合chop化疗方案治疗非霍奇金淋巴瘤，对比近期疗效发现观察组的74.19％明显优于对照组的58.06％；西黄丸联合肝动脉化疗栓塞术可有效提高晚期肝癌患者的临床疗效。然而，目前尚未有西黄丸参与人乳腺癌紫杉醇耐药的研究见诸报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了西黄丸在制备治疗乳腺癌紫杉醇耐药性药物中的应用。本发明的一个方面在于提供西黄丸在制备用于逆转乳腺癌紫杉醇耐药性的药物中的应用。在本发明的上述应用的一些实施方案中，优选地，所述西黄丸通过抑制乳腺癌紫杉醇耐药细胞增殖和诱导乳腺癌紫杉醇耐药细胞凋亡使得乳腺癌紫杉醇耐药性逆转。本发明的一个方面在于提供西黄丸在制备用于治疗乳腺癌的紫杉醇的化疗增敏剂中的应用。在本发明的上述应用的一些实施方案中，优选地，所述西黄丸通过抑制对乳腺癌紫杉醇耐药细胞增殖和诱导乳腺癌紫杉醇耐药细胞凋亡而对化疗药物紫杉醇增敏。本发明的一个方面在于提供西黄丸与紫杉醇的联合在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。本发明中，以紫杉醇耐药的人乳腺癌细胞系mda-mb-231p(或者称为人乳腺癌紫杉醇耐药细胞系)作为研究对象，采用cck-8方法检测紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清作用下细胞增殖能力、以及检测紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清联合紫杉醇作用下细胞增殖能力，通过流式细胞术检测不同剂量西黄丸含药血清处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡变化、以及检测不同浓度紫杉醇单独或联合西黄丸含药血清处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡变化，westernblot检测在不同剂量西黄丸含药血清作用下细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的改变。结果显示：西黄丸含药血清能够明显抑制紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的增殖，并且西黄丸含药血清与紫杉醇联用对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的增殖抑制效果更显著。而流式细胞术检测结果表明西黄丸含药血清能够明显促进紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的凋亡，并且西黄丸含药血清与紫杉醇联用对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的凋亡促进效果更显著。westernblot检测结果显示西黄丸含药血清能够上调bax蛋白、下调bcl-2蛋白表达。以上结果说明：西黄丸含药血清能激活或增强紫杉醇对乳腺癌细胞的杀伤作用，从而能够提高乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性和逆转用于治疗乳腺癌的紫杉醇耐药性。由此可见，所述西黄丸可以用在制备用于治疗乳腺癌的紫杉醇的化疗增敏剂中，也可以用在制备用于逆转乳腺癌紫杉醇耐药性的药物中，还可以与紫杉醇联合应用在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中。相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：本发明给出了西黄丸在制备用于治疗乳腺癌的紫杉醇的化疗增敏剂中的应用、在制备用于逆转乳腺癌紫杉醇耐药性的药物中的应用、以及西黄丸与紫杉醇的联合在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。附图说明图1为两种细胞株mda-mb-231和mda-mb-231p在不同紫杉醇浓度作用下(50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l)的细胞活性(细胞活力)比较，对应于图1中，分别记为：50nm-taxol、100nm-taxol、200nm-taxol、300nm-taxol。图2为紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)作用下细胞增殖能力比较，对应于图2中，分别记为：ctrl、mid-xhw、hig-xhw。图3为紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)联合紫杉醇(300nmol/l)作用下细胞增殖能力比较。对应于图3中，分别记为：ctrl-taxol、mid-xhw-taxol、hig-xhw-taxol。图4a、图4b、图4c分别是流式细胞术检测经由不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。其中，各图中横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图4d给出了流式细胞术检测经由不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡率的比较，分别记为ctrl组、mid-xhw组、hig-xhw组。图5a和图5b分别是流式细胞术检测经由含有0nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+0taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+0taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图5c和图5d分别是流式细胞术检测经由含有50nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+50taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+50taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图5e和图5f分别是流式细胞术检测经由含有100nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+100taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+100taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图5g和图5h分别是流式细胞术检测经由含有300nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+300taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+300taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图5i和图5j分别是流式细胞术检测经由含有500nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+500taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+500taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。图5k是对流式细胞术检测经由不同浓度(0nmol/l、50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l)紫杉醇联合高剂量西黄丸含药血清(记为xhw)和加入相同浓度的紫杉醇的空白对照组(记为ctrl)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡率的比较结果，对应于图5k中，分别记为：0nm-taxol、50nm-taxol、100nm-taxol、300nm-taxol、500nm-taxol。图6a为经不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p细胞中细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的免疫印迹(westernblot)检测结果，对应于图6a中，分别记为：ctrl、mid-xhw、hig-xhw。图6b为在图6a中经不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p细胞中bax蛋白相对表达量比较，对应于图6b中，分别记为：ctrl、mid-xhw、hig-xhw。图6c为在图6a中经不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p细胞中bcl-2蛋白相对表达量比较，对应于图6c中，分别记为：ctrl、mid-xhw、hig-xhw。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员应理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径获得。一、材料和设备说明dmem培养基购买自美国hyclone公司；胎牛血清购买自美国gibco公司；抗体购买自美国proteintech公司；bca蛋白浓度测定试剂盒购买自上海碧云天生物技术有限公司；annexinv-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒购买自美国biouniquer公司；cck-8试剂购买自日本同仁公司。西黄丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂。紫杉醇购自北京索莱宝科技有限公司。wistar大鼠购买自上海斯莱克公司，每只体质量200g，均为雌性，动物生产许可证号为生产许可scxk(沪)2017-0005。饲养于spf动物实验室，健康状况良好。流式细胞仪购买自美国bectondickinson公司；蛋白印记检测系统购买自美国bio-rad公司。西黄丸含药血清采取以下步骤制备：西黄丸中剂量组(mid-xhw)和高剂量组(hig-xhw)用药量分别为0.6g/kg和1.2g/kg，西黄丸经双蒸水漂洗干燥、超微粉碎和超声震荡程序制备药物混悬液，混悬液(给药液)的体积为10ml/kg。蒸馏水组为空白对照组(ctrl)，用量为10ml/kg。西黄丸含药血清制备分组如下表1所示。将wistar大鼠(4周龄200g，同为雌性)随机分入高剂量组、中剂量组和空白对照组，每组2只；各组动物分别按预定剂量灌胃，每天早晚各一次，连续7天。最后1次灌胃前禁食12小时，灌胃后1小时，以20％乌拉坦(20g乌拉坦+100ml盐水)，按照10ml/kg的用量行腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，经过56℃，30min灭活后，置-80℃箱保存备用。表1：西黄丸含药血清制备分组组别灌胃频率/周期中剂量组(mid-xhw)西黄丸0.6g/kg(10ml/kg)每天二次，每周14次高剂量组(hig-xhw)西黄丸1.2g/kg(10ml/kg)每天二次，每周14次空白对照组(ctrl)蒸馏水(10ml/kg)每天二次，每周14次二、人乳腺癌耐药细胞系的建立及鉴定2.1紫杉醇耐药的乳腺癌mda-mb-231p细胞株的建立：人乳腺癌细胞系mda-mb-231于2016年1月购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心(地址：北京市东城区东单三条五号)，编号为3111c0001ccc000014。人乳腺癌耐药细胞系mda-mb-231p是采用紫杉醇低浓度加量持续诱导法诱导亲本的人乳腺癌细胞系mda-mb-231而建立的。具体方法如下：人乳腺癌细胞系mda-mb-231在培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)中培养。细胞贴壁生长，达指数生长期时，于培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)中加浓度为20nmol/l的紫杉醇，连续作用24h后撤药，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗一遍，换不含药的新鲜培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)继续培养。敏感细胞逐渐死亡，待存活细胞恢复正常生长，融合达80％，再次加入含20nmol/l的紫杉醇的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)；如此反复诱导，待细胞不再发生死亡，生长速度恢复，再进行下一浓度继续诱导。以20nmol/l、40nmol/l、60nmol/l、80nmol/l浓度梯度逐渐增大紫杉醇诱导浓度到100nmol/l，如此反复诱导、换液、传代，历时10个月，获得稳定耐药的紫杉醇耐药细胞株mda-mb-231p。2.2细胞培养条件：mda-mb-231细胞系在含10％胎牛血清的dmem培养基中培养，mda-mb-231p细胞系在含10％胎牛血清和100nmol/l紫杉醇的dmem培养基中常规培养。于37℃、5％co2恒温培养箱内进行孵育，隔2～3d传代。细胞达到对数生长期进行实验。2.3体外药物敏感实验：使用cck-8方法分析细胞活力取对数生长期的mda-mb-231细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后稀释至2000/孔，接种于96孔板，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养24小时后，分组处理：分别更换含有50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l紫杉醇的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中孵育48小时后，将cck-8工作液(由体积比为1:9的cck-8原液和培养基配置而成，培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基)加入96孔板中，孵育1～2小时后，在波长450nm处读取吸光度(od)。每组至少3个复孔。取对数生长期的mda-mb-231p细胞株消化成单细胞悬液，细胞计数后稀释至2000/孔，接种于96孔板，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养24小时后，分组处理：分别更换含有50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l紫杉醇的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中孵育48小时后，将cck-8工作液(由体积比为1:9的cck-8原液和培养基配置而成，培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基)加入96孔板中，孵育1～2小时后，在波长450nm处读取吸光度(od)。每组至少3个复孔。如图1所示：当细胞在50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l的紫杉醇作用下，培养48小时后，mda-mb-231细胞株和mda-mb-231p细胞株的细胞活性分别为76.4％和105.6％、69.1％和106.4％、66.1％和97.1％、59.7％和83.1％，各组区别具有统计学差异(p<0.001，图1中标记为***)。可见，在不同紫杉醇浓度(50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、300nmol/l)作用下，耐药细胞株mda-mb-231p的细胞活性都显著高于亲本细胞株mda-mb-231，表明诱导的耐药细胞株mda-mb-231p具有紫杉醇耐药性。三、cck-8分析西黄丸作用下紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p细胞增殖3.1不同剂量西黄丸含药血清对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p增殖的影响取对数生长期的mda-mb-231p细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后稀释至2000/孔，接种于96孔板，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养24小时后，分组处理：分别更换含有不同剂量西黄丸含药血清(分别为mid-xhw组、hig-xhw组和ctrl对照组)的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中孵育48小时后，将cck-8工作液(由体积比为1：9的cck-8原液和培养基配置而成，培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基)加入96孔板中，孵育1～2小时后，在波长450nm处读取吸光度(od)。每组至少3个复孔。结果如图2所示：与ctrl对照组相比，mid-xhw组中mda-mb-231p细胞增殖下降7.8％(p<0.05，图中记为#)，hig-xhw组中mda-mb-231p细胞增殖下降14.2％(p<0.01，图中记为##)；其中hig-xhw组比mid-xhw组中mda-mb-231p细胞增殖下降7.1％(p<0.05，图中记为*)。这说明西黄丸含药血清能明显抑制乳腺癌耐药细胞mda-mb-231p增殖。3.2紫杉醇联合不同剂量西黄丸含药血清对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p增殖的影响取对数生长期的mda-mb-231p细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后稀释至2000/孔，接种于96孔板，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱培养24小时后，分组处理：分别更换含有300nmol/l紫杉醇和不同剂量西黄丸血清(分别为mid-xhw+taxol组、hig-xhw+taxol组和ctrl+taxol对照组)的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，培养箱中孵育48小时后，将cck-8工作液(由体积比为1:9的cck-8原液和培养基配置而成，培养基为含10％胎牛血清的dmem培养基)加入96孔板中，孵育1～2小时后，在波长450nm处读取吸光度(od)。每组至少3个复孔。结果如图3所示：与ctrl+taxol对照组相比，mid-xhw+taxol组中mda-mb-231p细胞增殖下降18％(p<0.01)，hig-xhw+taxol组中mda-mb-231p细胞增殖下降28.5％(p<0.01，图3中记为##)；其中hig-xhw+taxol组比mid-xhw+taxol组中mda-mb-231p细胞增殖下降12.8％(p<0.01，图3中记为**)。这说明紫杉醇与西黄丸含药血清联用能显著抑制紫杉醇耐药株mda-mb-231p细胞增殖。将图2和图3的结果进行对比，可以发现，在紫杉醇耐药株mda-mb-231p细胞系增殖的实验中，较之单独使用西黄丸含药血清，紫杉醇与西黄丸含药血清联用有更好的抑制细胞增殖作用，这说明西黄丸含药血清能明显激活或增强对乳腺癌细胞的杀伤作用。四、细胞周期改变及凋亡实验4.1不同剂量西黄丸含药血清对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p凋亡的影响取对数生长期的mda-mb-231p细胞，消化成单细胞悬液，按2×107细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔2ml培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中，培养24h贴壁后进行分组处理，吸弃原培养基，分别更换含有不同剂量西黄丸含药血清(分别为mid-xhw组、hig-xhw组和ctrl对照组)的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，作用48小时后，收集6孔板中细胞，置于离心管中，800rpm离心5min，去上清液，按照annexinv-fitc/pi细胞凋亡试剂盒说明书操作，洗去残留胰酶，每管加入500ul缓冲液，依次加入5ulannexinv-fitc，5ulpi，室温避光孵育10min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。每组至少3个复孔。结果如图4a～图4d所示。图4a、图4b、图4c分别是流式细胞术检测经由不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。其中，各图中横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。结合图4a～图4c的情况，对流式细胞术检测经由不同剂量西黄丸含药血清(空白对照组、中剂量组、高剂量组)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡率进行了比较，比较结果如图4d所示，图中各组分别记为ctrl组、mid-xhw组、hig-xhw组。由图4d可以看出：mid-xhw组、hig-xhw组凋亡率依次是ctrl组的1.08倍、1.42倍(p<0.01，图4d中记为**)；其中hig-xhw组凋亡率比mid-xhw组提高31.5％(p<0.001，图4d中记为***)。这说明西黄丸含药血清能显著促进紫杉醇耐药mda-mb-231p耐药胞系凋亡。4.2西黄丸含药血清联合紫杉醇对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p凋亡的影响取对数生长期的mda-mb-231p细胞，消化成单细胞悬液，按2×107细胞/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔2ml培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养24h贴壁后，吸弃原培养基，进行分组处理：分别更换为空白对照(ctrl)培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)和含有高剂量(hig-xhw)西黄丸含药血清的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)，并分别加入0nmol/l、50nmol/l、100nmol/l、300nmol/l和500nmol/l的紫杉醇，记为hig-xhw+0taxol组、ctrl+0taxol对照组、hig-xhw+50taxol组、ctrl+50taxol对照组、hig-xhw+100taxol组、ctrl+100taxol对照组、hig-xhw+300taxol组、ctrl+300taxol对照组、hig-xhw+500taxol组、ctrl+500taxol对照组。作用48小时后，收集6孔板中细胞，置于离心管中，800rpm离心5min，去上清液，按照annexinv-fitc/pi细胞凋亡试剂盒说明书操作，洗去残留胰酶，每管加入500ul缓冲液，依次加入5ulannexinv-fitc，5ulpi，室温避光孵育10min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。每组至少3个复孔。结果如图5a～图5k所示。图5a和图5b分别是流式细胞术检测经由含有0nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+0taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+0taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。图5c和图5d分别是流式细胞术检测经由含有50nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+50taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+50taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。图5e和图5f分别是流式细胞术检测经由含有100nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+100taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+100taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。图5g和图5h分别是流式细胞术检测经由含有300nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+300taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+300taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。图5i和图5j分别是流式细胞术检测经由含有500nmol/l紫杉醇和高剂量西黄丸含药血清的hig-xhw+500taxol组、含有相同浓度的紫杉醇的ctrl+500taxol对照组处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡图。各图中，横轴表示的是annexinv的染色分布，纵轴显示的是细胞的pi染色分布。结合上述各组图的情况，对流式细胞术检测经由不同浓度紫杉醇联合高剂量西黄丸含药血清(记为xhw)、有相同浓度的紫杉醇的空白对照组(记为ctrl)处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡率进行了比较，比较结果如图5k所示。由图5k可以看出：0nmol/l的紫杉醇联合hig-xhw组凋亡率比空白对照组提高2.5％，50nmol/l的紫杉醇联合hig-xhw组凋亡率比加入相同浓度的紫杉醇的空白对照组提高8.3％，100nmol/l的紫杉醇联合hig-xhw组凋亡率比加入相同浓度的紫杉醇的空白对照组提高10.2％，300nmol/l的紫杉醇联合hig-xhw组凋亡率比加入相同浓度的紫杉醇的空白对照组提高6.5％，500nmol/l的紫杉醇联合hig-xhw组凋亡率比加入相同浓度的紫杉醇的空白对照组提高24.8％。可见，西黄丸含药血清与紫杉醇联用组促进紫杉醇耐药mda-mb-231p细胞系凋亡率皆比紫杉醇单一用药组高，且皆呈极显著差异(p<0.01，图5k中记为**)，这说明西黄丸含药血清能有效增强耐药癌细胞株对紫杉醇化疗药物的敏感性。五、免疫印迹(westernblot)检测蛋白表达以tubulin为内参，使用常规的免疫蛋白印迹技术测定mda-mb-231p细胞中周期及凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达。western-blot检测步骤如下：将mda-mb-231p细胞按照1×106个/孔培养于6孔细胞培养板，每孔2ml培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)培养过夜，待贴壁后，分别更换为加入mid-xhw、hig-xhw西黄丸含药血清的培养基(含10％胎牛血清的dmem培养基)和空白对照的(含10％胎牛血清的dmem培养基)，作用48小时后，每孔加入100ul含1％蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，提取细胞总蛋白，转至于ep管中，12000×rpm离心10min，收集上清液。采用bca法进行蛋白定量，检测蛋白质浓度。加入适量sds上样缓冲液于100℃金属浴解交联，灌制sds-page凝胶。取20ug蛋白样品上样，10％sds－page电泳，将电泳分离的蛋白质电转移至pvdf膜上，放入封闭液中室温封闭1小时，加入一抗(鼠抗)4℃孵育过夜。次日洗膜，加入过氧化物酶标记的二抗(兔抗)室温孵育1小时，洗膜后，用蛋白印迹观察，用图像分析软件测定各带吸光度值作半定量分析。westernblot检测功能蛋白bcl-2和bax的表达结果如图6a所示，具体数值比较请见图6b和图6c。从图6a和图6b可以看出：与空白对照组(ctrl组)相比，加入西黄丸含药血清后，耐药细胞中bax蛋白的表达量在mid-xhw组、hig-xhw组分别增加了40.3％、82.3％(p<0.01，图6b中记为**)，呈浓度依赖性从图6a和图6c可以看出：与空白对照组(ctrl组)相比，加入西黄丸含药血清后，耐药细胞中bcl-2蛋白的表达量在mid-xhw组、hig-xhw组分别减少了36.4％、57.8％(p<0.01，图6c中记为**)，呈浓度依赖性。可见，加入西黄丸含药血清后，mda-mb-231p细胞中bax蛋白表达升高，bcl-2蛋白表达降低。综上，本发明以紫杉醇耐药的人乳腺癌细胞mda-mb-231p作为研究对象，采用cck-8方法检测紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清作用下细胞增殖能力、以及检测紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p在不同剂量西黄丸含药血清联合紫杉醇作用下细胞增殖能力，通过流式细胞术检测不同剂量西黄丸含药血清处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡差异、以及检测不同浓度紫杉醇单独或联合西黄丸含药血清处理的mda-mb-231p耐药细胞凋亡差异，westernblot检测不同剂量西黄丸含药血清作用下mda-mb-231p耐药细胞中蛋白bcl-2和bax表达差异。结果显示：西黄丸含药血清能够明显抑制紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的增殖，并且西黄丸含药血清与紫杉醇联用对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的增殖抑制效果更显著。而流式细胞术检测结果表明西黄丸含药血清能够明显促进紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的凋亡，并且西黄丸含药血清与紫杉醇联用对紫杉醇耐药细胞系mda-mb-231p的凋亡抑制效果更显著。westernblot检测结果显示西黄丸含药血清能够上调bax蛋白、下调bcl-2蛋白表达。以上结果说明：西黄丸含药血清能激活或增强紫杉醇对乳腺癌细胞的杀伤作用，从而能够提高乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性和逆转用于治疗乳腺癌的紫杉醇耐药性。由此可见，所述西黄丸可以用在制备用于治疗乳腺癌的紫杉醇的化疗增敏剂中，也可以用在制备用于逆转乳腺癌紫杉醇耐药性的药物中，还可以与紫杉醇联用于治疗乳腺癌的药物组合物中。由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。当前第1页12