本发明涉及药物领域，特别是涉及5-羟色胺(5-ht)和5-羟基色氨酸(5-htp)的应用领域，更为具体的说是涉及放射性同位素标记的5-ht和5-htp在制备坏死心肌成像显影剂中的应用。
背景技术：
心肌梗塞是全世界发病率和死亡率最高的心脑血管疾病之一。目前临床上对心肌梗塞最有效的治疗方案是在急性心肌梗塞发生后6h之内进行及时的冠脉血管重建。然而，并不是所有的患者都适合血运重建的治疗方案。对于拥有大量存活心肌的患者，冠脉血管重建术可以使病人的死亡率降低80％；但当患者存活心肌较少时，冠脉血管重建术反而会对存活心肌带来严重的再灌注损伤，不仅会加速病人的死亡，而且会造成医学资源的浪费。因此，在临床手术之前对患者进行心肌活性评价，从而指导选择合适的治疗方案，避免盲目血运重建治疗引起的风险是至关重要的。目前，非侵袭性心肌成像是评价心肌活性的重要手段。根据存活心肌对示踪剂的吸收情况对心肌活性进行评估。[18f]fdg的pet成像是心肌活性评价的金标准，一般与心肌灌注显像相结合，能反映心肌代谢水平与灌流情况，可以对存活的心肌进行量化分析。然而，[18f]fdg的摄取受炎症、病人个体差异等多种因素的影响，常常会造成假阳性或假阴性结果干扰诊断。近年来，通过对坏死心肌成像来评价心肌活性是一种新的诊断思路。坏死组织亲和性化合物是一类能够特异性聚集在组织坏死区域的化合物。坏死亲和性化合物偶联成像分子后能准确定位坏死心肌，评估心肌活性。以坏死亲和性化合物为基础的心肌活性评价探针不仅可以避免炎症和个体差异的干扰，也可以减少可挽救心肌由于摄取示踪剂所引起的功能损伤。近年来，一些核素标记的坏死组织亲和性化合物也已经被发展为分子探针“热点”成像坏死心肌，用于评估心肌梗塞面积和指导治疗方案的选择，如[99mtc]pyrophosphate、[111in]antimyosin、[99mtc]glucarate等。然而，或诊断精准度受限，或血池效应高，或成像时间窗窄，这些分子探针并没有得到广泛的临床应用。因此，寻找能够进行坏死心肌快速成像的示踪剂具有重要意义。技术实现要素：我们发现5-ht和5-htp都表现出较好的坏死组织亲和性。相比于双蒽醌类化合物如金丝桃素、原金丝桃素等和单蒽醌类化合物如大黄酸等，5-ht和5-htp具有溶解度佳、安全性高的优点。较好的水溶性可以加快分子探针在坏死心肌的分布和血液循环的清除作用，使探针能够在给药后早期时间点形成较高的信噪比，以加速坏死心肌成像。更重要的是，5-ht和5-htp都具有较高的安全性，有利于分子探针的临床应用转化。基于此，本发明公开了放射性同位素标记的5-ht和5-htp在制备坏死心肌成像显影剂中的应用。所述放射性同位素优选为碘-123、碘-125、碘-124、碘-131、锝-99m、镱-111、镱-113m、氟-18、镓-68、铜-64、铷-86。本发明所述的5-ht和5-htp分别指式i和式ii所示化合物：通过研究发现放射性同位素标记的5-ht和5-htp与坏死组织具有较强的亲和力，特别是对于心肌梗塞造成的坏死心肌组织具有较强的亲和力。基于这一理论，我们做了大量的验证实验，实验结果表明放射性同位素标记的5-ht和5-htp对于坏死心肌具有特异性结合力，可以大量聚集在坏死心肌区域，利用放射性同位素的标记，可以产生射线源，通过与探测器结合使用达到有效检测坏死心肌的目的。20世纪90年代早期，碳-11标记的5-htp被用于脑部5-ht代谢相关活动的pet成像研究。此外，肿瘤细胞的增殖失控伴随着氨基酸代谢上调，以氨基酸为基础的标记pet核素的相关分子探针也已经被用于肿瘤的成像。但目前还没有关于5-ht和5-htp具有靶向坏死性质的报道。本发明独创性地公开了放射性同位素标记的5-ht和5-htp能够用于制备坏死心肌显影剂，这对于5-ht和5-htp的进一步深入研究和应用具有重要意义。附图说明图1为心肌细胞对碘-131标记的5-羟色胺和碘-131标记的5-羟基色氨酸的摄取；图2为碘-131标记的5-羟色胺在心肌梗塞模型大鼠坏死心肌的ttc染色图；图3为碘-131标记的5-羟色胺在心肌梗塞模型大鼠坏死心肌的磷屏放射自显影图；图4为碘-131标记的5-羟基色氨酸在心肌梗塞模型大鼠坏死心肌的ttc染色图；图5为碘-131标记的5-羟基色氨酸在心肌梗塞模型大鼠坏死心肌的磷屏放射自显影图；图6为碘-131标记的5-羟基色氨酸在心肌梗塞模型大鼠的spect/ct显像图。具体实施方式为了更好的阐明本发明，下面我们结合具体的实施例来对本发明进行进一步地说明，但并不代表本发明只限于以下实施例。本发明实施例中所采用的设备和试剂如下：spf级雄性sd大鼠(250～300g)(购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，5-ht(南京巨优器材科学有限公司)，5-htp(南京巨优器材科学有限公司)。iodogen试剂(美国sigma公司)，na131i溶液(北京原子高科股份有限公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(ttc，上海灵锦精细化工有限公司)，其余试剂均为分析纯。超净台(上海esco节能服务公司)，细胞培养箱(美国thermo科技公司)，eppendorf5424离心机(德国eppendorf公司)，rm-905a活度计(中国计量科学研究院研制)，sn-697伽马计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)，cycloneplus磷屏扫描仪(perkinelmer公司)，小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)。以上未提及的材料，除非实施例中特别声明，否则均为普通市售产品。实施例1坏死心肌细胞模型的制备将心肌细胞以1×106个/孔接种到4块6孔细胞培养板中，分别设为空白组和模型组。空白组细胞不做处理，模型组细胞置于60℃烘箱培养1h诱导细胞坏死。实施例2心肌梗塞大鼠模型的制备雄性sd大鼠，腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉实验鼠，剔除左侧胸部毛发，碘伏消毒。将大鼠仰卧位固定在鼠板上，气管插管后与小动物呼吸机连接，呼吸频率65次/min，呼吸比1/1，潮气量4pl/g，使实验鼠的呼吸节奏与呼吸机保持一致。沿大鼠胸肌左侧第三与第四肋间开胸，充分暴露心脏，撕开心包膜。实验组结扎冠状动脉左前降支，进针深度2～3mm，出针宽度2～3mm，以心肌出现苍白色为结扎成功的标志。对照组进行相同的操作但不结扎。快速缝合胸腔，并将胸腔中的空气抽出，使形成胸腔负压，露出结扎活结线头的一端放于体外。1h后抽出活结线头进行心肌再灌注，每只大鼠肌注青霉素预防细菌感染。从建模开始的前三天直至实验结束用0.12％的碘化钾水溶液喂养模型鼠，减少实验过程中甲状腺对碘-131的摄取。模型做好后24小时进行实验。实施例3碘-131标记的5-羟色胺的制备将待标记的5-ht溶解于生理盐水中，振荡摇匀，配置成1mg/ml的溶液。然后向制备好的iodogen含量为100μg的涂管中依次加入100μl5-ht溶液，20μlna131i溶液和10μlpbs溶液(ph＝7.40)，振荡摇匀，37℃恒温水浴锅孵育2h，将反应液取出，终止反应，得到碘-131标记的5-羟色胺([131i]5-ht)。sep-pakc18小柱纯化产物：先用5ml纯化水洗去游离碘-131，然后用1ml甲醇洗下产物。radio-hplc检测放射化学纯度：流动相为甲醇和0.1％冰醋酸水溶液，洗脱体积比为10：90。实施例4心肌细胞对[131i]5-ht的摄取分别向模型组细胞板和空白组细胞板的每个孔中加入实施例3中配制好的[131i]5-ht溶液(37kbq)，37℃恒温水浴锅孵育2h，收集细胞，12,000r/min离心10min去除培养基，然后用pbs洗涤3次以除去未被细胞吸收的药物，离心除去pbs，伽马计数器自动计数每个孔中的放射性吸收值，物理衰变校正和背景辐射扣除后，计算每105个数量细胞所吸收的放射百分比(％uptake/105cells)。[131i]5-ht的体外细胞结合实验数据如图1所示，坏死心肌细胞(nmc)对[131i]5-ht的摄取是正常心肌细胞(vmc)的2.25倍，说明[131i]5-ht在体外可以被坏死心肌细胞选择性摄取并积累。实施例5[131i]5-ht在心肌梗塞模型大鼠的生物分布将实施例3中配制好的[131i]5-ht标记反应液用peg400与丙二醇等体积稀释。取心肌梗塞模型大鼠10只，分为空白组和实验组两组(n＝5)，腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉模型鼠，然后静脉注射[131i]5-ht溶液(放化学纯度大于99％，给药剂量为14.8mbq/kg)。3h后，安乐处死实验鼠并进行取材研究。收集的目标组织和脏器包括：血液、肺、肝脏、脾脏、胃、肾脏、膀胱、正常心肌和坏死心肌。收集后称重，自动伽马计数仪进行计数，物理衰变校正和背景辐射扣除后，计算每克组织或脏器的放射量占总给药量的百分数(％id/g)。[131i]5-ht给药3h后在心肌梗塞模型大鼠的生物分布结果如表1所示。[131i]5-ht的坏死/正常心肌摄取比是3.9，且血液和肺对[131i]5-ht的放射性摄取值显著低于坏死心肌。说明[131i]5-ht可以在给药3h后成像坏死心肌，并且可以获得较好的坏死心肌/血液和坏死心肌/肺的摄取比，有助于得到更高质量的成像图。表1131i标记的5-羟色胺在心肌梗塞模型大鼠的生物分布数据实施例6心肌梗塞模型大鼠的心脏组织ttc染色和磷屏放射自显影将离体心肌组织修剪为2mm厚的切片，并置于2％ttc溶液中，37℃恒温水浴锅孵育15min，然后立刻用数码相机拍照ttc染色结果。存活心肌细胞中的脱氢酶可与ttc试剂反应显示砖红色，而坏死心肌因缺乏脱氢酶而不被染色保持苍白色。然后将心肌组织切为10μm冰冻切片，组织切片在磷屏上曝光约5h，磷屏成像扫描仪获得磷屏放射自显影的图像。对比ttc染色和磷屏放射自显影的实验结果。[131i]5-ht在心肌梗塞模型大鼠上给药3h后代表性坏死心肌的ttc染色如图2所示，可以直接观察到心脏的苍白色坏死心肌区域(图2中显示为白色)和砖红色正常心肌区域(图2中显示为灰色)。图3为对应的磷屏放射自显影图。磷屏放射自显影高信号区域与低信号区域分别与心肌ttc染色的苍白色区域和砖红色区域重合，进一步说明[131i]5-ht可以在聚集在体内坏死心肌。实施例7碘-131标记的5-羟基色氨酸的制备将待标记的5-htp溶解于生理盐水中，振荡摇匀，配置成1mg/ml的溶液。然后向制备好的iodogen含量为100μg的涂管中加入100μl5-htp溶液，20μlna131i溶液和10μlpbs溶液(ph＝7.40)，振荡摇匀，37℃恒温水浴锅孵育2h，将反应液取出，终止反应，得到碘-131标记的5-羟基色氨酸([131i]5-htp)。sep-pakc18小柱纯化产物：先用5ml纯化水洗去游离碘-131，然后用1ml甲醇洗下产物。radio-hplc检测放射化学纯度：流动相为甲醇和0.1％冰醋酸水溶液，洗脱体积比为10∶90。实施例8心肌细胞对[131i]5-htp的摄取分别向模型组细胞板和空白组细胞板的每个孔中加入实施例7中配制好的[131i]5-htp溶液(37kbq)，37℃恒温水浴锅孵育2h，收集细胞，12,000r/min离心10min去除培养基，然后用pbs洗涤3次以除去未被细胞吸收的药物，离心除去pbs，伽马计数器自动计数每个孔中的放射性吸收值，物理衰变校正和背景辐射扣除后，计算每105个数量细胞所吸收的放射百分比(％uptake/105cells)。[131i]5-htp的体外细胞结合实验数据如图1所示，坏死心肌细胞(nmc)对[131i]5-htp的摄取是正常心肌细胞(vmc)的2.43倍，说明[131i]5-htp在体外可以被坏死心肌细胞选择性摄取并积累。实施例9[131i]5-htp在心肌梗塞模型大鼠的生物分布将实施例7中配制好的[131i]5-htp标记反应液用peg400与丙二醇等体积稀释。取心肌梗塞模型大鼠10只，分为空白组和实验组两组(n＝5)，腹腔注射10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉模型鼠，然后静脉注射[131i]5-htp溶液(放化学纯度大于99％，给药剂量为14.8mbq/kg)。3h后，安乐处死实验鼠并进行取材研究。收集的目标组织和脏器包括：血液、肺、肝脏、脾脏、胃、肾脏、膀胱、正常心肌和坏死心肌。收集后称重，自动伽马计数仪进行计数，物理衰变校正和背景辐射扣除后，计算每克组织或脏器的放射量占总给药量的百分数(％id/g)。[131i]5-htp给药3h后在心肌梗塞模型大鼠的生物分布结果如表2所示。[131i]5-htp的坏死/正常心肌摄取比是4.5，且血液和肺对[131i]5-htp的放射性摄取值显著低于坏死心肌。这些结果说明[131i]5-htp可以在给药3h后成像坏死心肌，并且可以获得较好的坏死心肌/血液和坏死心肌/肺的摄取比，有助于得到更高质量的成像图。表2131i标记的5-羟基色氨酸在心肌梗塞模型大鼠的生物分布数据组织或器官％id/g±sd血液0.20±0.02肺0.11±0.07肝0.48±0.07脾0.24±0.05胃0.22±0.02肾2.24±0.28膀胱0.16±0.04正常心肌0.08±0.01坏死心肌0.39±0.07坏死心肌/正常心肌4.5实施例10心肌梗塞模型大鼠的心脏组织ttc染色和磷屏放射自显影将离体心肌组织修剪为2mm厚的切片，并置于2％ttc溶液中，37℃恒温水浴锅孵育15min，然后立刻用数码相机拍照ttc染色结果。存活心肌细胞中的脱氢酶可与ttc试剂反应显示砖红色，而坏死心肌因缺乏脱氢酶而不被染色保持苍白色。然后将心肌组织切为10μm冰冻切片，组织切片在磷屏上曝光约5h，磷屏成像扫描仪获得磷屏放射自显影的图像。对比ttc染色和磷屏放射自显影的实验结果。[131i]5-htp在心肌梗塞模型大鼠上给药3h后代表性坏死心肌的ttc染色如图4所示，可以直接观察到心脏的苍白色坏死心肌区域(图4中显示为白色)和砖红色正常心肌区域(图4中显示为灰色)。图5为对应的磷屏放射自显影图，磷屏放射自显影高信号区域与低信号区域分别与心肌ttc染色的苍白色区域和砖红色区域重合，进一步说明[131i]5-htp可以聚集在体内坏死心肌。实施例11[131i]5-htp在心肌梗塞模型大鼠上的显像结果心肌梗塞模型大鼠静脉注射[131i]5-htp注射液3h后，仰卧位固定，然后分别对心肌梗塞大鼠和正常大鼠进行spect/ct成像。spect扫描参数：矩阵128×128，电压140kev，共采集48帧，每帧采集11s；ct扫描参数：电压100kev，能量100ma，层厚2.5mm。由图6可以看出：给药后3h，心梗模型大鼠心脏部位有明显的放射性浓集，具体参看图6b中箭头所示部位，聚集处显示为白色。空白组假手术大鼠心肌未见明显放射性聚集，可参看图6a对应部分，认为黑灰色。说明[131i]5-htp可以在给药3h后成像坏死心肌。此外，[131i]5-htp血浆清除速度较快，体现良好的体内分布及药代动力学性质，适合心肌活性的快速评价。按照实施例1至10中的方式，分别对锝-99m、镱-111、镱-113m、碘-123、碘-124、碘125、氟-18、镓-68、铜-64以及铷-86标记的5-ht和5-htp进行靶向性聚集实验，发现其具有与实施例中基本相同的靶向作用。因此，同样可以用于制备坏死心肌成像的显影剂。当前第1页12