氧化前胡素的新用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及氧化前胡素的新用途。

背景技术

慢性疼痛是指由于组织损伤、疾病相关或者自发性引起的疼痛持续或反复发作超过12周或者超过组织愈合所需的时间的一种生理反应(rajapaksed,liossic,howardrf.presentationandmanagementofchronicpain[j].archdischild,2014,99(5):474-480.)。据美国医学研究报告，在美国大约30％人群经历着慢性疼痛，这个比例超过了心脏病、癌症、糖尿病患者的总和。在我国，据局部地区流行病学报告，北京市朝阳区慢性疼痛发生率为53.0％。另外，据全国肿瘤登记中心统计显示，2015年中国癌症新增429万例，死亡281万例，在这些癌症患者中高达60％的患者伴有不同程度的慢性疼痛。据此估计，我国患有慢性疼痛的人群数量非常惊人。由于慢性疼痛具有复杂性、长期性和对治疗的抵抗性，其治疗要远比急性疼痛棘手。

目前，临床上用于治疗慢性疼痛的药物主要为抗抑郁药、抗癫痫药、非甾体抗炎药以及阿片类镇痛药等，其中抗抑郁药和抗癫痫药为治疗神经病理性疼痛的一线用药，但对中、重度疼痛患者效果不佳；对于慢性炎症性疼痛主要以非甾体类抗炎药(nsaids)为主，但其药效有限且具有胃肠道损伤、肝肾功能损害等不良反应；阿片类药物是治疗急性锐痛和中、重度疼痛最有效的药物，但对于慢性疼痛患者，需要长期反复用药，而长期使用阿片类镇痛药如吗啡、可待因、芬太尼等会产生耐受性，依赖性甚至成瘾等许多严重的不良反应。因此，寻找新的、有效的、不良反应小且无耐受性及成瘾性的治疗慢性疼痛的药物，具有重要的社会和经济学意义。

氧化前胡素(分子式：c16h14o5，cas号：737-52-0)为线型吠喃香豆素类化合物，是从伞形花科植物法落海(angelicaapaensis)中提取的主要有效成分，其分子结构如式(i)：

现有技术中，关于氧化前胡素的药理活性研究非常少。早在80年代，邓士贤等研究表明氧化前胡素具有镇咳、镇痛及平滑肌解痉等药理作用(邓士贤，莫云强.氧化前胡素的药理学研究[j].中药通报,1985,10(12):36-38.)。作者采用热板法和酸腹腔注射扭体法两种模型来表明氧化前胡素具有减轻健康小鼠经受热伤害、以及化学伤害刺激时的生理反应的镇痛效应。这两种动物模型普遍用于镇痛活性药物的初步筛选，其原理是模拟急性伤害性刺激时的正常生理痛状态，具有明确的疼痛传导机制。而这与慢性疼痛的疼痛机制不同，慢性疼痛的发病机制非常复杂，涉及到神经或组织损伤后炎症介质释放，感觉神经元突触脱髓鞘以及中枢神经可塑性变化等机制。疼痛机制不同，适用的药物并不相同。例如，多巴胺受体拮抗剂氟哌啶醇或者κ阿片受体激动剂u69593对急性伤害性刺激时的正常生理疼痛具有抗疼痛伤害效应，但是在临床中却被证实对慢性疼痛无效(stevensongw,etal.targetingpain-depressedbehaviorsinpreclinicalassaysofpainandanalgesia:drugeffectsonaceticacid-depressedlocomotoractivityinicrmice,lifesciences,2009,85:309-315.negusss,etal.effectsofkappaopioidsinanassayofpain-depressedintracranialself-stimulationinrats.psychopharmacology(berl)2010,210:149–159.)。因此即使某药物具有急性镇痛效应，可以用于急性疼痛治疗，如不能证明其长期用药是否具有耐受性，那么还是不能用于慢性疼痛治疗。反之，对急性伤害性刺激时的正常生理疼痛无效的药物或者无急性镇痛效应的药物，但在慢性给药时，却有可能用于慢性疼痛的治疗，例如，姜黄素单次给药并无镇痛效应，但是长期用药能治疗慢性神经病理疼痛(zhaox,etal.curcuminexertsantinociceptiveeffectsinamousemodelofneuropathicpain:descendingmonoaminesystemandopioidreceptorsaredifferentiallyinvolved,neuropharmacology,2012,62:843-854)。因此，如要确定其是否可用于慢性疼痛的治疗，需要应用特定的慢性病理性疼痛模型进行药物治疗，而且需要长期用药，确定其是否无镇静效应、耐受性及成瘾性。而目前未见任何关于氧化前胡素对于慢性疼痛治疗的报道。

技术实现要素：

为了解决目前慢性疼痛治疗药物的有效性低、不良反应大或有耐受性及成瘾性的问题，本发明提供了一种氧化前胡素作为唯一活性成分在制备慢性疼痛药物方面的新用途。

技术方案

氧化前胡素作为唯一活性成分在制备治疗慢性疼痛药物方面的新用途。氧化前胡素可通过市售方式获得。本发明采用小鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(chronicconstrictioninjury，cci)神经病理性疼痛模型和后足注射完全弗氏佐剂(cfa)致炎症疼痛模型，无论单次给药还是反复多次给药，氧化前胡素显示出优良的镇痛作用，而且长期给药能促进疼痛敏感的恢复，且具有治愈作用，无明显镇静副作用以及耐受性产生。本发明人也采用过与氧化前胡素结构相近的化合物，例如水合氧化前胡素之类，进行同样的实验，实验结果发现其不具有治疗慢性疼痛的效果。

所述慢性疼痛包括神经病理性疼痛和炎症性疼痛。慢性疼痛最典型的两种类型即为神经病理性疼痛与炎症性疼痛。而癌症性痛，在此特指癌症直接引起的疼痛，例如骨肿瘤或骨转移所致的骨痛，肺癌侵及胸膜引起的胸痛，脑肿瘤压迫引起头痛及脑神经痛等。癌性疼痛是一种复杂性慢性疼痛，目前认为其主要机制涉及到神经病理性疼痛与炎症性疼痛。本发明所述神经病理性疼痛是指由于外周或中枢躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛，表现为自发性、痛觉过敏、异常疼痛或感觉异常等临床特征。本发明所述的cci神经痛模型已被国际上普遍接受为代表性的神经病理性疼痛模型。所述的炎症性疼痛是指由于创伤、细菌或病毒性感染以及外科手术引起外周组织损伤导致炎症时所发生的疼痛。cfa致炎症模型被普遍接受为代表性的佐剂关节炎症性疼痛模型，可模拟临床上的自身免疫性炎症疾病如风湿关节炎的疼痛。

本发明所述的药物包括氧化前胡素和药学上可接受的载体。

本发明所述的药物剂型为汤剂、颗粒剂、片剂、丸剂或者液体制剂等，优选为液体制剂(例如：针剂、混悬剂)。

采用液体制剂时，通常以腹腔注射方式使用：造模后急性(单次)给药用量为10～40mg/kg，慢性给药(反复多次)，药用量为每次给药10～40mg/kg，每天给药一次。

本发明的有益效果：本发明公开了氧化前胡素作为唯一活性成分在制备治疗慢性疼痛药物方面的新用途，采用本发明的药物急性以及慢性给药均能够有效减轻慢性神经病理性疼痛以及炎症性疼痛，而且慢性给药能明显促进慢性疼痛的恢复，显示其具有治愈作用，所用剂量均无镇静副作用，且没有耐受性。

附图说明

图1是氧化前胡素(10～80mg/kg)对正常小鼠的镇静效应；

图2是氧化前胡素(10～40mg/kg)急性(单次)给药后对cci神经病理性疼痛的镇痛效果；

图3是氧化前胡素(10～40mg/kg)慢性(反复多次)给药期间对cci神经病理性疼痛的镇痛效果；

图4是氧化前胡素(10～40mg/kg)急性(单次)给药后对cfa炎症性疼痛的镇痛效果；

图5是氧化前胡素(10～40mg/kg)慢性(反复多次)给药期间对cfa炎症性疼痛的镇痛效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例和对本发明的方案作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下实施例所用的氧化前胡素，经hplc检测，纯度>98％，购自上海莫奇生物科技有限公司。

实施例1：氧化前胡素的镇静效应实验

动物分组：雄性icr小鼠50只；分成5组，即正常对照组和氧化前胡素四个剂量组，每组10只。正常对照组给予赋型剂0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，其余组分别腹腔注射氧化前胡素10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg(用0.5％cmc-na配成混悬注射液，给药容积为10ml/kg)后，观察其0.5h内自主活动。

自主活动测试方法参照(zhuq,maoln,liucp,etal.antinociceptiveeffectsofvitexininamousemodelofpostoperativepain,scientificreports,2016,6:19266)，具体为：使用大小鼠自主活动的测试仪(yls-1a,济南延益科技有限公司,中国)，仪器包含一个控制部件和5个独立的方形黑色塑料暗箱(12×15×15cm)，将小鼠放进黑色塑料暗内，光传感器位于塑料暗箱内，用于记录小鼠自主活动次数。记录30min内小鼠自主活动次数。

统计方法采用单因素方差分析，组间比较采用snk统计分析，测试结果见图1。由图1可以看出，氧化前胡素所有剂量组与正常对照组相比均没有明显差异，这说明10-80mg/kg剂量下均没有镇静作用。

实施例2：氧化前胡素急性给药对小鼠cci神经病理性疼痛模型的镇痛效应

(1)cci神经病理性疼痛小鼠模型的制备方法：参照文献(zhaox,etal.curcuminexertsantinociceptiveeffectsinamousemodelofneuropathicpain:descendingmonoaminesystemandopioidreceptorsaredifferentiallyinvolved,neuropharmacology,2012,62:843-854)，小鼠采用异氟烷麻醉后，手术暴露右侧坐骨神经，在该神经主干部位，用4.0铬制羊肠线松结扎3道，每根羊肠线间隔1mm，逐层缝合肌肉及皮肤，术后将大鼠置于安静、温暖、避强光环境喂养。cci手术结束后2小时以及随后每隔24h采用vonfrey单纤维丝法测定小鼠后足机械性缩爪阈值(pwt)。

vonfrey单纤维丝测定方法：使用7种强度的von-frey细丝，按照大约对数型增加弯曲力度(等效于0.07，0.16，0.4，0.6，1.0，1.4，2.0g)，从0.07g开始，垂直刺激小鼠右后肢的爪底(以细丝稍弯曲作为完全受力的标准)，持续时间≤4s，观察小鼠的反应，若出现缩爪、甩爪、舔爪等现象视为阳性反应，否则为阴性。每个强度的纤维细丝均连续测定3次，3次中若有2次或2次以上的反应则视为pwt。若无至少2次的阳性反应出现则用相邻的大一级力度刺激。最大力度为2g，大于此值时仍记为2g。最小的力度记为0.07g，pwt越低说明机械痛敏越严重。测定时，首先小鼠适应实验室环境3天，12小时明暗交替照明，温度24±1℃，湿度50-70％，自由饮食水。每只小鼠单独放在置于金属筛网上的有机玻璃格子内，适应环境至安静，使用vonfrey单纤维丝测定各组小鼠cci手术前的基础机械痛缩爪阈值(pwt)，连续测定3天，让其适应机械刺激的强度。在术前1天测定其pwt值，连续测定3次，取平均值为术前基础值(以bl表示)。

(2)动物分组与实验设计：取icr小鼠40只(由南通大学实验动物中心提供)，标准体重20±2g，将其分成4组，每组10只；赋形剂组，即cci模型组(阴性对照，给予赋形剂0.5％cmc-na)，氧化前胡素10mg/kg组，20mg/kg组，以及40mg/kg组，均采用腹腔注射给药。各组小鼠在造模前测定其术前pwt基线值(bl)，然后全部给予cci手术造模，24h后先测试各组给药前的pwt值(pre)，然后于给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h测定其pwt。测定pwt方法同前述。

(3)实验结果：氧化前胡素(10-40mg/kg)对cci神经病理性疼痛的镇痛效果如图2所示，其中，bl：表示cci术前的正常基线疼痛阈值；pre：表示cci术后给药前的疼痛阈值；凡以黑色填充的数据点均表示，与赋形剂组相比较具有统计学意义(p<0.05)。由图2可以看出，手术前，各组间后爪的机械痛阈值(pwt)均在1.3～1.5g之间，没有显著性差异(p>0.05)。cci术后24h在给药前的pwt值(即图2中的pre所示)均在0.2g左右，没有显著性差异(p>0.05)。赋形剂组(cci模型组)在测试期间的4h内，重复测量的疼痛阈值都稳定保持在cci术后给药前的低水平。统计结果表明氧化前胡素20mg/kg组在2h时有明显镇痛效应，且达最大效应(p<0.05)；氧化前胡素40mg/kg组在1.5-3h时有明显镇痛效应，且在2h时达最大效应(p<0.05)；氧化前胡素10mg/kg组没有明显镇痛效应(p>0.05)。这表明急性给药氧化前胡素治疗可以剂量依赖性地改善本模型中的机械性痛觉过敏。

实施例3：氧化前胡素慢性给药对小鼠cci神经病理性疼痛模型的镇痛效应

动物分组：icr小鼠40只，分成4组；即赋形剂组(给予0.5％的cmc-na)；氧化前胡素10，20，40mg/kg三个剂量组，每组10只(注：采用腹腔注射给药，氧化前胡素由0.5％的cmc-na配制)。各组小鼠全部进行cci手术，手术方法同前述。于术后2h测定疼痛阈值，然后于术后24h给药，每天给药一次，连续给药7天，给药的第一天记为d1，以此类推，即给药的7天记为d1～d7。于每天给药前(记为0h)以及给药后2h测定疼痛阈值，测定疼痛阈值方法同前。

测试结果见图3，图3是氧化前胡素(10～40mg/kg)慢性(反复多次)给药期间对cci神经病理性疼痛的镇痛效果，其中，bl：表示cci术前的正常基线疼痛阈值；凡以黑色填充的数据点均表示，与赋形剂组相比较具有统计学意义(p<0.05)，图中*号表示，与给药前(0h)相比，**p<0.01，具有统计学意义。由图3可以看出，每天给予氧化前胡素能剂量依赖性地改善cci手术导致的机械痛觉过敏，促进痛觉敏感的恢复。用双因素重复测量方差分析，组间比较采用bonferroni分析。与相应模型对照组(赋形剂组)比较，给药后2h时，20mg/kg的氧化前胡素在术后第5天(d5)明显提高小鼠的疼痛阈值，而40mg/kg剂量的氧化前胡素在术后1-7天(d1～d7)都能明显地减少小鼠的机械痛觉过敏(p<0.05)。这表明每天给药氧化前胡素治疗可以剂量依赖性地缓解本模型中的机械性痛觉过敏，而未产生耐受性。而在慢性给药期间，各剂量组每天给药前(0h)的疼痛阈值与赋形剂组相比，发现在给药第4，5，7天(d4，d5，d7)时，氧化前胡素40mg/kg组给药前的pwt就明显高于赋形剂组(p<0.05)，而其它剂量组没有显著性差异。另外与每天给药前(0h)相比，在给药第一天(d1)，氧化前胡素40mg/kg组给药后(2h)的pwt值显著高于给药前(0h)，而给药第2-7天(d2～d7)，各剂量组给药前(0h)与给药后(2h)没有显著性差异。

以上结果说明氧化前胡素慢性给药能够有效促进cci神经病理疼痛敏感的长时辰的恢复，没有耐受性，且每天给药前就发现疼痛大大缓解，说明具有治愈作用，能防止神经病理疼痛发生发展。

实施例4：氧化前胡素急性给药对小鼠cfa炎症性疼痛模型的镇痛效应

(1)cfa致炎症模型的制备方法：

小鼠用异氟烷短暂麻醉后，右足底用酒精消毒片消毒，然后50μlcfa注射入足底皮下。注射结束后2小时以及随后每隔24h测定机械痛阈值(pwt)。机械痛阈值测定方法同前述。

(2)动物分组与实验设计：

icr小鼠40只(由南通大学实验动物中心提供)，分成4组，每组10只；即赋形剂组(阴性对照，给予0.5％cmc-na)，氧化前胡素10，20，40mg/kg三个剂量组；采用腹腔注射给药5ml/kg，氧化前胡素由0.5％cmc-na配制。cfa造模前测定各组小鼠的机械疼痛阈值基线值(bl)，然后全部给予cfa造模，24h后先测试各组pwt值(此时尚未给药，记为pre)，然后腹腔注射给药，并于给药后每间隔30min测试一次pwt，直到痛阈值恢复给予cfa后的水平。测定疼痛阈值方法同前述。

(3)实验结果：

实验结果如图4所示，图4是氧化前胡素(10～40mg/kg)急性(单次)给药后对cfa炎症性疼痛的镇痛效果；bl：表示cfa注射前的正常基线疼痛阈值；pre：表示cfa注射后给药前的疼痛阈值；凡以黑色填充的数据点均表示，与赋形剂组相比较具有统计学意义(p<0.05)。可以看出，cfa注射前(即图4中的bl所示)，各组间后爪的机械痛阈值(pwt)均在1.1～1.4g之间，没有显著性差异(p>0.05)。cci术后24h在给药前的pwt值(即图4中的pre所示)均在0.2g～0.4g之间，没有显著性差异(p>0.05)。氧化前胡素急性给药对cfa致炎症痛模型小鼠虽有镇痛作用，但作用比较弱。赋形剂组(cfa致炎症后24h)在测试期间的4h内，重复测量的疼痛阈值都保持在最低水平(图4中圆圈表示)。统计采用双因素重复测量方差分析，组间比较采用bonferroniposthoc分析，表明氧化前胡素40mg/kg给药组小鼠pwt在给药后随着时间逐渐升高，在2h时达到最大值，随后逐渐降低。实验结果表明，急性给药氧化前胡素40mg/kg对cfa致炎症疼痛的机械性痛觉敏感有一定的改善作用。

实施例5：氧化前胡素慢性给药对小鼠cfa炎症性疼痛模型的镇痛效应

动物分组：icr小鼠40只，分成4组；即赋形剂组(给予0.5％的cmc-na)；氧化前胡素10，20，40mg/kg三个剂量组，每组10只(注：采用腹腔注射给药，氧化前胡素由0.5％的cmc-na配制)。各组小鼠全部进行右后足cfa注射致炎症模型，方法同前述。于术后2h测定疼痛阈值，然后于术后24h给药，每天给药一次，连续给药7天，给药第一天到第7天，记为d1～d7。于每天给药前(记为0h)以及给药后2h测定疼痛阈值，测定疼痛阈值方法同前。

结果见图5，图5是氧化前胡素(10～40mg/kg)慢性(反复多次)给药期间对cfa炎症性疼痛的镇痛效果；bl：表示cfa注射前的正常基线疼痛阈值；凡以黑色填充的数据点均表示，与赋形剂组相比较具有统计学意义(p<0.05)，图中*号表示，与给药前(0h)相比，*p<0.05，**p<0.01，具有统计学意义。由图5可以看出，每天给予氧化前胡素能有效改善cfa导致的机械痛觉过敏，促进痛觉敏感的恢复。用双因素重复测量方差分析，组间比较采用bonferroni分析。与相应模型对照组(赋形剂组)比较，给药后2h时，40mg/kg剂量的氧化前胡素在术后1-7天(d1～d7)都能明显地减少小鼠的机械痛觉过敏(p<0.05)。这表明每天给药氧化前胡素(40mg/kg)治疗可以缓解cfa炎症痛模型的机械性痛觉过敏，而未产生耐受性。而在慢性给药期间，各剂量组每天给药前(0h)的疼痛阈值与赋形剂组相比，发现在给药第4天(d4)时，氧化前胡素40mg/kg组给药前的pwt就明显高于赋形剂组(p<0.05)。另外与每天给药前(0h)相比，在给药第1天与第2天(d1，d2)，氧化前胡素40mg/kg组给药后(2h)的pwt值显著高于给药前(0h)，在给药第1天与第4天(d1，d4)，氧化前胡素20mg/kg组给药后(2h)的pwt值显著高于给药前(0h)；而其它时间，各剂量组给药前(0h)与给药后(2h)均没有显著性差异。

以上结果说明氧化前胡素慢性给药能够有效促进cfa炎症性疼痛敏感的长时辰的恢复，无耐受性，且每天给药前就发现疼痛大大缓解，说明其具有治愈作用，能防止炎症性疼痛的发生发展。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。