龙眼壳萃取物用于制备调控SREBP-1c与ACC及SCD-1蛋白质的组合物的用途的制作方法

本发明是关于龙眼壳萃取物的用途，尤其是关于龙眼壳萃取物用于制备调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的组合物的用途。

背景技术：

台湾人口罹患肝脏疾病的原因有病毒感染、药物滥用、长期酗酒等原因。根据中国台湾行政院卫生署的2015年统计数据显示，慢性肝病及肝硬化等肝脏疾病位居台湾人口十大死因的第十位。

近年来，酒精类饮料于台湾的消费量大幅提升，使酒精性肝脏疾病罹患率也相对提高。长期摄取酒精之后，在人体内引起的生化以及病理学上的伤害非常复杂，而其中受影响最深的组织就是酒精代谢的主要组织-肝脏。长期摄取酒精所造成的肝脏损伤包括：脂肪肝、酒精性肝炎以及肝硬化等，若不及时治疗更会引起肝癌。

脂肪肝是酒精性肝脏疾病最早的病征。研究显示，罹患酒精性脂肪肝的病人形成肝纤维化与肝硬化的机率大为增加，另有研究指出，脂肪肝与肝癌的发生具有相关性。因此，若能改善脂肪肝的情形，就能降低发生肝纤维化与肝硬化的机会。然而，目前并没有有效治疗脂肪肝的方法，临床上大多建议病人少吃油脂含量多的食物，多摄取蔬菜水果，适当运动与保持正常作息，最重要的是禁止酒精的摄取。但是对于罹患脂肪肝的酒精依赖症的病人，短时间内戒酒是十分困难的，若能计划性降低酒精摄取搭配食用可以降低脂肪肝的食品，可达到最大治疗的效果。因为肝脏是人体负责解毒或代谢作用重要器官。而酗酒与肝炎病毒感染是造成肝病的两个主要病因，因此找寻预防或减缓肝损伤的抗氧化食品为营养医学重要议题。

龙眼盛产于7-9月，主要产地在台南，全省年产量约十万至十三万吨间。利用烘焙并将龙眼脱壳后，即为桂圆，可做为食补药材并可长期存放。然而龙眼经加工后，会产生大量的龙眼壳副产物。若能将这些仅能废弃的副产物进一步的有效利用，且对于肝脏疾病有保健的作用，将是人类一大福祉。

技术实现要素：

为解决前述问题，本发明提供一种龙眼壳萃取物用于制备调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的组合物的用途，其中该龙眼壳萃取物是龙眼壳以水、醇、或含水醇类的溶剂所萃取而得。该组合物可进一步包含一医药上可接受的载体。

在本发明的一实施例中，该组合物可为粉末、颗粒、液体、胶状或膏状的剂型。

在本发明的一实施例中，该溶剂所萃取的时间为0.5～3小时，该溶剂的萃取温度为50～100℃，且该龙眼壳萃取物的浓度为4mg/ml以上。

本发明的龙眼壳萃取物可抑制脂肪生成、降低gpt指数、并且保护肝脏。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是以4mg/ml龙眼壳萃取物处理的hepg2细胞，评估龙眼壳萃取物抑制脂肪生成的油红量化结果；

图2是以4mg/ml龙眼壳萃取物处理的hepg2细胞，评估龙眼壳萃取物抑制脂肪生成的油红染色图；

图3是hepg2细胞在经过4mg/ml龙眼壳萃取物进行预处理，再经过h2o2诱导损伤的gpt含量分析结果；

图4是hepg2细胞在经过4mg/ml龙眼壳萃取物进行预处理，再经过h2o2诱导损伤的细胞荧光染色图；

图5是hepg2细胞在经过4mg/ml龙眼壳萃取物进行预处理，再经过h2o2诱导损伤的脂肪生合成相关基因表现量分析结果。

具体实施方式

本发明提供一种龙眼壳萃取物用于制备调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的组合物的用途，本发明的龙眼壳萃取物是以不同温度进行萃取，并以溶剂将龙眼壳进行萃取及离心而得，其可用于抑制脂肪肝形成、预防肝损伤，降低gtp(glutamatepyruvatetransaminase)值并降低肝脏脂肪生合成相关基因。

本发明的龙眼壳萃取物是以一萃取方法而得，该萃取方法包含下列步骤：(a)以一萃取溶剂将龙眼壳进行萃取，其中该萃取是在50～100℃进行，且该萃取溶剂与龙眼壳的体积比为5～20：1～5；(b)所得到的产物进行离心；(c)取离心后的上清液过滤得到一滤液；(d)该滤液于45～70℃进行减压浓缩得到一浓缩产物；及(e)该浓缩产物进行喷雾干燥，其中该萃取溶剂为水、醇类、含水醇类或其组合。

本发明亦提供一种用于调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的组合物，包含一有效量的龙眼壳萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状存在，且其剂型是以食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂的形式提供。

以下将详细说明本发明龙眼壳萃取物的详细萃取方法，与该龙眼壳萃取物用于抑制脂肪肝形成、预防肝损伤、降低gtp值并降低肝脏脂肪生合成相关基因的测试实验，以证实该龙眼壳萃取物的效果。

龙眼壳萃取流程：

1.龙眼壳清洗去除杂物后，晾干，供后续萃取用。

2.进行粉碎程约0.2～0.5cm的片段。

3.取粉碎后的龙眼壳，按照萃取溶剂与粉碎后的龙眼壳的体积比为5～20：1～5混合，于50～100℃分别在溶剂中进行萃取0.5～3小时。

4.冷却至室温。

5.于5000r.p.m.离心10分钟，进行脱渣过滤。

6.经由400目(mesh)滤网过滤。

7.于45～70℃减压浓缩。

脂肪肝细胞试验：

实验材料：

(1).细胞株:hepg2(atcc,hb-8065)

(2).培养液:dulbecco'smodifiedeagle培养液(gibco,cat.12100-038)，含有10％胎牛血清(gibco,cat.10438-026)及1％青霉素/链霉素(gibco,cat.15140-122)

(3).游离脂肪酸(oleicacid；sigma,#o1008)

(4).牛血清白蛋白(biobasicinc.,cat.ad0023)

(5).油红o(sigma,cat.o0625)

(6).异丙醇(echochemical,ph-3101)

(7).10％甲醛(echochemical,cat.tg1794-4-0000-72ni)

(8).磷酸盐缓冲盐水(gibco,cat.14200-075)

实验步骤：

(1).于六孔培养盘中以每孔5×10⁵个细胞的密度植入，并以37℃培养隔夜。

(2).将细胞于含有2％胎牛血清的培养液中，以4mg/ml龙眼壳萃取物处理24小时。

(3).准备含有oa-bsa偶联物、2％胎牛血清及1％青霉素/链霉素的培养液。

(4).去除原有的培养液，并换上第(3)步骤所制备的含有oa-bsa偶联物的培养液。添加适当浓度的龙眼壳萃取物，处理24小时。

(5).去除培养液并以1x磷酸盐缓冲溶液清洗2次。

(6).以10％甲醛固定细胞30分钟。

(7).以1x磷酸盐缓冲溶液清洗2次，并以50％异丙醇润洗15秒。

(8).在60％异丙醇中以油红o染色1小时。

经由显微镜观察并以100％异丙醇将染色溶化以量化。统计是使用excel软件的学生t检验。

实验结果图1，以4mg/ml龙眼壳萃取物处理的hepg2细胞可抑制40.5％的脂肪形成，能有效降低hepg2细胞的脂肪生成量，证实龙眼壳萃取物能有效抑制hepg2细胞形成脂肪。并且，由图2的染色照片显示，龙眼壳萃取物可抑制脂肪来达到预防脂肪肝的效果。

肝损伤细胞gpt(alt)检测：

实验材料：

(1).细胞株：hepg2(atcc,hb-8065)

(2).培养液：dulbecco'smodifiedeagle培养液(gibco,cat.12100-038)，含有10％胎牛血清(gibco,cat.10438-026)及1％青霉素/链霉素(gibco,cat.15140-122)

(3).丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，alt)的elisa套组(uscn.,cat.sea207hu)磷酸盐缓冲溶液(gibco,cat.14200-075)

(4).elisa读取器(biotek)

实验步骤：

(1).以每孔2×10⁴个细胞的密度植入24孔培养盘中，并以37℃培养隔夜。

(2).在以h2o2处理之前，将细胞在培养液中以4mg/ml龙眼壳萃取物进行预处理24小时。

(3).24小时的预处理后，加入h2o2，以500μm的浓度处理6小时。

(4).以碘化丙啶(propidiumiodide)染色溶液(1:250)与annexinv(1:250)的annexinv键结缓冲液中将细胞染色15～30分钟。

(5).以hoechst33342(1:20000)将细胞染色3分钟。

(6).以磷酸盐缓冲液清洗细胞2次。

(7).以荧光显微镜观察。

结果如图3所示，图中显示hepg2细胞在经过h2o2伤害后，gpt指数飙升，然而由4mg/ml龙眼壳萃取物进行预处理的组别，可有效降低gpt指数达90％。

龙眼壳萃取物基因层面探讨

实验材料：

(1).细胞株：hepg2(atcc,hb-8065)

(2).培养液:dulbecco'smodifiedeagle培养液(gibco,cat.12100-038)，含有10％胎牛血清(gibco,cat.10438-026)及1％青霉素/链霉素(gibco,cat.15140-122)

(3).丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，alt)的elisa套组(uscn.,cat.sea207hu)

(4).磷酸盐缓冲溶液(gibco,cat.14200-075)

(5).elisa读取器(biotek)

实验步骤：

(1).于六孔培养盘中以每孔1×10⁵个细胞、1ml培养液植入，并以37℃培养隔夜。

(2).以2mg/ml或4mg/ml的龙眼壳萃取物处理24小时。

(3).收集受刺激的细胞。

(4).利用rna萃取套组收集细胞的rna。

(5).以反转录酶反转录rna，以得到cdna。

(6).以abisteponeplus利用kapasybrfast进行qpcr，将目标基因量化。

(7).基因表达的相对量以2^-δδct方法决定。

以excel软件的学生t检验进行统计分析。(＊:p<0.05；＊＊:p<0.01)

结果如图4，图中显示hepg2细胞经过h2o2伤害后大量凋亡，而加入龙眼壳萃取物能提升细胞的存活率。由此表示龙眼壳萃取物可保护肝脏面受外在刺激而损伤。于龙眼壳萃取物基因层面探讨，当肝脏细胞受到外在刺激会产生srebp-1c转录因子，转录因子就会使细胞生成与合成脂质相关的蛋白质acc和scd-1。如图5显示，龙眼壳萃取物可对于降低srebp-1c达78％、降低acc达82％和scd-1达33％并有显著性的差异，此3个蛋白质都会使肝细胞内脂肪(triglycerides)增加，造成脂肪肝。

综上所述，无论是在细胞实验与基因表现，本案的龙眼壳萃取物均具有调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的功效，能够做为调控srebp-1c与acc以及scd-1蛋白质的食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂等等。

因此，本发明提供的龙眼壳萃取物，因能有效抑制脂肪肝形成、预防肝损伤，降低gtp值并降低肝脏脂肪生合成相关基因以达到保肝的功效。