本发明涉及一种组合物，具体涉及一种促进骨骼生长的组合物及其制备方法，属于中药技术领域。
技术背景
研究表明，人体内大多数骨是通过软骨成骨的途径完成骨的生长发育过程的。早在胚胎时期先形成软骨的雏形，接着在软骨的中间部分开始骨化，随着年龄增长，骺软骨不断增生并骨化使骨增粗，从而身体不断长高。也就是说骨生长是在某种特定的生物与力学环境下，骨的体积和密度发生增长的生理行为，它是构成骨重建的重要功能，体现了骨组织对力学环境的适应能力。然而近年来，越来越多的婴幼儿在骨骼生长发育的重要时期，因为先天性的因素或者后天的不良饮食习惯导致身体未充分吸收到与正常发育密切相关的营养要素(包括蛋白质、脂类、多种维生素和矿物质等)，最终出现骨骼的生长发育迟缓和多种畸形等问题。
中国专利公开号cn107213225a公开“一种用于止痛、促进骨生长的药物组合物及其应用”，该发明公开了一种用于止痛、促进骨生长的药物组合物，所述药物组合物的活性成分由包括以下组分的原料制备而成：麻黄、大黄、寄奴、生川乌、生草乌、松节、木瓜、桂枝、桑枝、牛膝、地枫皮、桃仁、红花、地龙、生马钱子、乳香、没药、寻骨风、透骨草、樟脑、松香、樟丹。该发明提供的是一种外用膏药，主要是利用活血散瘀，消肿止痛，祛风除湿之效来促进骨折愈合。中国专利公开号cn100998736公开了“促进骨生长的中药及其制备方法”，该发明公开了一种促进骨生长的中药，其是由以下原料按照以下重量制成的：血竭20克、雄黄10克、白花蛇10克、马前子10克、熟地40克、山药20克、山茱萸20克、莱服子10克、枸杞20克、菟丝子20克、龟板胶20克、鹿角胶20克、川牛膝20克、穿山甲10克、水蛭10克、制鹿骨10克、何首乌10克、杜仲10克、当归10克、威灵仙10克、黄柏5克、人参5克、羌活5克、白芍5克、白术5克、附子7.5克、川芎20克、红花20克、黄芪10克；该发明也是利用以上原料的祛风湿，止痹痛，益肝肾，补气血的疗效。上述发明中的两种中药组合物主要为补肾祛湿，消肿止痛，活血化瘀的外用膏药和内服药物为主，然而这两种剂型以及用药方法容易出现皮肤过敏，药物吸收不充分，利用度不高，靶向性差等问题。目前公开文献的促进骨骼生长的产品，主要集中在某些中药组合物、某些功效因子等，恰当的组合植物蛋白和中药组合物提取物的产品基本未见。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种组合物，在中西医药理论指导下，通过各原料的的合理组合及配比，起促进骨生长的作用。
本发明另外一个目的是提供该组合物的制备方法。
本发明所述的促进骨生长的组合物，选择藻蓝蛋白、绿萼梅、谷芽和夜交藤为原料；藻蓝蛋白、绿萼梅、谷芽和夜交藤对骨生长因子都具有调控作用，藻蓝蛋白是从藻蓝植物提取出来的一种蓝色蛋白质，其可以提高骨形态发生蛋白(bmp)的含量，而bmp的提高能刺激血管周围未分化的间充质细胞开启分化诱导作用，刺激干性成骨细胞、诱导性成骨母细胞分化成软骨细胞、骨细胞进而形成软骨及骨组织；绿萼梅为蔷薇科植物梅的干燥花蕾，味酸涩，性平，归肝、胃、肺经，可助清阳之气上升，可促进成骨细胞分泌一种多功能的多肽(tgf-β)，这种多肽可刺激骨间膜间充质细胞增殖分化，促进成骨和成软骨细胞的增生，诱导碱性磷酸酶、i型胶原骨桥蛋白、非胶原蛋白质、蛋白聚糖和骨连接素的合成，同时可上调成骨细胞中增殖特异基因prom-1的表达来促进骨生长；谷芽为禾本科植物粟的成熟果实经发芽干燥的炮制加工品，气微，味微甘，归脾、胃经，健脾开胃，下气和中，消食化积，主要用来促进人体对营养物质的吸收，为骨生长提供充足的原材料；夜交藤为蓼科植物何首乌的藤茎或带叶的藤茎，具有养心安神，祛风，通络之功效，用于血虚身痛，肌肤麻木，风湿痹痛，其可以促进胰岛素生长因子igf-1的分泌，研究表明，成骨细胞的表面有与igf-1高亲和力的受体，该生长因子是一种重要的骨形成调控因子，可以直接作用于生长激素受体，诱导成骨细胞的分化和增殖；维生素d主要用于促进钙的吸收，并且可充当油相的溶解介质，安全性更高。
本发明有益效果在于：筛选特定中药材与藻蓝蛋白组合，结合纳米制剂工艺，制备成本发明组合物；该发明的制备方法可更好达到促进骨生长效果，适于骨生长缓慢和骨生长障碍人群使用。
本发明组合物各原料及重量份为：藻蓝蛋白粉20-80份、绿萼梅50-150份、维生素d10-30份、谷芽10-25份、夜交藤30-40份。
优化本发明组合物各原料用量为：藻蓝蛋白粉40份、维生素d20份、绿萼梅100份、谷芽20份、夜交藤35份。
本发明组合物具体制备方法如下：
1)将绿萼梅、谷芽和夜交藤分别充分粉碎后混合，用95％乙醇浸泡24小时后，40-60℃下超声30-40分钟后滤过，滤液加2倍体积的50-60％氢氧化钠溶液，加热回流半小时后置于冰水中冷却，分别用四氯化碳、氯仿、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的任三种有机溶剂依次萃取3次，合并萃取液，挥干溶剂后采用大孔吸附树脂再次分离纯化，最后所得分离液用氮吹仪挥干，备用；
2)将藻蓝蛋白粉溶于3-5％稀醋酸溶液中搅拌30分钟分散均匀，加入10％的壳聚糖-乳酸，2-8℃下低温陈化2小时，作为水相备用；
3)将维生素d及步骤1)制备的提取液同时加入无水乙醇中搅拌均匀，加入蔗糖脂肪酸酯，作为有机相备用；
4)有机相在搅拌的状态下加入水相溶液，低速搅拌1小时；在搅拌过程中，以稀氢氧化钠溶液调节其ph，使ph保持在6.5-7.5之间；搅拌后置于室温反应1小时，过滤除菌，即得。
具体实施和实验例
以下结合实施例和实验例对本发明作进一步阐述，所描述实施例和实验例仅为本发明一部分实施例和实验例，而不局限于以下实施例和实验例。
实施例1
1)将100份绿萼梅，20份谷芽，35份夜交藤分别粉碎后混合，用95％乙醇浸泡过夜后，40℃超声30-40分钟，滤过，滤液加2倍体积的50％氢氧化钠溶液，加热回流半小时后置于冰水中冷却，用四氯化碳、氯仿、乙醚依次萃取3次，合并萃取液，挥干后采用大孔吸附树脂再次进行分离纯化，最后所得分离液用氮吹仪挥干，备用；
2)将40份藻蓝蛋白粉溶于5％的稀醋酸溶液中，搅拌30min使分散均匀，加入10％的壳聚糖-乳酸，4℃低温陈化2h，作为水相备用；
3)将20份维生素d以及步骤1)中提取的中药组合物同时加入到无水乙醇中，搅拌均匀，加入蔗糖脂肪酸酯，作为有机相备用；
4)在搅拌的状态下，逐滴加入水相溶液，低速搅拌1h，在搅拌的过程中，以稀氢氧化钠溶液调节其ph，使ph保持在6.5-7.5之间，搅拌结束后，放置于室温，继续反应1h，过滤除菌，即得。
测得包封率(以藻蓝蛋白计)为68.4％，载药量(以藻蓝蛋白计)为35.14mg/g。
实施例2
1)将150份绿萼梅，25份谷芽，30份夜交藤分别粉碎后混合，用95％乙醇浸泡过夜后，60℃超声30-40分钟，滤过，滤液加2倍体积的60％氢氧化钠溶液，加热回流半小时后置于冰水中冷却，用氯仿、乙醚、石油醚依次萃取3次，合并萃取液，挥干后采用大孔吸附树脂再次进行分离纯化，最后所得分离液用氮吹仪挥干，备用；
2)将20份藻蓝蛋白粉溶于4％的稀醋酸溶液中，搅拌30min使分散均匀，加入10％的壳聚糖-乳酸，4℃低温陈化2h，作为水相备用；
3)将10份维生素d以及步骤1)中提取的中药组合物同时加入到无水乙醇中，搅拌均匀，加入蔗糖脂肪酸酯，作为有机相备用；
4)在搅拌的状态下，逐滴加入水相溶液，低速搅拌1h，在搅拌的过程中，以稀氢氧化钠溶液调节其ph，使ph保持在6.5-7.5之间，搅拌结束后，放置于室温，继续反应1h，过滤除菌，即得。
测得包封率(以藻蓝蛋白计)为72.1％，载药量(以藻蓝蛋白计)为32.26mg/g。
实施例3
1)将150份绿萼梅，25份谷芽，40份夜交藤分别粉碎后混合，用95％乙醇浸泡过夜后，50℃超声30-40分钟，滤过，滤液加2倍体积的55％氢氧化钠溶液，加热回流半小时后置于冰水中冷却，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，挥干后采用大孔吸附树脂再次进行分离纯化，最后所得分离液用氮吹仪挥干，备用；
2)将80份藻蓝蛋白粉溶于3％的稀醋酸溶液中，搅拌30min使分散均匀，加入10％的壳聚糖-乳酸，4℃低温陈化2h，作为水相备用；
3)将30份维生素d以及步骤1)中提取的中药组合物同时加入到无水乙醇中，搅拌均匀，加入蔗糖脂肪酸酯，作为有机相备用；
4)在搅拌的状态下，逐滴加入水相溶液，低速搅拌1h，在搅拌的过程中，以稀氢氧化钠溶液调节其ph，使ph保持在6.5-7.5之间，搅拌结束后，放置于室温，继续反应1h，过滤除菌，即得。
测得包封率(以藻蓝蛋白计)为65.3％，载药量(以藻蓝蛋白计)为31.58mg/g。
实施例4
1)将80份绿萼梅，10份谷芽，30份夜交藤分别粉碎后混合，用95％乙醇浸泡过夜后，55℃超声30-40分钟，滤过，滤液加2倍体积的50％氢氧化钠溶液，加热回流半小时后置于冰水中冷却，用石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，挥干后采用大孔吸附树脂再次进行分离纯化，最后所得分离液用氮吹仪挥干，备用；
2)将60份藻蓝蛋白粉溶于3％的稀醋酸溶液中，搅拌30min使分散均匀，加入10％的壳聚糖-乳酸，4℃低温陈化2h，作为水相备用；
3)将25份维生素d以及步骤1)中提取的中药组合物同时加入到无水乙醇中，搅拌均匀，加入蔗糖脂肪酸酯，作为有机相备用；
4)在搅拌的状态下，逐滴加入水相溶液，低速搅拌1h，在搅拌的过程中，以稀氢氧化钠溶液调节其ph，使ph保持在6.5-7.5之间，搅拌结束后，放置于室温，继续反应1h，过滤除菌，即得。
测得包封率(以藻蓝蛋白计)为62.6％，载药量(以藻蓝蛋白计)为38.47mg/g。
实验例1本发明组合物对骨生长的促进作用
1.实验细胞株
mc3t3-e1成骨细胞株。
2.实验方法
阳性对照药：戊酸雌二醇(浓度为1*10-5mol/l)
mc3t3-e1成骨细胞增殖率测定：对数生长期的mc3t3-e1成骨细胞，用胰蛋白酶消化后调整细胞浓度至2×105cell/ml，接种于96孔板中(每孔200μl)，37℃，5％二氧化碳浓度条件下培养24h后给药。实验组分别加入低(1*10-4mol/l)、中(2*10-4mol/l)、高(4*10-4mol/l)三种浓度的本发明组合物样品液20μl，阳性对照组加入等体积的的戊酸雌二醇溶液，空白对照组加入等体积的dmem无血清培养基，每组分别设6个复孔。分别给受试物后同等培养条件下继续培养24h，取出96孔板，每孔加5mg/ml的mtt液20μl，37℃孵化4h，取出，吸弃培养液，每孔各加入dmso150μl，低速震荡10min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔的吸光度值，并计算细胞增殖率。
细胞增殖率(％)＝(od样品-od空白)/od空白×100％
mc3t3-e1成骨细胞alp活力测定：将对数生长期的mc3t3-e1成骨细胞接种于24孔板中，每孔1ml，培养24h后给药。实验组分别加入低(1*10-4mol/l)、中(2*10-4mol/l)、高(4*10-4mol/l)三种浓度的本发明组合物样品液100μl，阳性对照组加入等体积的戊酸雌二醇溶液，空白对照组加入等体积的dmem无血清培养基，每组设6个复孔。给受试物后继续培养96h，吸弃培养液，每孔加入细胞裂解液100μl，4℃裂解25min后冰上超声5min，收集裂解液，离心10min(4℃、12000r/min)，收集上清液，按碱性磷酸酶(alp)试剂盒及bca测定法分别测定alp含量和总蛋白含量，计算细胞内alp活力。
alp活力(u/gprot)＝[(od测定-od空白)/(od标准-od空白)]*标准品浓度(0.1mg/ml)÷待测样本蛋白浓度(gprot/ml)。
3.实验结果
mc3t3-e1成骨细胞增殖率结果表明，与空白组对比本发明组合物在浓度为1*10-5mol/l条件下即有促进骨生长作用，高浓度下作用与激素药物戊酸雌二醇接近。结果见下表1.
表1各组吸光度值及对mc3t3-e1成骨细胞增殖率影响(
注：采用t检验法进行与空白组显著性差异比较，*p＜0.05表示有显著性差异，**p＜0.01表示有极显著性差异
mc3t3-e1成骨细胞alp活力测定结果表明：与空白组相比本发明组合物在浓度为2*10-5mol/l条件下对成骨细胞alp活力有影响，在浓度4*10-5mol/l条件下对成骨细胞alp活力具有非常显著性影响。
各组成骨细胞alp活力实验结果如下表所示(
注：与空白组比较，*p＜0.05代表有显著性差异，**p＜0.01代表有非常显著性差异。