含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物、医药组合物及其于促进伤口愈合及降低疤痕的用途的制作方法

本发明是有关于一种局部用组合物，特别是有关于一种含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物及医药组合物及其于促进伤口愈合及降低疤痕的用途。

背景技术：

伤口愈合(woundhealing)过程一般分为四个阶段。第一阶段为止血期(hemostasis)，即伤口发生至止血为止。第二阶段为发炎期(inflammatoryphase)，人体的免疫系为统抵抗外来细菌及微生物入侵，伤口出现轻微红、肿、热、痛之发炎反应。

第三阶段为增生期(proliferativephase)，伤口部位会逐渐长出新的微血管，带来更多的胶原组织填补伤口。这个阶段也包含肉芽组织(granulationtissue)增生，在过程中，纤维母细胞(fibroblast)会经活化而表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin；α-sma)，转化成肌成纤维细胞(myofibroblast)。肌成纤维细胞具有重组细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)物质及收缩伤口的能力，使伤口逐渐收口。

第四阶段为成熟期或重塑期(remodelingphase)，伤口收口愈合后，多余的微血管退化与萎缩。胶原组织拉长并且排列整齐，疤痕变得平且淡。

在伤口愈合过程中，纤维母细胞转化成肌成纤维细胞为伤口愈合重要步骤；然而，在重塑期中，肌成纤维细胞若过度活化，就会产生不当的结痂(scar)及纤维化(fibrosis)，而导致疤痕。因此，要避免伤口愈合不全或留下疤痕，关键在于控制肌成纤维细胞，使其不过度活化。目前已知tgf-β为活化肌成纤维细胞重要因子，如何适当地调控tgf-β的表现，是促进伤口愈合及降低疤痕的重点之一。

益生菌发展已久，且益生菌安全又无副作用，过去研究发现，以植物乳杆菌(l.plantarum)活菌局部擦拭烧伤老鼠伤口，可增加局部免疫细胞的噬菌能力及降低病原菌的数量，增加组织修复能力。进一步研究亦发现，植物乳杆菌活菌局部给予可降低临床烧伤病人的伤口菌数并加速伤口愈合。筛选产生高量的exopolysaccharide(eps)的植物乳杆菌活菌(l.plantarum)或短乳酸杆菌(l.brevis)活菌培养液可促进大鼠伤口愈合。不过，未经实证研究，无法预期不同种类的益生菌是否具有促进伤口愈合的能力。

有鉴于此，实有必要提供一种含有益生菌的局部用组合物，以提升益生菌在伤口敷料的应用。

技术实现要素：

因此，本发明的一个目的是提供一种促进伤口愈合及降低疤痕的局部用组合物，其包含乳杆菌死菌培养物作为有效成分。

本发明的另一目的是提供一种促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物，其包含乳杆菌死菌培养物作为有效成分。

本发明的又一目的是提供一种乳杆菌死菌培养物用于制造促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物的用途，其中此乳杆菌死菌培养物为源自于副干酪乳杆菌(l.paracasei)gmnl-653，且乳杆菌死菌培养物包含死菌纯培养液及/或干燥菌粉，以促进伤口愈合及降低疤痕。

根据本发明的上述目的，提出一种促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物，其包含乳杆菌死菌培养物作为有效成分。在此实施例中，乳杆菌死菌培养物可例如为源自于副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)gmnl-653，该副干酪乳杆菌gmnl-653于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccm2016226。

在本发明的一实施例中，上述乳杆菌死菌培养物包含死菌纯培养液及/或干燥菌粉。

根据本发明的另一目的，提供一种促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物，其包含以乳杆菌死菌培养物作为有效成分。

在本发明的一实施例中，上述乳杆菌死菌培养物的有效剂量可例如为1×10⁹菌体细胞/ml至1×10¹⁰菌体细胞/ml。

在本发明的一实施例中，上述医药组合物的剂型可例如为凝胶、凝胶状敷料、海绵状敷料、膜状敷料或上述任意组合。

根据本发明的又一目的，提出一种乳杆菌死菌培养物用于制造促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物的用途，其中此乳杆菌死菌培养物可例如为源自于副干酪乳杆菌(l.paracasei)gmnl-653(保藏编号：cctccm2016226)，且乳杆菌死菌培养物包含死菌纯培养液及/或干燥菌粉。

应用本发明的促进伤口愈合及降低疤痕的局部用组合物及医药组合物，其包含乳杆菌死菌培养物作为有效成分，可显著促进伤口愈合及降低疤痕，进而用于制造促进伤口愈合及降低疤痕之医药组合物的用途。

【附图说明】

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：

图1a显示根据本发明一实施例的人类皮肤hs68纤维母细胞株与不同种类乳酸菌死菌菌株共培养后的第1型胶原蛋白的相对表达量的柱形图。

图1b显示根据本发明一实施例的人类皮肤hs68纤维母细胞株与不同浓度乳酸菌死菌菌株共培养后的第1型基质金属蛋白酶的相对表达量的柱形图。

图2a至图2b显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口外观(图2a)及伤口大小曲线图(图2b)。

图3a及图3b显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口组织切片染色结果(图3a)及伤口距离变化的柱形图(图3b)。

图4a及图4b显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口免疫组织染色结果。

图5显示根据本发明一实施例的副干酪乳杆菌死菌培养物于体外抑制tgf-β诱导的α-sma表达路径的westernblotting分析结果。

【具体实施方式】

本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％～11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦a≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的b，或0.2％以下的b)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦b≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。

本发明提供一种促进伤口愈合及降低疤痕的局部用组合物，其包含乳杆菌死菌培养物作为有效成分，可显著促进伤口愈合及降低疤痕。

在一实施例中，上述乳杆菌死菌培养物为源自于副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)gmnl-653。具体而言，上述副干酪乳杆菌gmnl-653指于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccm2016226之菌株。

在上述实施例中，上述乳杆菌死菌培养物包含死菌纯培养液及/或干燥菌粉。在一些例子中，上述死菌纯培养液可例如利用习知无菌处理法所制得者，其中无菌处理法可例如化学灭菌法(例如臭氧灭菌法、氧化乙烯气体灭菌法)或物理灭菌法(例如紫外线照射法、放射线照射法、高温高压灭菌法等)。在其他例子中，上述干燥菌粉可利用习知脱水方法制得者，例如将纯培养液经高温干燥法处理，或者将无菌处理后的死菌纯培养液经冷冻真空干燥法、喷雾干燥法处理而制得。

在应用时，上述乳杆菌死菌培养物可用于制备促进伤口愈合及降低疤痕的局部用组合物及医药组合物。在应用于局部用组合物的实施例中，局部用组合物可例如为皮肤外用组合物。在应用于医药组合物之实施例中，上述医药组合物可包含有效剂量为1×10⁹菌体细胞/ml至1×10¹⁰菌体细胞/ml的乳杆菌死菌培养物。在一例示中，上述医药组合物可经由例如涂抹、包覆等方式局部施用于受试部位，因此适用的剂型可例如为凝胶、凝胶状敷料、海绵状敷料、膜状敷料或上述任意组合。

在上述实施例中，上述剂型使用的载剂成分并无特别限制，以不干扰乳杆菌死菌培养物的功效为妥。在一些例子中，前述载剂的具体例子可包含但不限于水、聚合物、保湿剂等。前述聚合物的具体例子可包含但不限于黄原胶(xanthangum)。前述保湿剂的具体例子可包含但不限于木糖醇(xylitol)、海藻糖(trehalose)、甘油(glycerol)等。

上述包含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物经动物实验证实，具有促进伤口愈合及降低疤痕的功效。在一例示中，前述伤口愈合的功效可包含但不限于在伤口愈合前期促进第1型基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-1；mmp-1)的表达量，在伤口愈合中后期增加伤口处之第1型胶原蛋白的表达量，以加速伤口愈合。

在其他例示中，前述降低疤痕的功效可包含但不限于抑制tgf-β诱导的磷酸化的smad2及α-sma过量表达，藉此调节或避免疤痕的产生。

本发明上述包含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物为死菌剂型，应用时没有生菌数及变质的问题产生，且在安定性上有较好的控管，可应用于制造促进伤口愈合及降低疤痕之医药组合物的用途。

以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰。

实施例一、筛选促进人类皮肤纤维细胞分泌胶原蛋白分泌及mmp-1表达的乳酸菌

1.制备乳酸菌死菌培养物

本实施例选用嗜酸性乳酸杆菌(lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、酦酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)等多株从财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)购入之菌种，每种各选用数个菌株，共33株菌株与目标菌株进行测试。测试菌种的菌体经培养隔夜后，以无菌水清洗二次，调整细胞密度为1×10¹⁰菌体细胞/ml，再以高温(121℃)、高压灭菌处理15分钟后，制成死菌菌液备用。

前述目标菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)gmnl-653，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏日期为2016年4月25日，保藏编号为cctccm2016226。副干酪乳杆菌gmnl-653另保藏于台湾新竹食品路331号财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)，保藏日期为2016年2月26日，保藏编号为bcrc910721。

2.建立细胞试验模型

将人类皮肤hs68纤维母细胞株(cctcc保藏编号：gdc403；atcc保藏编号：crl-1635；bcrc保藏编号：bcrc60038)接种至6孔细胞盘(2×10⁵细胞/孔)。经培养隔夜后，以pbs清洗二次，更换成不含血清的细胞培养液继续培养，实验组细胞加入不同菌株死菌菌液(浓度为1×10⁹菌体细胞/ml，相当于2×10⁹菌体细胞/孔)，而对照组细胞则加入与菌液等体积的无菌水，分别处理24小时。之后，收集上清液，并将上清液以稀释缓冲液稀释10倍后，利用市售第1型胶原蛋白原c-胜肽的酶联免疫分析(enzymeimmunoassay；eia)试剂盒(例如procollagentypeic-peptideeiakit；takara,#mk101)进行分析，其结果如图1a所示。

请参阅图1a，其为根据本发明一实施例的人类皮肤hs68纤维母细胞株与不同种类乳酸菌死菌菌株共培养后的第1型胶原蛋白(typeicollagen)的相对表达量的柱形图。此实施例利用34株菌株进行人类皮肤纤维细胞体外模式后，其中13株菌株具有促进胶原蛋白分泌的能力，分别是1株嗜酸性乳酸杆菌、1株干酪乳杆菌、5株酦酵乳杆菌、3株副干酪乳杆菌(包括目标菌株gmnl-653及其他2株)、2株植物乳杆菌以及1株鼠李糖乳杆菌，如图1a所示。

由图1a的结果显示，副干酪乳杆菌菌株gmnl-653刺激细胞内胶原蛋白分泌的能力优于其他12株乳杆菌，因此后续以菌株gmnl-653进行评估。

3.分析人类皮肤纤维细胞内mmp-1(matrixmetalloproteinase-1)基因含量步骤

此实施例利用hs68细胞株与不同浓度的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653进行共培养。首先，将隔夜培养的副干酪乳杆菌gmnl-653菌体，以无菌水清洗二次后，调整细胞密度为1×10¹⁰菌体细胞/ml，再以高温(121℃)、高压灭菌15分钟后，制成死菌培养物备用。

hs68细胞株的细胞培养方法则与实施例一第2点相同。不同之处在于，hs68细胞株以菌株gmnl-653死菌菌液处理24小时后，收集细胞萃取物，提取总rna后，进行反转录反应合成cdna。关于提取总rna及反转录反应等方法诚属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

然后，利用如序列编号(seqidno):1及2所示的引物对进行基质金属蛋白酶-1(mmp-1)基因的定量pcr分析，并利用β-肌动蛋白(β-actin)的表达量(利用如seqidno:3及4所示的引物对)作为内生对照组，其结果如图1b所示。

请参阅图1b，其为根据本发明一实施例的人类皮肤hs68纤维母细胞株与不同浓度乳酸菌死菌菌株共培养后的第1型基质金属蛋白酶(mmp-1)的相对表达量的柱形图，其中图号＊代表经student’st-test统计分析后，相较于对照组，该实验组具有统计上显著差异性(p<0.05)。

由图1b的结果显示，副干酪乳杆菌菌株gmnl-653死菌培养物可促进mmp-1基因的表达量，且具有统计上显著差异性。

实施例二、评估副干酪乳杆菌菌株gmnl-653的促进伤口愈合的功效

1.制备含死菌培养物的凝胶

副干酪乳杆菌菌株gmnl-653经隔夜培养后，以无菌水清洗两次后，调成2×10¹⁰菌体细胞/ml，并以高温(121℃)、高压灭菌15分钟后，制成死菌培养物备用。接着，将副干酪乳杆菌菌株gmnl-653死菌培养物调入凝胶中(含2％的黄原胶、6％的木糖醇、4％的海藻糖、10％的甘油，其余为无菌超纯水)，并将死菌含量调整为1×10¹⁰菌体细胞/克凝胶。对照组凝胶则为不含死菌培养物的同配方凝胶。

2.建立动物试验模型

将8周龄大balb/c小鼠(购自乐斯科生技公司)进行麻醉及反射试验，确认达到深度麻醉后开始进行以下实验。首先，在距离小鼠尾巴根部约1cm处，制作0.2*1cm左右的伤口，并涂抹0.01克含死菌培养物的凝胶(死菌含量为1×10¹⁰菌体细胞/克凝胶)或对照组凝胶，因此每只小鼠伤口涂抹剂量相当于约1×10⁸菌体细胞。涂抹后静置15-20分钟(此时小鼠呈现麻醉状态)，使凝胶完全吸收。如此持续涂抹5天后，每隔2～7日观察伤口复原情形，拍照并利用imagej影像软件计算伤口面积大小，以进行统计分析，其结果如图2a及图2b所示。

请参阅图2a及图2b，其显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口外观(图2a)及伤口大小曲线图(图2b)。图2b为以自身第一天伤口大小作为100％评估各组伤口大小，其中图号＊代表经student’st-test统计分析后，相较于对照组，该实验组具有统计上显著差异性(p<0.05)(n＝4)。

由图2a及图2b的结果显示，涂抹副干酪乳杆菌gmnl-653凝胶的小鼠尾巴伤口愈合速度较对照组为快，从第3天就可看出差异，而第9天至观察终点第20日又更为明显。

另外，比较第20天的尾巴伤口，相较于对照组的伤口愈合后留下较明显的疤痕，涂抹副干酪乳杆菌gmnl-653凝胶的小鼠尾巴伤口较平缓也较无明显的疤痕产生，如图2a所示，显示副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物确实能降低疤痕。

3.组织染色分析

采集以上小鼠尾巴5天及9天伤口区域的组织检体，经固定、包埋、切片后，进行苏木紫-伊红(hematoxylin&eosin；he)染色，其结果如图3a所示。关于固定、包埋、切片及he染色等方法诚属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

另外，利用imagej软件量测小鼠尾巴伤口距离的变化，其中伤口距离定义为距离伤口两侧最近的完整毛囊之间的距离，其结果如图3b所示。

请参阅图3a及图3b，其显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口组织切片染色结果(图3a)及伤口距离(单位：像素)变化的柱形图(图3b)。图3b的图号＊代表经student’st-test统计分析后，相较于对照组，该实验组具有统计上显著差异性(p<0.05)。

由图3a及图3b的结果显示，涂抹含死菌培养物的凝胶的小鼠尾巴伤口，无论在第5天或至第9天伤口距离都是明显缩小的，显示副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物确实能加速伤口的愈合。

实施例三、评估副干酪乳杆菌菌株gmnl-653促进伤口愈合的机制

1.免疫组织化学染色(i)

此实施例采集实施例二的小鼠尾巴第5天及第9天伤口区域的组织检体，经固定、包埋、切片后，进行伤口愈合相关因子的免疫组织染色。伤口愈合相关因子包括mmp-1、胶原蛋白(collagen)之马森三色(masson’strichrome)组织染色、第1型胶原蛋白(col1a1)、α-sma及he染色，其结果如图4a及图4b所示。相关切片及所有组织学相关染色均委托百欧生命科技股份有限公司(台中，台湾)进行，并经专业人员判定实验数据。用于检测mmp-1、col1a1及α-sma的抗体数据则如表1所示。

表1

请参阅图4a及图4b，其显示根据本发明一实施例的小鼠伤口经涂抹含死菌培养物的凝胶后的伤口免疫组织染色结果。

由图4a及图4b的结果显示，涂抹含死菌培养物的凝胶的小鼠尾巴伤口，在较早期(第5天)可观察到其组织的基质金属蛋白酶-1(mmp-1)较对照组为多，表示副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物可促进mmp-1的表达，而加速整个伤口愈合的进行。在伤口愈合较后期(第9天)，副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物可促进胶原蛋白纤维及第1型胶原蛋白的大量表达，加速完成伤口愈合。

α-sma为肌成纤维细胞活化指标，过去研究指出，纤维母细胞与肌成纤维细胞的转化达到平衡，可避免过度疤痕的形成。然而，肌成纤维细胞若过度活化，会造成疤痕大量产生。由图4b的结果显示，在伤口愈合较后期(第9天)，涂抹含副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物的凝胶的实验组，伤口的α-sma表达较少，表示副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物可有效防止肌成纤维细胞过度活化，进而避免疤痕大量产生。

2.免疫组织化学染色(ii)

此实施例利用细胞模型，分析副干酪乳杆菌菌株gmnl-653死菌培养物促进伤口愈合的机制。tgf-β为活化肌成纤维细胞的重要因子，然而在伤口重塑期，过量的tgf-β会造成肌成纤维细胞的过度活化，而导致疤痕产生。

副干酪乳杆菌菌株gmnl-653经隔夜培养后，以无菌水清洗两次后，调整细胞密度为1×10¹⁰菌体细胞/ml，再以高温(121℃)、高压灭菌15分钟后，制成死菌培养物备用。hs68细胞株的细胞培养方法则与实施例一第2点相同。不同之处在于更换成不含血清的细胞培养液继续培养时，实验组细胞加入tgf-β(20ng/ml)及死菌菌液(1×10⁹菌体细胞/孔或2×10⁹菌体细胞/孔)处理24小时。之后，收集细胞萃取物，提取蛋白质并以westernblotting法分析α-sma、原型的smad2/3、磷酸化-smad2(phospho-smad2；p-smad2)及持家基因(gapdh；作为内生对照组)的蛋白质含量，其结果如图5所示。

关于提取蛋白质及westernblotting法诚属本发明所属技术领域具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。用于检测α-sma、原型的smad2/3、p-smad2/3及gapdh的抗体数据如表2所示。

表2

请参阅图5，其显示根据本发明一实施例的副干酪乳杆菌死菌培养物于体外抑制tgf-β诱导的α-sma表达路径的westernblotting分析结果。

由图5的结果显示，副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物主要可经由抑制tgf-β诱导的活化型smad2(即p-smad2)，进而影响其下游α-sma的表达。换言之，副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物可通过抑制tgf-β所诱导的α-sma表达路径，达到抑制疤痕产生之目的。

补充说明的是，本发明以副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物作为有效成分，确实可加速伤口愈合，降低病原菌感染人体的机会，又可降低疤痕，其机制可能经由在伤口愈合前期促进mmp-1之产生，在伤口愈合中后期，促进胶原蛋白分泌，以加速伤口愈合。再者，体外试验亦证实副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物可抑制tgf-β诱导的p-smad2及α-sma过量表达，藉此降低疤痕的产生。另外，副干酪乳杆菌gmnl-653为死菌剂型，其添加于后续相关商品上较无生菌数及变质的问题衍生，在安定性上能有较好之控管，应用面较广，有潜力应用于制造促进伤口愈合及降低疤痕的医药组合物的用途。

综言之，本发明虽以特定菌株、特定的剂型、特定的对象、特定的投予方式、或特定的评估方式作为例示，说明本发明含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物、医药组合物及其于促进伤口愈合及降低疤痕的用途，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明之精神和范围内，本发明亦可使用其他菌株、其他的剂型、其他的对象、其他的投予方式或其他的评估方式进行。

由上述实施例可知，本发明的促进伤口愈合及降低疤痕之局部用组合物及医药组合物的优点，在于其有效成分副干酪乳杆菌gmnl-653死菌培养物，具有优异的安定性、安全且不具有无生菌数及变质之疑虑，可显著促进伤口愈合及降低疤痕之能力，可应用于制造促进伤口愈合及降低疤痕之医药组合物的用途。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之权利要求所界定者为准。

【生物材料保藏】

副干酪乳杆菌gmnl-653保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏日期为2016年4月25日，保藏编号为cctccm2016226。副干酪乳杆菌gmnl-653另保藏于台湾新竹食品路331号财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bcrc)，保藏日期为2016年2月26日，保藏编号为bcrc910721。

【序列表】

<110>景岳生物科技(中国)有限公司

<120>含乳杆菌死菌培养物的局部用组合物、医药组合物及其于促进伤口愈合及降低疤痕的用途

<130>无

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mmp-1基因上游引物

<400>1

tgctcatgcttttcaaccag20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mmp-1基因下游引物

<400>2

ggtacatcaaagccccgata20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>β-actin基因上游引物

<400>3

tccctggagaagagctacga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>β-actin基因下游引物

<400>4

agcactgtgttggcgtacag20