熊去氧胆酸在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，特别是涉及熊去氧胆酸在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是肿瘤相关性死亡率位列第二的肿瘤，中国肝癌患者约占全球肝癌患者的一半。尽管目前临床采用手术切除、经肝动脉化疗栓塞术等多种进行治疗，其疗效并未令人满意。肝癌血供丰富，血管生成能力较强是其发生迁移侵袭并导致肿瘤复发转移的重要因素，血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常，且血管基质不完善，这种微血管容易发生渗漏，因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。越来越多的研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。

现有防控技术的缺点：临床抗血管生成药物种类稀缺：血管生成是肝癌复发转移的重要条件，但现临床批准用于晚期肝癌的一线药物只有索拉菲尼，可通过抑制vegf和血小板衍生生长因子受体而阻断肿瘤新生血管的形成。药物副作用大，患者受益有限：索拉菲尼仅可使晚期肝癌患者延长生存期约3个月，由于其存在皮疹及胃肠道反应等副作用，因此很多患者无法坚持治疗，且其耐药性也是该药的局限性之一。临床预防肝癌转移复发效果较差：现临床尚无关于预防肝癌复发转移的统一药物，临床缺乏预防肝癌复发转移手段。

因此，如何克服上述技术问题成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于：为了解决上述现有临床抗肝癌种类稀缺的问题，本发明公开了一种熊去氧胆酸在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。

本发明的发明目的通过以下技术方案来实现：

熊去氧胆酸在制备预防或治疗肝癌的药物中的应用。

作为优选，熊去氧胆酸是作为唯一的活性成分应用于预防或治疗肝癌的药物的制备中。

作为优选，熊去氧胆酸是作为唯一的活性成分应用于抑制人脐静脉血管内皮细胞ea,hy926细胞的药物的制备中。

作为优选，熊去氧胆酸是作为唯一的活性成分应用于抑制肝癌细胞il-8及vegf的分泌的药物的制备中。

作为优选，熊去氧胆酸是作为唯一的活性成分应用于抑制il-8诱导血管的生成的药物的制备中。

与现有技术相比，本发明通过实验证明：udca能有效抑制肝癌细胞smmc-7721中il-8和vegf的表达，进而抑制血管生成，其具体机制可能通过抑制p-iκb的表达，进而促进p65入核表达，同时通过调控p-erk信号通路，最终抑制了il-8的分泌而发挥抑制血管生成的作用，有利于udca这一临床常用药新功效的发掘，有利于肝癌患者复发转移的防治。

附图说明

图1为熊去氧胆酸的结构式图；

图2为熊去氧胆酸对smmc7721细胞增殖能力影响示意图；

图3为熊去氧胆酸对ea.hy926细胞增殖能力影响示意图；

图4为熊去氧胆酸抑制缺氧条件下smmc7721细胞il-8分泌示意图；

图5为熊去氧胆酸抑制缺氧条件下smmc7721细胞vegf分泌示意图；

图6为熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成示意图；

图7为熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成结节数目示意图；

图8为熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成血管段长度示意图；

图9为熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成网眼面积示意图；

图10为体内熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成示意图；

图11为体内熊去氧胆酸抑制il-8条件下血红蛋白浓度示意图；

图12为体内熊去氧胆酸抑制il-8条件下血管生成免疫组化示意图；

图13为westernblot法检测熊去氧胆酸作用相关信号通路示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。

熊去氧胆酸(ursodeoxycholicacid)购自美国sigma公司，纯度≥99％，分子式为c24h40o4，分子质量为392.57g/mol，其结构式如图1所示。

本品溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)中，配成180mmol/l母液，在实验过程中按照计划稀释至相应浓度。

实施例一

将肝癌细胞接种于孔板，孔板置于培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组加入含有不同熊去氧胆酸浓度剂量的dmem完全培养基100μl，同时设置不加细胞的调零组，继续置于37℃细胞培养箱中培养，加药时间点计为0h、24h及48h后，吸去培养基，各孔加入100μl含0.5％mtt的培养基，置于培养箱孵育4h后加入三联溶液，低速震荡10min后置于培养箱中过夜，最后在多功能酶标仪测570nm处吸光值计算细胞增殖率；

将人脐静脉血管内皮细胞ea,hy926细胞接种于孔板，孔板置于培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组加入含有不同熊去氧胆酸浓度剂量的dmem完全培养基100μl，同时设置不加细胞的调零组，继续置于37℃细胞培养箱中培养，加药时间点计为0h、24h及48h后，吸去培养基，各孔加入100μl含0.5％mtt的培养基，置于培养箱孵育4h后加入三联溶液，低速震荡10min后置于培养箱中过夜，最后在多功能酶标仪测570nm处吸光值计算细胞增殖率；

用cocl2模拟缺氧环境，将肝癌细胞接种于孔板，孔板置于培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组加入含有不同熊去氧胆酸浓度剂量的dmem完全培养基100μl，继续置于37℃细胞培养箱中培养24h，最后使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定肝癌细胞il-8及vegf的分泌；

取孔板置于冰上，将高浓度基质胶与dmem培养基按照1:1比例混匀后，均匀铺于孔板中，每孔60μl，然后将去其放置37℃培养箱中30min，将ea,hy926血管内皮细胞消化并离心，弃去原培养基后加入不含血清的dmem培养基，将细胞定量至4×10⁵个/ml，同时将100μg/ml的il-8及不同浓度的熊去氧胆酸加入到不同组别中，摇晃均匀后置于培养箱中培养16h，最后置于显微镜中观察。

将所有实验的东西放于-20℃预冷，将ea,hy926血管内皮细胞消化并离心，弃去原培养基后加入不含血清的dmem培养基，将细胞定量至2×10⁷个/ml，同时将100μg/ml的il-8及50μm的熊去氧胆酸加入il-8组及il-8+药物组，设置空白组，形成细胞混悬液，将细胞混悬液与不含酚红的基质胶混合，注射于4周龄的雄性裸鼠左下肢皮下，待生长10天后取出基质胶，用血红蛋白检测试剂盒检测基质胶。

将ea,hy926血管内皮细胞铺到孔板中，并加入药物刺激相应的时间点后提取蛋白，将细胞裂解液加入处理好的细胞，离心后取上清，通过bca法检测蛋白含量，然后通过sds-page跑电泳，将跑完整的胶板取下后采用三明治装置进行蛋白质转膜，将蛋白质转移至pvdf膜，然后依次通过5％脱脂牛奶溶液进行封闭，然后加入不同的一抗放在4℃冰箱摇晃过夜，然后采用tbst洗膜，加二抗室温下摇晃2h，tbst洗膜，加显色剂进行显色及拍照；

实施例二

实验一

取生长状态良好、对数生长期smmc-7721肝癌细胞(购自美国actt菌种保藏中心)按照5×10³个/孔的浓度接种96孔板，置于37℃、含5％co2的培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组分别加入含25、50、100、200、400μm剂量的熊去氧胆酸(每个剂量设3个复孔)的dmem完全培养基，同时设置不加细胞的调零组，继续置于37℃细胞培养箱中培养，加药时间点计为0h、24h及48h后，吸去培养基，各孔加入100μl含0.5％mtt的培养基，置于培养箱孵育4h后加入三联溶液，低速震荡10min后置于培养箱中过夜，最后在多功能酶标仪测570nm处吸光值(a值)计算细胞增殖率。

细胞增殖率＝(实验组a值-调零组a值)/(对照组a值-调零组a值)×100％

结果如图2所示，与对照组相比，不同浓度的熊去氧胆酸对smmc-7721细胞的增殖有抑制作用，且当熊去氧胆酸浓度大于200μm时其抑制作用具有显著意义。

实验二

取生长状态良好、对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞ea,hy926(购自中国科学院细胞库)按照5×10³个/孔的浓度接种96孔板，置于37℃、含5％co2的培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组分别加入含25、50、100、200、400μm剂量的熊去氧胆酸(每个剂量设3个复孔)的dmem完全培养基，同时设置不加细胞的调零组，继续置于37℃细胞培养箱中培养，加药时间点计为0h、24h及48h后，吸去培养基，各孔加入100μl含0.5％mtt的培养基，置于培养箱孵育4h后加入三联溶液，低速震荡10min后置于培养箱中过夜，最后在多功能酶标仪测570nm处吸光值(a值)计算细胞增殖率。

细胞增殖率＝(实验组a值-调零组a值)/(对照组a值-调零组a值)×100％

结果如图3所示，与对照组相比，不同浓度的熊去氧胆酸对ea,hy926细胞的增殖有抑制作用，且当熊去氧胆酸浓度大于100μm时其抑制作用具有显著意义。

实验三

由于缺氧是血管生成的促进因素，因此，在本实验中我们通过cocl2模拟缺氧环境，同时通过上述条件选取对肝癌和血管内皮细胞增殖能力均无明显作用的熊去氧胆酸浓度(25和50μm)，作用于smmc-7721肝癌细胞，通过elisa实验检测熊去氧胆酸对smmc-7721肝癌细胞分泌il-8及vegf的影响。

取生长状态良好、对数生长期的smmc-7721细胞按照5×10³个/孔的浓度接种96孔板，置于37℃、含5％co2的培养箱中，待细胞贴壁后，吸掉原培养液，对照组加入dmem完全培养基100μl，实验组分别加入含25、50、100、200、400μm剂量的熊去氧胆酸(每个剂量设3个复孔)的dmem完全培养基，继续置于37℃细胞培养箱中培养24h。

接着按照elisa试剂盒说明书进行操作：

加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，其中空白孔不加样品及酶标试剂。在酶标包被板上加样50μl标准品，待测样品孔中分别加40μl样品稀释液、10μl待测样品，混合均匀，37℃温育30min；洗涤：仔细拿掉封板膜，弃液，甩干，各孔加洗涤液，洗涤3次，每次3min，甩干；加酶标抗体：在各反应孔中，加入50μl酶标试剂，其中空白孔除外，封板膜封板，37℃，温育30min；再洗涤3次；加底物显色：在各孔中，首先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，混匀，37℃，显色15min，注意避光；终止反应：在各个反应孔中加入终止液50μl；在elisa检测仪上，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。

elisa结果显示cocl2能有效促进il-8及vegf的分泌，证明缺氧模型成功，而duca能有效抑制肝癌细胞il-8(如图4所示)及vegf(如图5所示)的分泌。

实验四

由于vegf是血管内皮生长因子，根据文献报道及上述实验结果，我们推测il-8是肝癌细胞分泌的与血管生成密切相关的细胞因子，因此，我们通过il-8细胞因子及熊去氧胆酸检测其对血管生成的影响。

取96孔板置于冰上，将高浓度matrigel基质胶与dmem培养基按照1:1比例混匀后，均匀铺于96孔板中，每孔60μl，然后将去其放置37℃培养箱中30min，待基质胶凝固后进行后续实验。将生长状态良好的ea,hy926血管内皮细胞消化并离心，弃去原培养基后加入不含血清的dmem培养基，将细胞定量至4×10⁵个/ml,同时将100μg/ml的il-8及不同浓度的熊去氧胆酸加入到不同组别中(分别为25,50,100,200μm)，轻轻摇晃均匀后置于培养箱中培养16h，然后再正置显微镜中观察并拍照。

结果发现，相对于对照组，il-8能有效诱导血管生成，而不同浓度的熊去氧胆酸均能有效抑制血管的生成。图6代表镜下血管生成图像，图7代表血管生成结节数目，图8代表血管生成长度，图9表血管生成面积。

实验五

将所有实验的东西提前放于-20℃预冷，将生长状态良好的ea,hy926血管内皮细胞消化并离心，弃去原培养基后加入不含血清的dmem培养基，将细胞定量至2×10⁷个/ml,同时将100μg/ml的il-8及50μm的熊去氧胆酸加入到不同组别中，实验共分为空白组、il-8组及il-8+熊去氧胆酸组，将上述细胞混悬液与不含酚红的基质胶混合，注射于4周龄的雄性裸鼠左下肢皮下，待生长10天后取出。实验结果如图10所示，il-8能有效诱导血管的生成，而熊去氧胆酸能有效拮抗该效应。

取出来的基质胶块采用血红蛋白检测试剂盒(购自贝博公司)进行检测，检测结果如图11所示。

同时通过委托上海塞维斯生物科技有限公司进行基质胶块的免疫组化检测，主要检测血管生成的标志物cd31，vegf，vwf，结果显示il-8能有效诱导血管的生成，而熊去氧胆酸能有效拮抗该效应(如图12所示)。

实验六

采用蛋白质印迹法(westernblot)，检测il-8及熊去氧胆酸对不同信号通路的影响，将生长状态良好的ea,hy926血管内皮细胞铺到6孔板中，并加入药物刺激相应的时间点后提取蛋白，将细胞裂解液加入处理好的细胞，离心后取上清，通过bca法检测蛋白含量，然后通过sds-page跑电泳，将跑完整的胶板取下后采用三明治装置进行蛋白质转膜，将蛋白质转移至pvdf膜，然后依次通过5％脱脂牛奶溶液进行封闭，后加入不同一抗放在4℃冰箱摇晃过夜，然后采用tbst洗膜，加二抗室温下摇晃2h，tbst洗膜，加显色剂进行显色及拍照。

结果如图13所示，熊去氧胆酸抑制血管生成的具体机制可能通过抑制p-iκb的表达，进而促进p65入核表达，同时通过调控p-erk信号通路，最终抑制了il-8的分泌而发挥抑制血管生成的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。