一种茶树油立方液晶制剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药制剂领域，具体涉及一种茶树油立方液晶制剂及其制备方法与应用。

背景技术

茶树油，又名互叶白千层油，是以蒸馏方式从港木桃金娘科互叶白千层叶中提取的纯天然植物精油，为无色至淡黄色液体，可溶于非极性溶剂，微溶于水，相对密度为0.885-0.906g/cm³。茶树油具有抑菌、抗炎、驱虫，杀螨等功能，无污染、无腐蚀性、渗透性强，其中1,8-桉叶素为其主要抗菌成分。茶树油作为天然抗菌剂在临床上主要用于痤疮、足甲癣、唇疱疹、头皮相关疾病的治疗。临床使用的茶树油剂型包括乳剂、霜剂、凝胶、乳膏等。

立方液晶是溶致液晶中的一种，是两亲性分子在水或其他极性溶剂中形成的液晶。在溶液中，当两亲性表面活性剂分子浓度很低时以单体形式存在；当浓度增大至临界胶束浓度(criticalmicelleconcentration，cmc)时，形成亲水基向外、疏水基向内的表面活性剂分子缔合体，即胶束；随浓度进一步增大，胶束缔合形成反相双连续立方液晶，由两亲性分子在三维空间无限循环堆叠形成晶胞，晶胞继续堆叠形成曲面度极小的紧密结构，即类“蜂窝状”结构。立方液晶能包纳不同极性药物，水溶性药物可位于立方液晶水道中、脂溶性药物可位于立方液晶双分子层膜中、两亲性药物位于界面处。常用于构建立方液晶的两亲性分子包括单油酸甘油酯(glycerylmonooleate,gmo)和植烷三醇(phytantriol，pt)。

经皮给药系统(transdermaldrugdeliverysystem,tdds)是指通过皮肤表面局部给药，达到局部或全身治疗的给药途径。近几年有关溶致液晶促进药物透皮吸收的研究越来越多。立方液晶能穿透角质层，促进药物透皮吸收。其经皮给药的优势在于可持续释放药物、具有生物黏附性、可包裹不同极性的药物并免受物理或酶降解。

痤疮(acne)是由毛囊及皮脂腺阻塞引发的一种慢性炎症性皮肤病，是皮肤科常见病种之一。痤疮的形成与激素水平异常、细菌过度生长并感染、遗传、情绪因素、饮食生活习惯、化妆品使用不当等因素有关。目前临床治疗以抑菌为主，如维a酸乳膏、夫西地酸乳膏等。常用中药制剂如冰黄肤乐软膏等。

现有治疗痤疮的茶树油制剂包括洁面皂、洗面奶、浴盐、纳米乳，其主要用于清洗面部等痤疮部位，局部滞留时间短，不利于进入毛囊内持续发挥抑菌作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种茶树油立方液晶制剂及其制备方法与应用。

本发明所提供的茶树油立方液晶制剂，含有茶树油、单油酸甘油酯(gmo)、乙醇和水，其中，以质量份数计，茶树油1-20份，单油酸甘油酯(gmo)20-60份、乙醇1-10份，水10-68份，具体可为茶树油1份，单油酸甘油酯(gmo)27份，乙醇3份，水12份。

上述茶树油立方液晶制剂按照包括下述步骤的方法制备得到：

1)将单油酸甘油酯加热融化后向其中加入乙醇，混匀，得到油相；

2)将茶树油加至所述油相中，混匀，然后向所得体系中加入去离子水，混匀，即得。

上述方法步骤2)中，所述去离子水在加入体系前，先预热至40℃-48℃。

所述去离子水以涡旋搅拌下滴加的方式加入体系中。

上述茶树油立方液晶制剂在制备下述产品中的应用也属于本发明的保护范围：

1)抑制表皮葡萄球菌的产品；

2)治疗痤疮的产品。

本发明通过体外抑菌试验考察了茶树油对痤疮常见致病菌-表皮葡萄球菌的抑制作用。采用伪三元相图优化茶树油立方液晶处方，扫描电镜(scanningelectronmicroscope，sem)、x-小角衍射、偏光显微镜表征立方液晶性质。建立兔耳痤疮模型，验证茶树油立方液晶治疗痤疮的效果。

本发明将茶树油制成立方液晶剂型，其生物黏附性较强，可直接涂抹于患处，制备、使用方便，适用于经皮给药。茶树油立方液晶黏稠度大，洁面后使用，可长时间于痤疮局部停留，有利于持续释放茶树油发挥抑菌作用。此外，立方液晶具有水、油性互通的通道，其油性通道有利于包载茶树油之类的挥发油，水性通道有利于与皮肤紧密接触，贴敷性好。

本发明将天然抗菌剂茶树油与新型经皮给药剂型-立方液晶结合，为高效、安全的痤疮治疗提供一种新制剂，同时为挥发油类药物立方液晶外用制剂的制备提供了参考。

附图说明

图1为茶树油乙醇溶液对表皮葡萄球菌的抑制作用图。

图2为gmo/乙醇/水体系三元相图。

图3为本发明制得的茶树油立方液晶的外观图，其中左图为立方液晶外观图，右图为层状液晶外观图(其中，茶树油、单油酸甘油酯(gmo)、乙醇和水的质量分别为0.1g、2.7g、0.3g、1.2g)。

图4为本发明制得的茶树油立方液晶的扫描电镜照片。

图5为本发明制得的茶树油立方液晶的性质表征图，其中a图为x-小角衍射图谱，b图为偏光显微镜照片。

图6为本发明制得的茶树油立方液晶的抑菌率。

图7茶树油溶液与立方液晶的体外累积释放率。

图8用于测定初黏力的电动测试仪。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.材料

1.1药物与试剂

表皮葡萄球菌(atcc14990，购自上海艾研生物科技有限公司)；茶树油，批号：so1026，购自广东富阳生物科技有限公司；gmo，购自丹麦danisco集团；lb肉汤培养基、琼脂粉，购自北京奥博星生物科技有限责任公司；乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器

立式压力蒸汽灭菌器(bxm-30r，上海博迅实业有限公司)；台式恒温振荡器(thz-d型，太仓市实验设备厂)；万分之一天平(bs110s，德国sartorius)；涡旋混合器(gl-88b，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；冷场发射扫描电子显微镜(ss-4800，日本hitachi)；x-小角衍射仪(saxsees，奥地利atonpaar)；超净工作台(yt-cj-2d，北京亚泰科隆仪器技术有限公司)。

2.方法与结果

2.1茶树油对表皮葡萄球菌的体外抑菌试验

2.1.1细菌培养基的配制

称取2glb肉汤培养基于烧瓶中，加入200ml超纯水，搅拌溶解，封口后置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min。锅内温度降至80℃时取出，室温冷却后置于4℃保存备用。另称取4glb肉汤培养基、4g琼脂粉于硬质玻璃瓶中，加入100ml超纯水搅拌溶解，玻璃瓶盖拧松后置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min，锅内温度降至80℃时取出，室温冷却至约50℃时，在超净台中倒入平皿中，冷却至完全凝固后，盖盖倒放于4℃中保存备用。

2.1.2表皮葡萄球菌新鲜菌液的制备

在超净台中用移液枪移取100μl冻存菌液于10ml液体培养基中，置于恒温振荡器中，于37℃、200r/min振荡24h，即得新鲜菌液。用移液枪吸取10μl新鲜菌液注入到计数板中，置于显微镜下观察计数。经镜下计数计算后得出新鲜菌液浓度为2×10⁶cfu/m。

2.1.3不同浓度茶树油溶液的配制

精密称取0.5g茶树油于10ml烧杯中，加少量乙醇溶解后转移至5ml容量瓶中，少量多次转移干净后用乙醇定容至刻度，即配制成100.10mg/ml的茶树油乙醇母液。摇匀后移取2.5ml至另一5ml容量瓶中，乙醇定容至刻度，即配制成50.05mg/ml的茶树油乙醇溶液，依此法分别配制浓度为25.02、12.51、6.256、3.128mg/ml的茶树油乙醇溶液。

2.1.4茶树油溶液抑菌试验

取7个无菌玻璃试管置于超净台中，编号1-7，每管加入3.5ml液体培养基，再向各试管中加入1ml新鲜菌液(4×10⁵cfu/ml)，用移液枪吹打混匀，向1-6号试管加入0.5ml浓度分别为100.1、50.05、25.02、12.52、6.256、3.128mg/ml的茶树油乙醇溶液，7号试管加入0.5ml乙醇作对照，最终茶树油浓度分别为10.01、5.005、2.502、1.251、0.6256、0.3128mg/ml，置于37℃恒温培养箱中培养24h。

取2个lb固体培养基平板，分别用记号笔划线平均分为4个区域，用接种环蘸取各试管中菌液，以划线法涂抹均匀，注意涂抹时区域之间不要有交叉污染。将平板倒放于37℃电热恒温培养箱中培养1天。观察实验各个平板上的细菌生长情况，并拍照记录(图1)。

当菌液中茶树油浓度≧2.502mg/ml时，表皮葡萄球菌的体外生长均可得到有效抑制。且随茶树油浓度增大，抑菌效果越明显。

痤疮发生主要致病菌是痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌，对茶树油抑制痤疮丙酸杆菌的研究较多，对后两者研究较少。

2.2立方液晶的处方优化

2.2.1三元相图法筛选处方

分别称取1、2、3、4、5、6、7、8、9ggmo置于50ml离心管内，将离心管放入45℃恒温水浴锅中加热至gmo完全融化，再分别加入9、8、7、6、5、4、3、2、1g乙醇，涡旋使其混合均匀，即得gmo/乙醇＝1:9(w/w)的混合物。同法配制gmo/乙醇比值分别为2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的混合物。

分别称取0.2g上述混合物置于10mlep管中，在涡旋振荡条件下用1ml注射器注入到1.8g预热至45℃的去离子水中，使gmo/乙醇混合物与水的比值为1:9(w/w)。同法制备混合物与水的比值分别为4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的总混合物，玻璃棒搅拌均匀后于室温下放置7天，观察各处方状态及是否形成立方液晶。采用origin7.5绘制三元相图。

当gmo、乙醇、水三者比例不同时，形成液晶情况不同(表1)，有的形成立方液晶，有的形成层状液晶，也有的仍为三者物理混合物。其中，以质量计，当gmo为9份，乙醇为1份，水为4份时，外观透明，黏度适中，易于涂抹，确定为茶树油立方液晶的最优处方。

表1茶树油液晶形成情况表

c-代表形成立方液晶；l-代表形成层状液晶；n-代表没有形成液晶

将表1中可形成立方液晶与层状液晶的处方点用origin7.5作图，得到gmo/乙醇/水体系三元相图(图2)。当gmo、乙醇和水三者比例不同时，分别在一定范围内能形成立方液晶和层状液晶，可在此范围内根据需要选择不同处方。

2.2.2最优处方制备茶树油立方液晶

精密称取2.7ggmo置于离心管内，将离心管放入45℃恒温水浴锅中加热至gmo完全融化，加入0.3g乙醇，涡旋使其混合均匀，作为油相。加入0.1g茶树油，再次涡旋混匀，用1ml注射器吸取1.2g预热至45℃的去离子水，边涡旋边将水滴加至油相中，玻璃棒搅拌均匀后于室温下放置7天。

与半透明、流动性较强的层状液晶相比，所制得立方液晶外观透明、黏稠、呈凝胶状(图3)。

2.3茶树油立方液晶性质表征

2.3.1扫描电镜表征立方液晶形态

适量茶树油立方液晶置于导电胶带上，干燥后放入离子溅射仪中喷金，置于扫描电镜中观察。电镜照片中有发亮线条围成较多规则的长方形，发亮线条可能为液晶晶体的棱角；而且液晶体表面凹凸清晰可见(图4)。

2.3.2x-小角衍射

剪取约2×2cm铝箔，用药匙取绿豆粒大小的样品置于铝箔纸中央，将铝箔四面折起，将样品包裹其中。置于载样品板上固定牢固，放入机器中待测试位置，并将感光板放入机器中，开启机器进行扫描，时间设定为20min。测试参数：电压：40kv；电流：40ma；入射光波长：0.154nm；温度：20℃。测试完成后，取出感光板置于检测器中，将检测器与计算机相连，读取感光板上信号。转化为excel数据表，绘图后进行峰的横坐标比值分析。

x-小角衍射图谱中两峰横坐标分别为1.4066和1.6245(图5a)，立方液晶两峰横坐标比值为0.858，接近于符合立方液晶的晶胞特征，属于双螺旋晶格。而层状液晶峰形与立方液晶大不相同。

2.3.3偏光显微镜

取适量茶树油立方液晶样品涂布于载玻片上，盖上盖玻片，置偏光显微镜下观察并拍照。茶树油立方液晶在偏光显微镜下为暗视野，符合立方液晶各向同性的光学性质(图5b)。

3.1茶树油立方液晶抑菌试验

取12支无菌玻璃试管置于超净台中，编号1-12，每管加入5ml液体培养基，再向各试管中加入100μl新鲜菌液，用移液枪吹打均匀。分别向4-6号、7-9号、10-12号试管中加入100mg空白立方液晶、100mg茶树油立方液晶(所述茶树油立方液晶中茶树油、单油酸甘油酯(gmo)、乙醇和水的质量比为0.1：2.7：0.3：1.2)、200mg所述茶树油立方液晶中茶树油、单油酸甘油酯(gmo)、乙醇和水的质量比为0.1：2.7：0.3：1.2)。置于恒温振荡器中，于37℃、200r/min振荡24h。

以菌液浓度(cfu/ml)为横坐标，吸光度值(a)为纵坐标，得到标准曲线为a＝0.1708c+0.0571(r＝0.994)。

以液体培养基为空白对照，用紫外分光光度计分别检测各试管菌液在波长600nm处的吸光度值。代入已知标准曲线求得菌液浓度，并计算抑菌率(图6)。

由此可知：与空白立方液晶相比，不同浓度茶树油立方液晶抑菌率均可达到30％。

3.2茶树油立方液晶体外释放实验

取200mg2％(w/w)茶树油立方液晶(所述茶树油立方液晶中茶树油、单油酸甘油酯(gmo)、乙醇和水的质量比为0.1：2.7：0.3：1.2)及4mg茶树油分别置于含10ml磷酸盐缓冲溶液(pbs)(ph7.4)的锥形瓶中。温度37℃、转速50r/min恒温振荡。分别于1、5、10h取出1ml释放液，同时补充等量等温的新鲜pbs缓冲溶液。hplc测定释放液中茶树油含量。每个样品重复三份。

测定茶树油中主要成分4-松油醇的高效液相色谱法具体条件为：

仪器：lc-10atvp岛津高效液相；

色谱柱：c18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：甲醇/水(90:10，v/v)，过0.45μm滤膜，超声15min；

流速：1ml·min^-1；

检测波长：212nm；

柱温：30℃；

进样体积为20μl。

结果表明与茶树油溶液相比，茶树油立方液晶具有明显的缓释作用(图7)。

3.3茶树油立方液晶初黏力的测定

初黏力是指物品的表面粘着力，可用于评价茶树油立方液晶在皮肤局部停留时间。测定方法为：取约2g茶树油立方液晶置于电动测试仪上方的台面上(图8)，在立方液晶上放置一个100g的砝码，将传感器感应头朝上，调整上限位，使测头可刚好将砝码顶起(不可顶翻)，停留5s后，感应头自动向下移动，到达下限位后，停止移动，按下传感器的“peak”键，可得到传感器向下运动的极值，此极值作为初黏力值(单位：牛顿(n))，重复三次，求平均值。茶树油立方液晶初黏力为0.923±0.006n，具有较好的生物黏附性。这有利于滞留在局部持续发挥抑菌作用。