本发明涉及药物领域，具体涉及一种防治糖尿病肾病的朝药提取物及其制备方法，一种包括所述朝药提取物的朝药片剂以及应用。
背景技术
糖尿病肾病(diabetickidneydisease,dkd)是指由糖尿病(diabetesmellitus,dm)引起的肾脏病变，是dm引起的危害性最大的一种慢性并发症。dkd主要的临床表现是出现蛋白尿。dkd是导致终末期肾衰的首位因素，一旦进入中后期肾脏纤维化，其肾脏损害将不可逆转，并最终可发展为终末期肾衰竭(endstagerenaldisease,esrd)。dkd的肾脏病变早期可见肾脏肥大，皮质增厚而苍白，若及时加以干预治疗，控制血糖，可使肾脏逐渐恢复正常；若病程进展，肾小球毛细血管出现基膜增厚，轻度增生，但此时病情仍可逆转；若病情继续发展为弥漫性糖尿病肾小球硬化症。
据统计，糖尿病患者中，dkd患者死亡率达60％，由于dkd致使肾功能衰竭的死亡人数比非糖尿病患者多17倍。近几年研究发现，不只是ⅰ型糖尿病会发展成为dkd，dkd也会出现于ⅱ型糖尿病中。
当今社会，在人们生活方式变更以及严重的人口老龄化等方面的影响下，dkd危害人类健康的趋势逐年上升，故积极治疗dkd显得格外重要。中老年易患有dkd，最初没有显着的临床症状，当肾病综合征呈现时，糖尿病病程已有数年之久。dkd患者发病早期会产生白蛋白尿，随后逐步出现大量蛋白尿，3～5年即进入尿毒症。目前尽管糖尿病患者出现早期dkd症状，却没有十分有效的治疗手段。因此，唯一奏效的方法就是早期诊断治疗。
中国朝鲜族民族医药学(简称朝医药学)根据dm患者特点并结合疾病用药，以朝医方千金文武汤为代表，临床过程中，所用的处方相对稳定且疗效显著，适合进一步开发为群体化预防和治疗dm的新药或保健品。朝医方千金文武汤收录于朝医学经典著作之一《东医四象新编》，主治“太阴人”的“下消”证。
目前对于具有防治dkd的朝药复方已经有了相关报道，比如中国专利cn107041924报道了一种防治糖尿病的朝药复方提取物及其制备方法，该提取物可用于控制血糖、抑制肾脏异常增大、组织损伤修复、控制小鼠过氧化损伤、抑制小鼠血清肿瘤坏死因子α，并呈现量效关系。然而，该朝药复方提取物的服用量较大，不易携带，治疗效果有待进一步提升。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术的朝药复方提取物防治dkd的效果不够显著的问题，提供了一种防治dkd的朝药提取物的制备方法，制备得到的朝药提取物疗效更佳，防治dkd的效果更优。
本发明为了进一步解决现有的朝药复方提取物服用量较大、不易携带的问题，提供了一种防治dkd的药物，该片剂能够显著降低大鼠血糖、增加体质量、减少dkd模型大鼠的白蛋白、nag以及bun含量。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种防治dkd的朝药提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以质量分数20～40％的乙醇水溶液为溶剂对朝药提取物的原料进行提取，收集液体部分，得到提取液；
按重量份计，所述朝药提取物的原料包括葛根2～4份、黄芩2～4份、山药2～4份、蒿本2～4份、五味子1～2份、桔梗1～2份、升麻1～2份、白芷1～2份和麦门冬1～2份；
(2)吸附澄清法对所述提取液进行吸附，收集液体部分，得到精制液；
(3)以d101型大孔树脂柱对所述精制液进行纯化，收集洗脱液，干燥，得到所述朝药提取物；
所述纯化的条件包括：洗脱剂为质量分数25～35％的乙醇水溶液，上样浓度为0.05g/ml，上样量为5～7.6bv，上样流速为0.8～1.2bv/h，洗脱液体积为5～7.6bv，洗脱流速为0.5～1.5bv/h。
优选的，所述步骤(3)中，所述上样流速为1bv/h，上样量为6～7bv，洗脱流速为1bv/h。
优选的，所述洗脱剂为质量分数30％的乙醇水溶液。
本发明还提供了一种上述技术方案所述制备方法得到的防治dkd的朝药提取物，所述朝药提取物中的总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比为5～15:1～3:1～4。
优选的，所述朝药提取物中，总黄酮含量为6～8mg/g，总多糖含量为0.5～1.5mg/g，总皂苷含量为1～2mg/g。
本发明提供了一种防治dkd的药物，包括上述技术方案所述的朝药提取物以及药用辅料。
优选的，按重量百分比计，包括权利要求4或5所述的朝药提取物50～80％，药用辅料20～50％。
优选的，，所述药用辅料包括乳糖、mcc、cmc-na、硬脂酸镁和质量分数60～80％的乙醇水溶液。
优选的，所述药物的剂型选自颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂或酊剂。
优选的，当所述药物剂型为片剂时，包括以下重量份的组分：320～400份权利要求1或2所述的朝药提取物、60～80份乳糖、40～60份mcc、20～30份cms-na、1～8份硬脂酸镁和0.1～1份质量分数60～80％的乙醇水溶液。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
本发明提供了一种防治dkd的朝药提取物的制备方法，包括乙醇提取、吸附澄清法精制和大孔树脂柱纯化的步骤。与现有技术相比，本发明通过限定洗脱条件调整朝药组合物中的有效物质含量比例，使君药成分葛根素等黄酮类物质含量显著提高，进而提升所得朝药提取物的治疗效果。
本发明提供的制备方法在调整有效物质含量比例的同时，最大限度的保留了有效成分，去除杂质，降低出膏率，易于作为片剂等固体制剂的原料。
本发明还提供了一种上述技术方案所述制备方法得到的防治dkd的朝药提取物，所述朝药提取物中的总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比为5～15:1～3:1～4。研究表明，朝药提取物原料配伍后具有防治dkd的作用，进一步的研究分析显示，在提取物中发挥主要作用的有效成分为黄酮类化合物、多糖类化合物以及皂苷类化合物。本发明通过调整纯化条件对朝药提取物中的有效成分比例进行调整，从而获得了更优的dkd防治效果，可显著改善模型大鼠的血糖，增加体质量，减少患病鼠白蛋白、nag、rbp、hcy、bun。
本发明还提供了一种防治dkd的药物，包括前述技术方案所述的朝药提取物以及药用辅料。本发明将有效物质含量高且杂质少的朝药提取物作为原料，能够制成服用剂量较低的片剂，便于服用，也便于携带。
附图说明
图1为实施例6中不同上样浓度下的泄露曲线；
图2为实施例7中不同上样流速的泄露曲线；
图3为实施例8中不同上样量的泄露曲线；
图4为实施例9中不同洗脱量的泄露曲线；
图5为实施例10中不同洗脱速度的泄露曲线；
图6为实施例15中对朝药片剂测定的累计溶出曲线；
图7为实施例16中给药后各组大鼠体重变化的柱状图；
图8为实施例16中给药后各组大鼠血糖变化的柱状图；
图9为实施例16中给药后各组大鼠的肾重值比较图；
图10为实施例16中给药后各组大鼠的24h尿微量白蛋白含量比较图；
图11为实施例16中给药后各组大鼠n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)含量比较图；
图12为实施例16中给药后各组大鼠视黄醇结合蛋白(rbp)含量比较图；
图13为实施例16中给药后各组大鼠尿素氮(bun)含量比较图；
图14为实施例16中给药后各组大鼠同型半胱氨酸(hcy)含量比较图；
图15为实施例16中给药后各组大鼠尿蛋白定量比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种上述技术方案所述防治dkd的朝药提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以质量分数20～40％的乙醇水溶液为溶剂对朝药提取物的原料进行提取，收集液体部分，得到提取液；
按重量份计，所述朝药提取物的原料包括葛根2～4份、黄芩2～4份、山药2～4份、蒿本2～4份、五味子1～2份、桔梗1～2份、升麻1～2份、白芷1～2份和麦门冬1～2份；
(2)吸附澄清法对提取液进行吸附，收集液体部分，得到精制液；
(3)以d101型大孔树脂柱对精制液进行纯化，收集洗脱液，干燥，得到所述朝药提取物；
所述d101型大孔树脂柱的纯化条件包括：以质量分数25～35％的乙醇水溶液为洗脱剂，上样浓度为0.05g/ml，上样量为5～7.6bv，上样流速为0.8～1.2bv/h，洗脱液体积为5～7.6bv，洗脱流速为0.5～1.5bv/h。
本发明对所述朝药提取物的原料来源无特殊限定，采用市售商品即可。本发明所述朝药提取物的原料优选为葛根20份、黄芩20份、山药20份、藁本20份、五味子10份、桔梗10份、升麻10份、白芷10份和麦门冬10份。
本发明以质量分数20～40％的乙醇水溶液为溶剂对朝药提取物的原料进行提取，收集液体部分，得到提取液。
在本发明中，所述乙醇水溶液的质量分数优选为30％。
在本发明中，所述溶剂提取次数优选为2～3次，每次提取包括溶剂提取和固液分离两个步骤。
进一步的，当溶剂提取次数为多次时：第1次提取溶剂用量优选为原料总重量的8～12倍，更优选为9～10倍；第1次溶剂提取时间优选为1～2h，更优选为1.5h。第2～3次溶剂提取时，以上一次固液分离得到的固体部分与溶剂混合进行提取，其中第2次或第3次溶剂提取时的溶剂用量优选为原料总重量的6～10倍，更优选为8～9倍；第2次或第3次溶剂提取的提取时间优选为0.5～1.5h，更优选为1～1.2h。将多次提取后分离得到的液体部分合并，即得提取液。
本发明对所述溶剂提取的温度没有特殊限定，常温下进行即可。本发明对所述固液分离的方式无特殊限定，采用本领域已知的固液分离方法即可，比如过滤、离心等。
得到提取液后，本发明以吸附澄清法对提取液进行吸附，收集液体部分，得到精制液。
在本发明中，所述吸附澄清法优选的采用ztc1+1天然澄清剂作为澄清剂。ztc1+1天然澄清剂来源于市售商品，包括a组分和b组分，本发明对此无特殊限定。
具体的，当采用ztc1+1天然澄清剂进行澄清吸附时：首先将提取液浓缩至朝药提取物原料总质量的1～2倍，得到浓缩提取液；将浓缩提取液与ztc1+1天然澄清剂的b组分在60～65℃下混合，在0～4℃下静置12～48h，固液分离取上清液；将上清液与ztc1+1天然澄清剂的a组分混合，静置3～6h，固液分离，收集液体部分，得到精制液。
在本发明中，所述提取液浓缩方式不做特殊限定，采用本领域已知的浓缩方式即可，比如减压浓缩等。在本发明中，所述0～4℃下静置时间优选为18～24h。
在本发明中，所述浓缩提取液与b组分的体积比为100:5～9，更优选为100:6～8。在本发明中，所述a组分的体积为b组分体积的0.5倍。
得到精制液后，本发明以d101型大孔树脂柱对精制液进行纯化，收集洗脱液，干燥，得到所述朝药提取物；所述d101型大孔树脂柱的纯化条件包括：以质量分数25～35％的乙醇水溶液为洗脱剂，上样浓度为0.05g/ml，上样量为5～7.6bv，上样流速为0.8～1.2bv/h，洗脱液体积为5～7.6bv，洗脱流速为0.5～1.5bv/h。
本发明选择以总黄酮含量作为指标含量对大孔树脂吸附条件进行限定，原因如下：
其一、本发明所述防治dkd的朝药组分中以黄酮、皂苷和多糖为有效物质，该朝药组方中，葛根清热解毒，生津止渴为君药；黄芩收敛肺元，清热解毒；藁本发散表邪，祛风止痛共为臣药；升麻发散风热，解毒升阳；麦门冬补肺和润肺；五味子健肺直肺；山药和桔梗有壮肺；白芷祛风解表止痛共为佐药。各药合用，具有补肺敛肺、养胃生津、健脾固肾、利水消肿的功效。君药葛根的主要有效部位(葛根素)为黄酮类化合物，选择总黄酮含量作为指标含量能够有效确保整体效果；
其二、黄酮相对于多糖和皂苷的稳定性更强，测定方便，对于筛选最佳上样浓度为、上样量为、上样流速为、洗脱剂用量、洗脱流速为等对d101型大孔树脂吸附能力以及解析能力影响因素的条件而言更为有效；
其三，本发明的前期体外实验结果证明，朝药提取物的有效活性更高、抗氧化应激以及改善肾纤维化更有效的比例中均以总黄酮含量的比例最高。
因而本发明通过总黄酮含量为优化指标含量，从而确定的纯化方法参数能够得到防治糖尿肾病效果更优的朝药提取物。
经检测，本发明采用d101型大孔树脂柱对所得精制液进行纯化，以总黄酮含量计算d101型大孔树脂柱的静态吸附量和解析量，结果显示，d101型大孔吸附树脂柱对精制液的静态吸附量为1.20mg/g(以总黄酮含量计)，静态解析率为84％(以总黄酮含量计)。
在本发明中，所述洗脱剂乙醇水溶液的质量分数优选为25～35％、上样浓度为0.05g/ml、上样量为5～7.6bv、上样流速为0.8～1.2bv/h、洗脱液体积为5～7.6bv、洗脱流速为0.5～1.5bv/h。
在本发明中，所述洗脱剂的浓度优选为质量份数30％的乙醇水溶液。
在本发明中，所述上样浓度为0.05g/ml时的d101型大孔树脂柱吸附能力最为平稳，最晚出现泄漏。随着上样浓度为的升高则越早泄露，主要是由于上样溶液的粘度过大容易堵塞d101型大孔树脂柱的缝隙，从而影响吸附效果；
在本发明中，所述上样流速优选为1ba/h。在本发明限定的上样流速为下d101型大孔树脂柱的吸附能力最为平稳，最晚出现泄露。上样流速为的增加会导致泄露时间提早，并且总黄酮含量会陡然升高，进而导致黄酮、多糖和皂苷有效物质配比不平衡，无法达到提高防治效果的目的。
在本发明中，所述上样量优选为6～7bv，上样量为过高将导致总黄酮含量明显升高，表明d101型大孔树脂柱出现吸附饱和，因而选择最大装样量8bv的80％左右为上样量。
在本发明中，所述洗脱液体积优选为6～7bv。当所述洗脱液的使用体积达到6～7bv时，d101型大孔树脂柱的泄漏量(按总黄酮含量计)开始趋于平稳，即表明基本将d101型大孔树脂柱中的总黄酮洗脱完毕。
在本发明中，所述洗脱液流速优选为1bv/h。试验表明，d101型大孔树脂柱对精制液中的总黄酮解析率随着洗脱液流速的加快而降低，因而选择1bv/h作用的洗脱液的流速以获得更高的解析率。
本发明收集经过d101型大孔树脂柱洗脱得到的洗脱液后，优选的对洗脱液进行浓缩、干燥，粉碎，得到固态的朝药提取物。所述浓缩方式优选为减压浓缩，以防加热造成有效物质损失。本发明所述干燥方式优选为真空干燥、冷冻干燥或喷雾干燥，本发明对于具体的干燥方式没有特殊限定，能够干燥至含水量为1～6％即可。本发明对所述粉碎没有特殊限定，粉碎至10～50目即可。
经检测，本发明所述制备方法得到的朝药提取物中总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比在5～15:1～3:1～4范围。采用本发明提供的制备方法能够使朝药提取物中的有效物质含量相对增加，降低杂质含量，将原有提取物的口服有效剂量从14.196g缩减至2.6g左右，使其能够作为制成片剂等便携的固体制剂原料。
药效试验显示，本发明制备得到的朝药提取物能够显著降低dkd模型大鼠的血糖、提高了模型大鼠的体质量，还能够减少dkd的白蛋白、nag、bun含量，缓解或抑制dkd模型大鼠的视网膜病变病程。
本发明提供了一种由上述技术方案所述制备方法得到的防治dkd的朝药提取物，所述朝药提取物中的总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比为5～15:1～3:1～4。
本发明经过研究发现，当朝药提取物中的有效成分总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比为5～15:1～3:1～4时，其防治dkd的效果更优。本发明优选的，所述朝药提取物含有总黄酮、总多糖和总皂苷的质量比为7.4:1.1:1.4。
在本发明中，所述朝药提取物中：总黄酮的含量优选为6～8mg/g，更优选为7.4mg/g；总多糖的含量优选为0.5～1.5mg/g，更优选为1.1mg/g；总皂苷的含量优选为1～2mg/g，更优选为1.4mg/g。
经药理实验证明，本发明提供的朝药提取物对dkd模型大鼠具有降低血糖，增加体质量，减少患病鼠白蛋白、nag、bun含量的作用，可以作为治疗dkd的药物中有效物质使用。
本发明还提供了一种防治dkd的药物，包括前述技术方案所述的朝药提取物以及药用辅料。其中的朝药提取物作为有效成分。
在本发明中，按重量百分比计，包括朝药提取物50～80％，药用辅料20～50％。本发明优选的，所述朝药提取物所占重量百分比优选为60～75％，更优选为70～72％。本发明优选的，所述药用辅料所占重量百分比优选为25～40％，更优选为28～32％。
在本发明中，所述药用辅料优选的包括稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和矫味剂等中的一种或多种。
在本发明中，所述稀释剂或填充剂包括但不限于淀粉、糊精、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、蔗糖、甘露醇、山梨醇、无机盐类中的一种或多种；
在本发明中，所述润湿剂包括但不显著蒸馏水、乙醇、不同浓度的乙醇水溶液；
在本发明中，所述粘合剂包括但不限于淀粉浆、纤维素的衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠溶液、明胶、蔗糖中的一种或多种；
在本发明中，所述崩解剂包括但不限于干淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基淀粉钠、泡腾崩解剂中的一种或多种；
在本发明中，所述润滑剂包括但不限于聚乙二醇、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、氢化植物油中的一种或多种；
在本发明中，所述矫味剂包括但不限于甜味剂、香料、香精中的一种或多种。
在本发明中，所述防治dkd的药物剂型包括但不限于颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、口服液、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂滴眼剂、滴鼻剂、栓剂、丸剂、微球制剂或酊剂。
本发明优选的，当所述药物剂型为片剂时，的药用辅料包括乳糖、mcc、cmc-na、硬脂酸镁和质量分数60～80％的乙醇水溶液。其中，所述乳糖和mcc作为填充剂，cms-na作为崩解剂，质量分数60～80％的乙醇水溶液为润湿剂。
本发明更优选的，当所述药物剂型为片剂时，包括以下重量份的组分：320～400份前述技术方案所述的朝药提取物、60～80份乳糖、40～60份mcc、20～30份cms-na、1～8份硬脂酸镁和0.1～1份质量分数70％的乙醇水溶液；最优选为353份前述技术方案所述的朝药提取物、71份乳糖、47份mcc、25份cms-na、5份硬脂酸镁和0.5份质量分数70％的乙醇水溶液。
本发明对所述防治dkd的具体制备工艺无特殊限定，采用本领域已知的片剂制备方法即可，本发明优选的采用湿法制粒发制备朝药片剂。
本发明研究表明，朝药提取物或以朝药提取物为有效成分的朝药片剂具有预防或治疗dkd的作用，可用于制备预防或治疗上述疾病的药物中。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
1、实验试剂
本发明下述实施例和对比例中所用试剂与试药见表1，其中药材饮片均购自北京同仁堂延边药店有限责任公司。
表1实验试剂
2、实验仪器
本发明下述实施例和对比例中所用实验仪器见表2。
表2实验仪器
3.符号说明
本发明下述实施例和对比例中涉及的英文缩写中英文全称如下。
实施例1
(1)取朝药提取物的原料：葛根20g、黄芩20g、山药20g、藁本20g、五味子10g、桔梗10g、升麻10g、白芷10g、麦门冬10g。将上述原料共130g与1.3kg质量分数30％的乙醇水溶液混合，浸泡1.5h，滤过，得到第一次滤液和滤渣；取滤渣加入8倍质量的质量分数30％的乙醇水溶液混合，提取1h，滤过，得到第二次滤液和滤渣；合并两次提取的滤液，得到提取液。
(2)将提取液浓缩至130g，得到浓缩提取液，将浓缩提取液在60℃下加入浓缩提取液体积7％的ztc1+1天然澄清剂b组分，混合搅拌后，在4℃下冷藏静置24h，取静置后的液体部分离心，过滤后取滤液，滤液与b组分体积一半的a组分混合，静置4h后过滤，取液体部分，得到精制液。
(3)将足量d101型mar用无水乙醇浸泡，充分吸湿膨胀24h后上柱，用无水乙醇洗脱至洗脱液加5倍量蒸馏水无白色浑浊现象后，用蒸馏水洗至无乙醇味，得到预处理好的d101型大孔吸附树脂柱。
以预处理好的d101型大孔吸附树脂柱纯化所述精制液，上样浓度为0.05g/ml，上样流速为1bv·h-1，上样量为6.36bv，用30％乙醇洗脱，洗脱液体积为6.5bv，洗脱流速为1bv·h-1，收集洗脱液。
(4)将洗脱液减压浓缩至30ml，在-40℃条件下预冻24h，放入真空冷冻干燥机中抽真空48h，即得朝药提取物。
实施例2
(1)取朝药提取物的原料：葛根18g、黄芩21g、山药20g、藁本20g、五味子10g、桔梗11g、升麻10g、白芷10g、麦门冬9g。将上述原料共129g与1.5kg质量分数28％的乙醇水溶液混合，浸泡1h，滤过，得到滤液，得到提取液。
(2)将提取液浓缩至129g，得到浓缩提取液，将浓缩提取液在60℃下加入浓缩提取液体积7％的ztc1+1天然澄清剂b组分，混合搅拌后，在4℃下冷藏静置24h，取静置后的液体部分离心，过滤后取滤液，滤液与b组分体积一半的a组分混合，静置4h后过滤，取液体部分，得到精制液。
(3)将足量d101型mar用无水乙醇浸泡，充分吸湿膨胀24h后上柱，用无水乙醇洗脱至洗脱液加5倍量蒸馏水无白色浑浊现象后，用蒸馏水洗至无乙醇味，得到预处理好的d101型大孔吸附树脂柱。
以预处理好的d101型大孔吸附树脂柱纯化所述精制液，上样浓度为0.05g/ml，上样量为7.8bv，上样流速为0.9bv·h-1，用28％乙醇洗脱，洗脱液体积为6.5bv，洗脱流速为1bv·h-1，收集洗脱液。
(4)将洗脱液进行真空干燥，粉碎，得到朝药提取物。
实施例3
(1)取朝药提取物的原料：葛根30g、黄芩15g、山药40g、藁本20g、五味子18g、桔梗15g、升麻15g、白芷20g、麦门冬14g。将上述原料共187g与1.5kg质量分数32％的乙醇水溶液混合，浸泡1h，滤过，得到第一次滤液和滤渣；取滤渣加入7倍质量的质量分数32％的乙醇水溶液混合，提取1.5h，滤过，得到第二次滤液和滤渣；合并两次提取的滤液，得到提取液。
(2)将提取液浓缩至187g，得到浓缩提取液，将浓缩提取液在65℃下加入浓缩提取液体积7％的ztc1+1天然澄清剂b组分，混合搅拌后，在2℃下冷藏静置46h，取静置后的液体部分离心，过滤后取滤液，滤液与b组分体积一半的a组分混合，静置3h后过滤，取液体部分，得到精制液。
(3)将足量d101型mar用无水乙醇浸泡，充分吸湿膨胀24h后上柱，用无水乙醇洗脱至洗脱液加5倍量蒸馏水无白色浑浊现象后，用蒸馏水洗至无乙醇味，得到预处理好的d101型大孔吸附树脂柱。
以预处理好的d101型大孔吸附树脂柱纯化所述精制液，上样浓度为0.05g/ml，上样量为7bv，上样流速为1bv·h-1，用32％乙醇洗脱，洗脱液体积为6bv，洗脱流速为1bv·h-1，收集洗脱液。
(4)将洗脱液进行喷雾干燥，粉碎，得到朝药提取物。
实施例4
提取液和精制液中总黄酮、总多糖、总皂苷含量的测定。
本次试验采用分光光度法对朝药提取物的提取液、精制液中总黄酮、总黄酮以及总皂苷的含量进行测定。
1、溶液配制
总黄酮、总多糖、总皂苷对照品及供试品溶液配制方法见表3。
提取液：按照实施例的步骤(1)制备得到提取液。
2、检测波长的确定及线性关系
总黄酮、总多糖、总皂苷检测波长的确定及线性关系见表4。
结果表明，总黄酮浓度在115～690μg/ml范围内与吸光度值线性关系良好；总多糖浓度在10.4～93.6μg/ml范围内与吸光度值线性关系良好；总皂苷浓度在19.2～96μg/ml范围内与吸光度值线性关系良好。
3、精密度考察
精密量取一定量对照品溶液，各重复5次测定总黄酮、总多糖、总皂苷吸光度，考察仪器的精密性，结果芦丁对照品平均吸光度值为0.212，rsd值为0.54％；葡萄糖对照品平均吸光度值为0.698，rsd值为0.68％；三七皂苷对照品平均吸光度值为0.505，rsd值为0.11％。结果表明，仪器精密度良好。
表3总黄酮、总多糖、总皂苷对照品及供试品溶液配制方法
表4总黄酮、总多糖、总皂苷检测波长的确定及线性关系
4、稳定性考察
分别取一定浓度的标准品，分别于0,2,4,8,10,12h，测定总黄酮、总多糖、总皂苷的吸光度，考察稳定性，结果见表5。
结果表明，总黄酮在0～12h的平均吸光度值为0.405，rsd值为1.808％；总多糖在0～12h的平均吸光度值为0.404，rsd值为1.111％；总皂苷在0～12h的平均吸光度值为0.593，rsd值为0.897％，结果表明待测样品溶液在一定时间内稳定性良好。
表5总黄酮、总多糖、总皂苷稳定性考察结果
5、重复性考察
分别精密量取一定量样品溶液5份，测量总黄酮、总多糖、总皂苷的吸光度值，验证方法的重复性。总黄酮平均吸光度值为0.4，rsd值为0.793％；总多糖平均吸光度值为0.398，rsd值为1.452％；总皂苷平均吸光度值为0.587，rsd值为1.44％。结果表明此法重复性良好，结果见表6。
表6总黄酮、总多糖、总皂苷重复性考察结果
6、加样回收率考察
量取已知含量样品溶液各6份，分别精密加入适量芦丁对照品、葡萄糖对照品、三七皂苷对照品，制备不同含量的供试品溶液，计算回收率，见表1-8。总黄酮平均回收率为99.25％，rsd＝0.791％；总多糖平均回收率为99.87％，rsd＝0.621％；总皂苷平均回收率为99.78％，rsd＝0.373％。结果表明，测定方法准确、可行。
7、精制前后有效成分保留率的考察
按照实施例1的步骤(1)和步骤(2)制备得到精制液。
测定提取液与精制液中的总黄酮、总多糖和总皂苷含量及其保留率，以对精制前后的溶液进行比较，结果如表7和表8所示。
结果表明，精制前后的提取液和精制液中，总黄酮、总多糖和总皂苷的平均含量无显著变化。
表7回收率考察结果
表8提取液精制前后有效成分保留率
小结：
本次使用利用紫外分光光度法测定提取液、精制液中总黄酮、总多糖、总皂苷含量，确定精制前后总黄酮、总多糖、总皂苷含量为413.36μg/ml、88.56μg/ml、92.15μg/ml；385.50μg/ml、79.48μg/ml、86.97μg/ml。为后续纯化工艺指标成分的含量提供可靠依据。
实施例5
吸附率和解析率的确定
对mar进行静态吸附和静态解析实验，称取经预处理的mar3份(按照实施例1中步骤(3)中的方法进行)，每份3g(45℃烘干2h，并至于80目钢筛，过筛后取筛内树脂精密称重)，置于100ml锥形瓶中，并分别加入30ml精制液(按照实施例1步骤(1)和步骤(2)制备得到)，置于摇床，室温下震荡吸附5h，测定吸附平衡液中总黄酮的含量(按照实施例4中的总黄酮测定方法进行)，并根据公式(1)和公式(2)计算mar的吸附量及吸附率：
q＝(co-ce)×v1/m(1)
e＝(co-ce)/co×100％(2)
其中，q为吸附量(mg·g-1)；co为吸附前样品溶液中总黄酮含量(mg/ml)；ce为吸附后溶液中总黄酮(mg/ml)；v1为精制液体积(ml)；m为树脂干重(g)；e为吸附率(％)。
将静态吸附试验过滤后的mar置于100ml锥形瓶，加入30ml蒸馏水作为洗脱剂，置于摇床室温震荡解析5h，解析完成后，测定洗脱液吸光度值，确定总黄酮含量，计算树脂的解析率及解析量，解析率及解析量分别按公式3和公式4计算：
d＝c’×v2/m(3)
e’＝c’×v2/(co-ce)×v1×100％(4)
其中，d为解析量(mg·g-1)；c’为洗脱液总黄酮含量(mg/ml)；v2为洗脱液体积(ml)；e’为解析率(％)。
根据上述静态吸附与静态解析实验方法，d101型mar对精制液静态吸附量为1.20mg·g-1，静态解析率为84％。
对比例1
除步骤(3)中的上样浓度为0.07g/ml外，其余均与实施例1相同。
对比例2
除步骤(3)中的上样浓度为0.10g/ml外，其余均与实施例1相同。
实施例6
分别按照实施例1、对比例1和对比例2的方法制备朝药提取物，每上样25ml时，收集一次洗脱液，测定其中的总黄酮吸光度值，绘制泄露曲线，结果如图1所示。
由泄露曲线可见，当上样浓度为0.05g/ml，mar吸附能力最为平稳，最晚出现泄露，优于上样浓度为0.07g/ml；而当上样浓度为0.10g/ml时，在上样量为50ml时即出现明显泄露。分析原因是因为上样浓度过大时，样品黏度过大堵塞树脂缝隙，影响吸附效果。可见，在本发明限定的上样浓度下分离得到的朝药提取物中有效物质含量最高，有效物质保留最多。
对比例3
除步骤(3)中的上样流速为2.5bv/h外，其余均与实施例1相同。
对比例4
除步骤(3)中的上样流速为4bv/h外，其余均与实施例1相同。
实施例7
设定上样量为275ml，其余步骤均分别按照实施例1和对比例3、4的方法制备朝药提取物，每上样25ml时，收集一次洗脱液测定总黄酮吸光度值，绘制泄露曲线，如图2所示。
由图2可见，当上样流速为1bv·h-1时，mar吸附能力最平稳，最晚出现泄露，当流速为2.5bv·h-1和4bv·h-1，在上样量为50ml时即出现泄露，且吸光度值陡然升高。
实施例8
设置上样浓度为0.05g·ml-1，上样流速为1bv·h-1，上样量为275ml，每上样25ml时，收集一次洗脱液测定吸光度值，绘制泄露曲线如图3。
由图可见，在mar上样量为125～150ml时，吸光度值显著升高，表明mar出现吸附饱和，考虑采用最大装样量的80％，最终确定最佳上样量为100ml，采用最佳上样量为的80％～120％为本发明限定的上样量为范围，为80～120ml，即5～7.6bv。
实施例9
按照实施例1所述步骤进行。收集洗脱液时，每10ml测定一次洗脱液中总黄酮的吸光度值，绘制泄露曲线，如图4所示。
由图可见，当洗脱液体积达100ml时，泄露量开始趋平稳，基本将mar中总黄酮洗脱完毕，综合考虑洗脱质量和洗脱效率，确定采用基本洗脱完毕所用洗脱剂用量的80％～120％作为本发明限定的洗脱体积，为80～120ml，即5～7.6bv。
对比例5
除步骤(3)中的洗脱流速为2.5bv/h外，其他步骤均与实施例1相同。
对比例6
除步骤(3)中的洗脱流速为4bv/h外，其他步骤均与实施例1相同。
对比例7
除步骤(3)中的洗脱流速为6.5bv/h外，其他步骤均与实施例1相同。
实施例10
分别按照实施例1、对比例5～7的方法制备朝药组合物，将收集的洗脱液减压干燥至30ml，分别测定其中的总黄酮含量，计算解析率，绘制流速与解析率的关系图，如图5所示。
由图5可知，实施例1采用的洗脱流速下解析率最高，而对比例5～7的洗脱流速较高，其解析率也随着洗脱流速的加快而降低，即本发明采用的洗脱流速的解析率更佳。
实施例11
按照实施例1所示的方法，分别制备其中的提取液、精制液和洗脱液，测定所得提取液、精制液和洗脱液中总黄酮、总多糖和总皂苷含量(实施例4的方法)，结果如表9。
表9提取液、精制液和洗脱液中有效组分的含量(
分别将所得提取液、精制液和洗脱液减压浓缩，在-40℃条件下预冻24h，放入真空冷冻干燥机中抽真空48h，得到干浸膏。
测定所得提取液、精制液和洗脱液干浸膏中总黄酮、总多糖和总皂苷含量(实施例4的方法)，结果如表10。
表10不同工艺阶段干浸膏得率及干浸膏中有效组分含量(
由表9和表10的数据可以看出，提取液和精制液中的有效成分变化不显著，各有效物质之间的比例并未发生显著改变。经过本发明所限定的洗脱纯化步骤后，所得洗脱液中的总黄酮、总皂苷所占比例显著升高，总多糖所占比例显著降低，即本发明通过对洗脱条件的优化调整了有效物质的含量比例，从而获得疗效更佳的朝药提取物。
由表10还可以看出，经过本发明所述方法纯化后得到的洗脱液干浸膏得率显著下降，有效降低了所需口服给药的服用量，可以用于制备片剂等便于携带的剂型，降低服药量。
实施例12制备朝药片剂：
制剂处方见表11。
表11朝药片剂制剂处方
制备工艺为：将表11中的各原辅料分别过80目筛，按照表11的比例将朝药组合物、乳糖、mcc、cms-na以等量递加法混合，混合过程中加入硬脂酸镁以及质量分数70％的乙醇水溶液，制成软材，过20目筛制粒，放入50℃烘箱烘干1h，取出；利用20目和60目筛整粒，留取20目筛和60目筛中间部分颗粒，再加入少量质量分数70％的乙醇水溶液润湿，使用10.00mm直径圆冲压片，控制压力使硬度为50n，即得朝药片剂。
实施例13
取实施例1制备得到的朝药提取物与糊精按照质量比3:1混合，湿法制粒，制成软材，过40目筛制粒，放入50℃烘箱烘干1.2h，取出；利用20目和60目筛整粒，留取20目筛和60目筛中间部分颗粒，加入少量质量分数65％的乙醇水溶液润湿，使用10.00mm直径圆冲压片，控制压力使硬度为50n，即得朝药片剂。
实施例14
取实施例1制备得到的朝药提取物与乳糖按照质量比3.5:1混合，湿法制粒，制成软材，过20目筛制粒，放入58℃烘箱烘干1h，取出；利用20目和60目筛整粒，留取20目筛和60目筛中间部分颗粒，加入少量质量分数75％的乙醇水溶液润湿，使用10.00mm直径圆冲压片，控制压力使硬度为52n，即得朝药片剂。
实施例15
对实施例12制备得到的朝药片剂外观、重量差异、崩解时限、溶出度进行检测，按照实施例4所示方法对片剂中的总黄酮、总皂苷和总多糖含量进行测定，采用高效液相色谱法测定朝药片剂中的葛根素、黄芩素含量。
其中外观检测、重量差异、崩解时限以及溶出度的检测方法参见《中国药典》。
1、片剂表面细腻光滑、色泽均匀、无斑点。
2、重量差异：本品标准片重0.5g，重量差异限度为±5％，在规定范围内，样品片剂符合重量差异规定。
3、崩解时限：所述朝药片剂在15min内完全崩解，符合规定。通过规定标准考察，样品片剂符合崩解时限检查规定。
4、溶出度检查：采用中国药典第一法桨法，以葛根素为指标，进行测定。
溶出介质为蒸馏水(脱气处理)，溶质温度为37±0.5℃，转桨转速为100r/min，每次取样量2ml立即用0.45μm微孔滤膜滤过，并在30s内完成补液(2ml)。
(1)溶液的制备
对照品溶液：精密称定葛根素对照品10mg，加入30％甲醇配制成0.1mg/ml的对照品溶液；
供试品溶液：称定实施例12制备的朝药片剂1.5g，加入500ml蒸馏水(脱气处理)待完全溶解，用0.45μm微孔滤膜滤过，既得。
(2)色谱条件
色谱柱：thermoods-2hypersil(4.6mm*250mm，5μm)；流动相为甲醇-水(25:75)；检测波长250nm；流速1.0ml/min；柱温30℃；进样量10μl。
(3)线性关系考察
精密量取葛根素对照品溶液0.1ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml、8.0ml对照品溶液于10ml容量瓶中，加30％乙醇定容，摇匀。以对照品溶液浓度为横坐标(μg/ml)，峰面积为纵坐标(a)，绘制标准曲线。
得线性回归方程：y＝700143x-208777,r＝0.9998(n＝12)。
结果表明，葛根素在1.02μg/ml～102μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
(4)加样回收率考察
精密量取供试品溶液1ml，共6份，分别精密加入适量对照品，按照(3)的方法测定峰面积，计算回收率，结果表明，本法平均回收率为99.37，rsd为0.68％，小于2％，表明本发明方法准确可行。
(5)溶出曲线
采用(3)的方法对实施例12制备得到的朝药片剂不同时刻溶出度进行测定，绘制累计溶出度曲线，如图6所示。由图6可以看出，溶出15min时累计溶出度为97％，符合要求。
5、含量测定
(1)总黄酮含量的测定
采用实施例12所示的方法制备多次朝药片剂，利用实施例4所示的紫外分光光度法进行总黄酮测定，结果如表12所示。
表12不同批次葛芩固肾片中总黄酮的含量测定
(2)总多糖含量的测定
对上述(1)中测定的朝药片剂批次进行总多糖含量的测定，结果如表13所示。
表13不同批次葛芩固肾片中总多糖的含量测定
(3)总皂苷含量的测定
对上述(1)中测定的朝药片剂批次进行总皂苷含量的测定，结果如表14所示。
表14不同批次葛芩固肾片中总皂苷的含量测定
(4)黄芩苷含量的测定
对上述(1)中测定的朝药片剂批次进行黄芩苷含量的测定，结果如表15所示。所述黄芩苷含量的测定方法参照《朝医方“千金文武汤”片剂的制备及初步药效学研究》(杨贺然.朝医方“千金文武汤”片剂的制备及初步药效学研究：[d].延吉：延边大学，2016.)进行。
表15不同批次葛芩固肾片中黄芩苷的含量测定
(5)葛根素含量的测定
对上述(1)中测定的朝药片剂批次进行黄芩苷含量的测定，结果如表16所示。所述葛根素含量的测定方法参照溶出度试验中的葛根素含量测定方法进行。
表16不同批次葛芩固肾片中葛根素的含量测定
小结：
本发明提供的朝药片剂为黄棕色普通片剂，光滑无麻点，平均片重0.5±0.025g；片剂硬度均在50±3n范围内；制备的葛芩固肾片15min时，累计溶出度达97％；采用紫外分光光度法和hplc法对片剂中总黄酮、总多糖、总皂苷含量进行测定，3批样品平均含总黄酮5.34mg·g-1、总多糖0.77mg·g-1、总皂苷0.83mg·g-1，其中含有黄芩苷0.434mg·g-1、葛根素3.25mg·g-1；片剂测定各项指标均符合2015版《中国药典》规定。
实施例16
本次试验对于本发明提供的朝药片剂的药效进行验证。
1、试验材料
(1)实验动物：雄性spf级健康wistar大鼠，繁育方式为封闭群，体重180～200g，50只，提供单位：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，质量检测单位为吉林省实验动物质量检测中心，序号：201700019170。
于动物实验室给予普通饲料，室温蒸馏水，自由饮食饮水，适应性喂养1晚。动物实验室温湿度为：25±1℃，50～70％rh。
(2)试验对象：按照实施例12所示方法制备的朝药片剂(批号：20171105)，其中有效组分含量为总黄酮5.42mg·g-1、总多糖0.788mg·g-1、总皂苷0.84mg·g-1，黄芩苷0.434mg·g-1、葛根素3.23mg·g-1
2、dkd大鼠模型的建立和分组
a、溶液配制：柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液：精确称量柠檬酸2.10g于100ml蒸馏水配成a液，精确称量柠檬酸钠2.94g于100ml蒸馏水配成b液。将a、b溶液按照比例1:1混合，测量ph值为4.5(ph＝4.5～5.0为宜)，4℃冷藏保存。
stz于-20℃保存，以柠檬酸-柠檬酸三钠溶液作为溶剂，配制成质量体积分数2％的stz溶液，使用时现用现配，避光冰浴保存，并于30min内注射完毕。
b、模型制备
按照大鼠体重随机挑选10只作为空白对照组。其余40只进行dkd模型制备，在注射前禁食(不禁水)12h。禁食完成后按照55mg·kg-1剂量一次性快速腹腔注射stz溶液，其余10只空白对照组注射等量柠檬酸-柠檬酸三钠溶液。
所有大鼠均于同一环境分笼饲养，自由饮食(普通饲料)、饮水，同时观察饮食量、饮水量、精神状态、尿量变化，腹腔注射72h后测量大鼠尾静脉血糖值，以随机血糖值≥16.7mmol·l-1且尿糖连续3d测定为“+++”的大鼠视为dm造模成功。
成模后继续喂养12晚，期间每周测量dm大鼠体重2次，每周测血糖1次，每天更换垫料并定期清理鼠笼以保持清洁，观察并记录体重、血糖、饮水量、尿量、体型体貌、毛色变化、眼球变化。dm模型成功后6w、8w、10w用尿微量白蛋白试剂盒测定大鼠24h尿微量白蛋白(大鼠禁食24h不禁水，用24h代谢笼收集尿液)测定含量≥30mmol·l-1时即为早期dkd大鼠模型造模成功。
造模成功后，在模型成功大鼠中随机挑选12只设立模型对照组(m组)，随机挑选8只设立20倍量给药组(mdh组)，随机挑选8只设立10倍量给药组(mdl组)，分笼饲养。
3、给药方式
以人体口服日剂量的大鼠等效剂量10倍、20倍为实验的两个剂量组进行灌胃给药，每日1次，连续灌胃30d，两个剂量组的给药量分别为2.42g·kg-1(mdl组)、4.84g·kg-1(mdh组)，以蒸馏水为溶剂稀释待给药的药物进行灌胃。空白对照组以同等体积蒸馏水灌胃。
4、动物模型检测指标及其方法
(1)分别取各试验大鼠的尿液样品和血清样品(眼球取血)，处死大鼠后取大鼠肾脏样本。
(2)生化指标的检测：
取大鼠的尿液和血清样本，以24h尿微量白蛋白试剂盒、n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)试剂盒、血清视黄醇结合蛋白(rbp)试剂盒、血清同型半胱氨酸(hcy)试剂盒、尿素氮(bun)试剂盒、尿蛋白定量试剂盒测定指标含量。
5、检测结果
实验数据使用sigmaplot进行数据分析及柱状图分析。
(1)实验鼠一般状态分析
通过30d给药观察发现，空白对照组(b组)大鼠饮食、饮水、大小便正常，体毛依然有光泽，后脑皆有粉红色条带状毛发出现，体格健壮，活泼好动，体重随时间的增加而增加。模型组(m组)大鼠饮食、饮水量为正常对照组两倍左右，身体消瘦、精神不振，体毛失去光泽干枯并减少。10倍量给药组(mdl)给药10d开始，10倍量给药组(mdl)和20倍量给药组(mdh)饮水量逐渐减少，mdl组大鼠的血糖值从240±5ml减少至给药30d时的150±5ml。毛色逐渐恢复光泽，精神状态稳定，体重平稳上升。
(2)对大鼠体质量的影响
观察实验大鼠在给药后的0d、10d、20d、30d各组体重指标。结果如表17和图7所示。在图7中，与b组比较，*p＜0.05，与m组比较△p＜0.05.
结果表明，0d(给药0d)时，除空白组(b)外各组间大鼠体重无显著性差异(p＞0.05)。分别观察到在10d、20d、30d，模型对照组(m)体重相对10倍量给药组(mdl)、20倍量给药组(mdh)组持续降低。mdl、mdh组体重随给药时间逐渐增加，差异有显著性(p＜0.05)。
表17给药后各组大鼠体重值
(3)对大鼠血糖的影响
观察大鼠在给药后的0d、10d、20d、30d各组大鼠血糖指标。结果如表18和图8所示。在图8中，与b组比较，*p＜0.01，与m组比较△p＜0.05。
表18给药后各组大鼠血糖值
结果表明，给药0d时，除空白组各组间大鼠血糖值无显著性差异。在给药后，随给药时间增加mdh组较m组血糖值有所下降，mdl组大鼠血糖值略有上升或较平稳不变，差异有统计学意义(p＜0.05)。
(4)对大鼠肾重的影响
实验大鼠段颈处死后，取出左肾并称重，计算肾重比＝左肾重(g)/体重(g)，去除包膜，生理盐水清洗残留血液，吸水纸吸干，装入冻存管放入液氮，此过程保证在一分钟内完成，转移-80℃冰箱保存。
结果如表19和图9所示，给药30d时，mdl组、mdh组、m组与b组比较肾重比皆有所增加，但mdl组与mdh组较m组肾重比降低，差异皆有统计学意义(p＜0.01)。而mdl组肾重比例较mdh组有所降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。(注：图9中，与b组比较，mdh组、mdl组、m组皆有极显著性差异p＜0.01。mdl组、mdh组与m组比较有极显著性差异p＜0.01。mdh组与mdl组比较有显著性差异p＜0.05。)
表19大鼠肾重值
(5)对大鼠24h尿微量白蛋白含量的影响
不同组大鼠的24h尿微量白蛋白(malb)含量如表20和图10所示。图10中，m组与mdl组相比有显著性差异，p＜0.05。m组与mdh组相比，有极显著性差异，p＜0.01。m组与b组比较有极显著性差异p＜0.01。
表20各组大鼠-尿微量白蛋白含量
结果表明，给药30d后m组和mdl组尿微量白蛋白含量皆高于30μg·ml-1，mdl组较m组尿微量白蛋白含量较低，差异有统计学意义(p＜0.05)，mdh组尿微量白蛋白含量略低于30μg·ml-1，且较m组含量低，差异有统计学意义(p＜0.01)。mdl组与mdh组相比有差异，但无显著性表达。
(6)对大鼠n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)含量的影响
结果见表21和图11，在图11中，与m组比较，mdl组、mdh组p＜0.05，差异有统计学意义。mdl组与mdh组比较p＜0.05，差异有统计学意义。
结果表明，灌胃给药30d后mdl和mdh组较m组nag含量有所降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。mdh组与mdl组比较nag含量有所增加，差异有统计学意义(p＜0.05)。
表21大鼠-n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)含量
(7)对大鼠视黄醇结合蛋白(rbp)含量的影响
结果见表22和图12。在图12中，与m组比较，mdl组、mdh组p＜0.05，差异有统计学意义。m组、mdl组、mdh组与b组比较皆有显著性差异p＜0.05。
结果表明，给药30d后mdl和mdh组较m组rbp含量有所降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。mdh组与mdl组比较rbp含量有所降低，但差异无统计学意义。
表22各组大鼠rbp含量
(8)对大鼠尿素氮(bun)含量的影响
检测结果见表23和图13，在图13中，与m组比较，mdl组、mdh组p＜0.05，差异有统计学意义。m组与b组比较p＜0.01。
结果表明，给药30d后mdl和mdh组较m组bun含量有所降低，差异有统计学意义(p＜0.01)。mdh组与mdl组比较rbp含量有所增加，但差异无统计学意义。m与b组比较有极显著性差异(p＜0.01)。
表23各组大鼠bun含量
(9)对大鼠同型半胱氨酸(hcy)含量的影响
检测结果见表24和图14，在图14中，m组与mdl组、mdh组相比有极显著性差异，p＜0.01。m组与b组比较有极显著性差异p＜0.01。
结果表明，给药30d后mdl组和mdh组较m组hcy含量有所降低，差异有统计学意义(p＜0.05)，m组与b组比较有极显著性差异(p＜0.01)，mdl组与mdh组比较hcy含量略有降低，但差异无显著性。
表24各组大鼠hcy含量
(10)对大鼠尿蛋白定量的影响
检测结果见表25和图15，在图15中，m组与mdl组、mdh组相比有极显著性差异，p＜0.01。m组与b组比较有极显著性差异p＜0.01。
表25各组大鼠尿蛋白定量
结果表明，给药30d后mdl和mdh组较m组尿蛋白定量值有所降低，差异具有极显著性(p＜0.01)，mdl组较mdh组尿蛋白定量值有所减少，但差异无显著性表达。
5、结论
本发明选用wistar大鼠作为实验模型动物，以stz作为诱导，72h后一型糖尿病模型成模，正常饲料喂养12周后利用尿微量白蛋白试剂盒测定微量白蛋白含量，结果表明模型鼠尿微量白蛋白≥30μg·l-1达到预期效果，证明早期dkd模型制备成功。
经过30d灌胃给药，治疗组(mdl组、mdh组)大鼠一般指标包括体重、血糖、饮水量、排尿量，相对模型组病程有所改善，其中体质量、血糖值有统计学意义。生化指标(尿微量白蛋白、nag、rbp、hcy、bun、尿蛋白定量)结果表明，治疗组相对模型对照组指标含量有所降低，数据结果皆有统计学意义(p＜0.05)。
上述结果分析表明，本发明制备的朝药片剂对dkd大鼠具有降低血糖、增加体质量，减少患病鼠白蛋白、nag、bun含量的药效作用，可用于治疗dkd。
本发明中对各组大鼠肾重比进行了详细的测定，结果证实模型组大鼠(m)相对空白对照组(b)肾重比较大，肾脏肥大且水肿。本发明为证实大鼠患病情况，于造模后第10晚对大鼠尿液nag含量和尿微量白蛋白进行测定，此时数据皆无显著性差异，但随机挑选样本进行解剖发现模型组大鼠肾脏较肥大，血糖值高，且体质量明显降低，分析此时大鼠处于dkd二期。第12晚对大鼠尿液进行第二次测定，结果表明模型组大鼠相对空白对照组尿微量白蛋白、nag含量值较高，nag一般分布在肾近曲小管内，含量升高证实模型鼠肾小管发生病变，早期dkd大鼠模型成立，病程进展至dkd第三期。
本发明设立两个药物浓度(mdl、mdh)对dkd大鼠进行灌胃给药，30d后测定尿微量白蛋白、bun、nag、rbp、hcy、尿蛋白定量六项生化指标和一般性指标。实验表明经过给药m组大鼠各项含量均高于空白对照组，同样高于给药组，给药组指标含量只略高于空白对照组，说明以本发明所述朝药提取物为有效成分的朝药片剂对dkd大鼠有明显的治疗或减缓dkd病程进展的作用，其中mdl组在各项指标表现均高于mdh组。
从一般指标来看，给药组大鼠在给药初期皮表毛色暗淡或脱发，神情紧张或呆滞，给药后有所减缓，这一表达从hcy含量值有所体现，hcy上升会导致吡哆醇(b6)或钴胺素(b12)的减少，而吡哆醇的缺乏会导致动物体脱发；钴胺素(b12)的缺乏会导致动物体烦躁不安，反应迟钝。而给药组大鼠毛色开始有所正常，且精神状态较模型组良好。
结论：
经过30d灌胃给药，治疗组(mdl组、mdh组)大鼠一般指标包括体重、血糖、饮水量、排尿量，相对模型组有改善，其中体质量、血糖值有统计学意义(p＜0.05)。生化指标(尿微量白蛋白、nag、rbp、hcy、bun、尿蛋白定量)结果表明，治疗组相对模型对照组指标含量有所降低，数据结果皆有统计学意义(p＜0.05)。结果表明，葛芩固肾片对dkd大鼠具有降低血糖、增加体质量，减少患病鼠白蛋白、nag、bun、rbp、尿蛋白定量、hcy含量的药效作用，可用于治疗dkd。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。