一种可静脉注射的溶瘤病毒制剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种可静脉注射的溶瘤病毒疫苗的制备方法。

背景技术：

溶瘤病毒疗法是一种治疗癌症的理想治疗方法，利用病毒能够选择性的在肿瘤细胞复制扩增的特性，溶瘤病毒疫苗在多项临床前和临床试验中都取得了良好的治疗效果。最近，美国fda批准了安进公司的溶瘤病毒疫苗(t-vec)用于皮肤和淋巴结黑色素瘤病变的治疗。此外，几项人体临床试验报告中也报道了在局部癌症基因治疗中使用溶瘤病毒的情况。然而，当溶瘤病毒直接进入机体的血液循环系统时，会引起机体固有的抗病毒免疫和先天免疫反应，以及溶瘤病毒容易在组织器官发生非特异性隔离等因素，使得传统溶瘤病毒疫苗无法通过静脉注射的方式进入机体，这对癌症病毒疗法的发展构成了重大的障碍。因此，迫切需要发展全新的溶瘤病毒递送系统来解决上述问题。

技术实现要素：

本发明的主要目的，在于提供一种可静脉注射的溶瘤病毒复合体的制备方法，其包括如下步骤：将靶向肿瘤细胞的多肽基因转染真核细胞，并将该多肽基因对应的靶向多肽展示到真核细胞的细胞膜上，获得稳定表达靶向多肽的基因工程改造细胞株；然后利用该细胞株提取尺寸均一的纳米级细胞膜囊泡，再将溶瘤病毒装载到该纳米级细胞膜囊泡里，得到可静脉注射的溶瘤病毒复合体。

优选地，多肽基因包括pres1、gpc3、ha、vegf、pd-1/pd-l1、trail中的至少一种。

优选地，多肽基因转染真核细胞的方法包括电转法、脂质体转染法、pei转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染方法中的至少一种。

优选地，溶瘤病毒的种类包括溶瘤腺病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、麻疹病毒、新城病毒、脊髓灰质炎病毒、细小病毒、呼肠病毒、逆转录病毒中的至少一种。

优选地，将溶瘤病毒装载进细胞膜囊泡的方法包括脂质体挤压法、电转法、超声法、冻融法、皂化法中的至少一种。

优选地，真核细胞，包括mdck细胞、vero细胞、s2细胞、昆虫细胞、胚胎干细胞、患者自体分离培养的细胞中的至少一种。

优选地，所述的静脉注射的溶瘤病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)通过基因转染的方法，将靶向多肽基因转入真核细胞中，并通过靶向多肽基因中的信号肽将靶向多肽表达到细胞质膜上；

2)转染24h后，使用500～550μg/ml的g418，对转染的真核细胞进行筛选，每3～5天更换一次筛选培养基；筛选，至有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大；

3)挑取克隆团簇的细胞，胰酶消化后，将细胞通过有限稀释法接种到细胞培养皿中，加入200～250μg/ml的g418对细胞维持筛选；

4)待单克隆细胞增大后，将其扩大培养，并重复步骤(3)的有限稀释法进一步筛选稳定表达细胞株，经过多代的筛选获得能够稳定表达靶向多肽的细胞株；

5)取稳转细胞株进行扩大培养，挑选生长对数期的细胞，pbs洗涤3～5次之后，加入含有pmsf蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液，充分浸润细胞；

6)将细胞收集起来，充分震荡细胞使其均匀分散，将细胞悬液置于1-5℃下旋转混悬，使细胞充分破裂形成大量细胞膜囊泡；

7)细胞混悬液在500～800×g下离心5～15min，将上清转移到新的离心管中，5000～8000×g下离心5～15min，最后将上清移到新的离心管，50000～80000×g下离心50～70min，移除上清，细胞膜沉淀用400～600ul缓冲液重悬，获得细胞膜囊泡，-80℃保存备用；

8)将溶瘤病毒与细胞膜囊泡混合均匀，混合液用脂质体挤压器在400nm孔径的薄膜下来回挤压不少于15回合，进而将400nm孔径薄膜换成200nm孔径薄膜，继续来回挤压不少于15回合，直至将溶瘤病毒颗粒装载进细胞膜囊泡的空腔里，形成尺寸均一的细胞膜囊泡包裹溶瘤病毒，-80℃保存备用；

优选地，步骤8)中，溶瘤病毒与细胞膜囊泡混合比例为体积比1：0.1～10。

本发明的再一目的，在于提供一种溶瘤病毒制剂，其包括可静脉注射的溶瘤病毒复合体，所述的溶瘤病毒复合体根据前述的制备方法制成。

本发明的再一目的，在于提供该溶瘤病毒制剂，在作为实体瘤的治疗剂的用途。

本发明的有益效果：

本发明提出了一种新型的溶瘤病毒疫苗递送系统，本发明通过基因工程手段将靶向多肽修饰到细胞质膜上，再以稳定表达靶向多肽的细胞株提取细胞膜囊泡作为溶瘤病毒的递送载体。并成功将溶瘤病毒装载进细胞膜囊泡的空腔内，形成尺寸均一的细胞膜囊泡溶瘤病毒复合体。传统溶瘤病毒装载在细胞膜囊泡里可以有效抵抗机体针对溶瘤病毒的抗病毒免疫反应和中和抗体的中和作用，延长溶瘤病毒在血液循环系统的循环时间，并通过靶向多肽使溶瘤病毒能够在肿瘤部位实现富集，提高病毒疗法的治疗效果。

1.提供了一种新型溶瘤病毒递送系统，传统溶瘤病毒颗粒包装在细胞膜囊泡里，有效降低机体固有的抗病毒免疫反应和中和抗体的中和作用，保护溶瘤病毒不被机体免疫系统清除；

2.细胞膜囊泡是生物来源，免疫原性极低，能够携带溶瘤病毒在机体血液循环系统里长效循环；

3.基因工程改造的细胞膜囊泡具有靶向性，能够携带溶瘤病毒在肿瘤部位高效富集，降低溶瘤病毒的全身性副作用；

4.新型溶瘤病毒疫苗可以进行静脉注射的方式给药，克服了传统溶瘤病毒只能通过局部注射给药方式的不足，具有良好的普适性；

5.新型溶瘤病毒疫苗可以与其他癌症治疗方法(如免疫检查点pd-1/pd-l1抑制剂)进行联合使用，有巨大的应用前景。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1：基因工程改造的细胞膜囊泡(a)、溶瘤病毒颗粒(b)和细胞膜囊泡包裹的溶瘤病毒颗粒的大小和形貌(c),tem；

图2：体外细胞活性实验检测细胞膜囊泡包裹的溶瘤病毒颗粒对多种肿瘤细胞系的杀伤作用；

图3：体外竞争抑制试验检测细胞膜包裹溶瘤病毒帮助溶瘤病毒抵抗中和抗体的中和作用；

图4：荷瘤裸鼠荧光成像检测细胞膜包裹溶瘤病毒颗粒帮助溶瘤病毒有效富集到肿瘤部位；

图5：用小鼠原位肝癌模型检测细胞膜囊泡包裹溶瘤病毒体内抗肿瘤生长效果；

具体实施方式

制备例：以下合成步骤中的所使用的试剂均为市售商品。

靶向多肽乙肝病毒衣壳前s1蛋白(pres1)修饰的细胞膜囊泡包裹的溶瘤腺病毒疫苗制备方法，包括以下步骤：

1.靶向多肽pres1修饰的细胞膜囊泡的制备：

1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的hepg2细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为每毫升5x10⁵个细胞，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染，转染前将细胞培养基更换为无血清培养基；

2)把稀释好的含有pres1基因的真核表达质粒与商业化转染试剂lipofectamine2000(赛默飞)以质量/体积比2:1的比例进行混合，室温静置20分钟，将上述混合物逐滴加入到hepg2细胞培养基中，轻轻混匀，细胞置于37℃,5％co2的细胞培养箱中培养；

3)转染24h后，使用500μg/ml的g418(geneticin,遗传霉素)，对转染的真核细胞进行筛选，每3～5天更换一次筛选培养基。筛选2周后可获得有抗性的克隆出现，停药培养，待克隆逐渐增大；

4)小心挑取克隆团处的细胞，胰酶消化后，将细胞通过有限稀释法接种到96孔细胞培养皿中，加入250μg/ml的g418对细胞维持筛选；

5)待96孔板的单克隆细胞增大后，将其扩大培养，并重复步骤(3)的有限稀释法进一步筛选稳定表达细胞株，经过5代的筛选获得能够稳定表达靶向多肽pres1的细胞株hepg2-pres1；

6)取稳转细胞株hepg2-pres1进行扩大培养，挑选生长对数期的细胞，pbs洗涤3～5次之后，加入适量的含有pmsf(苯甲基磺酰氟)蛋白酶抑制剂的10mmtris和mg2+低渗缓冲液，充分浸润细胞；

7)将细胞收集起来，充分震荡细胞使其均匀分散，将细胞悬液置于4℃下旋转混悬24h，使细胞充分破裂形成大量细胞膜囊泡；

8)细胞混悬液在700×g下离心10min，将上清转移到新的离心管中，7000×g下离心10min，最后将上清移到新的离心管，70000×g下离心60min，移除上清，细胞膜沉淀用400～600ul磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)重悬，获得细胞膜囊泡，-80℃保存备用；

2.溶瘤腺病毒的制备：

1)pdc315-htertp-3e-e1a腺病毒质粒构建：a、将端粒酶启动子(htertp)替换admaxtm重组腺病毒系统中穿梭质粒pdc315中的启动子cmv，构建出pdc315-htertp-3e质粒；b、以腺病毒e1acdna片段为模板，在引物中引入ecori、bamhi酶切位点，pcr扩增e1a；c、将质粒pdc315-htertp-3eecori+bamhi回收大片段与e1a基因片段进行连接，，构建出穿梭质粒pdc315-htertp-3e-e1a；

2)将穿梭质粒pdc315-htertp-3e-e1a和骨架质粒pbghfrtδe1,3flp以质量比1:2的比例共转染hek293细胞；

3)转染后，每2天换一次培养基，连续观察细胞状态；

4)转染1周后，可看到细胞空斑出现，待细胞病变至快几乎从培养皿脱落时，收集细胞和培养基上清；

5)按照腺病毒纯化试剂盒vivapureadenopack20rt提供的操作步骤对溶瘤腺病毒进行纯化，纯化后的溶瘤腺病毒于-80℃保存备用；

3.将溶瘤腺病毒(约1×10¹¹pfu)与细胞膜囊泡等体积混合均匀，混合液用脂质体挤压器在400nm孔径的薄膜下来回挤压不少于15回合，进而将400nm孔径薄膜换成200nm孔径薄膜，继续来回挤压不少于15回合，直至将溶瘤腺病毒颗粒装载进细胞膜囊泡的空腔里，形成尺寸均一的细胞膜囊泡包裹溶瘤腺病毒，-80℃保存备用。

二、实施例：

1.细胞膜囊泡包裹的溶瘤腺病毒病毒颗粒形态学表征：

应用透射电镜(tem)对基因工程改造的细胞膜囊泡、溶瘤病毒颗粒和细胞膜囊泡包裹的溶瘤病毒颗粒的大小和形貌分别进行表征。如图1所示，空的细胞膜囊泡粒径在100～200nm范围(a)，裸露的溶瘤腺病毒颗粒粒径在70～90nm左右(b)，而细胞膜包裹溶瘤腺病毒后整体粒径范围有所扩大，在100～500nm左右(c)。

2.细胞膜囊泡包裹的溶瘤病毒颗粒体外对肿瘤细胞杀伤能力的评价：

为了验证细胞膜包裹的溶瘤病毒颗粒体外对肿瘤细胞的杀伤能力，将溶瘤腺病毒以moi＝2的浓度加入到正常肝细胞lo2，肝癌细胞(hepg2、huh7和hepa1-6)中，分别在感染24h、48h和72h时，用mtt法检测细胞的活性。如图2所示，结果表明制备的新型溶瘤病毒颗粒对正常肝细胞几乎没有影响，而肝癌细胞(hepg2、huh7和hepa1-6)在感染24h后细胞活性开始下降，说明溶瘤病毒在肝癌细胞里开始复制扩增并导致细胞裂解死亡。在感染72h后癌细胞的活性下降到50％左右。结果表明，本发明制备的新型溶瘤病毒疫苗对正常细胞几乎没有杀伤效果，而对癌细胞表现出良好的杀伤能力。

3.细胞膜包裹溶瘤腺病毒帮助溶瘤病毒抵抗中和抗体中和作用能力的评价：

为了评价溶瘤病毒被细胞膜包裹之后抵抗中和抗体中和作用的能力，先将溶瘤腺病毒对小鼠进行三次免疫(每周免疫一次，每次1×10⁸pfu，连续免疫三周)，采集小鼠血液，分离获得溶瘤腺病毒的中和抗体血清。用细胞培养基(dmem)对抗血清(nab)连续对倍稀释，将不同稀释度的抗血清分别加入细胞中，然后用1×10⁴pfu的细胞膜囊泡包裹的带有绿色荧光蛋白gfp基因的腺病毒感染不同稀释度抗血清的细胞，裸露的腺病毒(带有gfp基因)作为对照，8h后，荧光显微镜下观察细胞的感染情况。如图3所示，细胞膜囊泡包裹的腺病毒在抗血清很高(稀释度为1:2)的情况下，仍能够保持一定的感染能力，而对照组在抗血清稀释度为1:32的情况下就几乎没有了感染能力。结果很好的说明了细胞膜囊泡包裹腺病毒后，能有效地帮助腺病毒抵抗中和抗体的中和作用。

4.细胞膜包裹溶瘤病毒颗粒体内靶向递送效果的评价：

为了评价细胞膜包裹溶瘤病毒的体内靶向递送效果，将1×10⁵表达靶向蛋白pres1的受体的hepg2细胞接种在裸鼠上，待肿瘤长到一定大小，将pres1修饰的细胞膜囊泡包裹的腺病毒ad5-gfp尾静脉注射到上述裸鼠体内，每次注射1×10⁸pfu，隔天注射一针，共注射3针，裸露的ad5-gfp为对照组。第三针结束后的第二天，对所有裸鼠进行荧光成像，如图4所示，pres1修饰的细胞膜囊泡包裹的腺病毒ad5-gfp能有效的在肿瘤部位富集，而裸露的腺病毒ad5-gfp很快被机体代谢掉。

5.细胞膜囊泡包裹溶瘤病毒体内抗肿瘤生长效果的评价：

将1×10⁵带有luciferase报告基团的肝癌细胞hepa1-6原位接种到c57小鼠的肝脏部位，接种肝癌细胞后的第三天，分别给小鼠尾静脉注射细胞膜包裹溶瘤腺病毒(1×10⁸pfu)、裸露溶瘤腺病毒(1×10⁸pfu)、空的细胞膜囊泡(1×10⁸)和生理盐水(100μ)，隔天注射一次，共注射4次，分别在第4、6、8、10和14天对相应小鼠进行活体荧光成像。如图5所示，本发明制备的细胞膜囊泡包裹的溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤细胞的生长，在第14天的时候肿瘤细胞基本消失；裸露溶瘤腺病毒组、空细胞膜囊泡组和pbs组的小鼠，体内的肿瘤越来越大，抑制肿瘤生长效果较差。