一种miRNA抑制剂在制备抗结核菌药物中的应用的制作方法

本发明属于药学技术领域，特别涉及一种mirna抑制剂在制备抗结核菌药物中的应用，还涉及一种抗结核菌药物。

背景技术：

众所周知，结核病可以在全身的任何一个部位发病，但最常发病于肺，即被称为肺结核。肺外结核病(即在肺以外的器官发生的结核病)可能与肺结核共同存在。结核病一般的临床体征与症状包括发热、发冷、盗汗、食欲不振、体重减轻以及疲倦。

开放性结核病最常见于肺部(占约90％的病例)，即肺结核。肺结核的症状可包含胸痛和长时间带痰咳嗽，而约有25％的人可能不会表现任何症状。偶尔，患者可能表现为小量的咳血、咳嗽，在极为罕见的病例中，感染可能侵蚀到肺动脉和雷斯莫森氏动脉瘤，从而导致大量出血。肺结核可能演变成慢性疾病，并导致上肺叶产生大疤痕；上肺叶比下肺叶更易受到肺结核的影响，但这个差别的原因目前还未明；可能的解释为上肺叶的空气流通较佳，或其淋巴引流能力较差。

结核杆菌(即结核分枝杆菌(mtb))是主要引起结核病的致病原，结核杆菌的生长速度与其它细菌相比非常缓慢，细胞每16至20小时才分裂一次，而其它细菌一般则不到半小时即分裂一次。结核杆菌还有一个特殊的双层脂质外膜。细胞壁富含脂质是分枝杆菌属特有的临床特征，使用一般的革兰氏染色鉴定，会出现不明显的阳性反应或无法被染上色的现象，原因就是其细胞壁中富含脂质以及霉菌酸(分枝菌酸，一种脂肪酸)。结核杆菌可以抵抗弱消毒剂并且可以用内生孢子的方式存活数星期。在自然界，结核杆菌只能生长于宿主个体的细胞中，但在实验室中可在试管内培养。因此，医检师可利用组织染色法处理痰液检体，便可用显微镜鉴别出结核杆菌。

研究表明，结核分枝杆菌复合群(mtbc)包括其它四种可引起结核病的分枝杆菌属的细菌：牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌及田鼠分枝杆菌。其中，非洲分枝杆菌分布不广，但却是导致非洲结核病感染的重要因素。牛分枝杆菌曾是导致结核病感染的常见因素，但因巴式消毒法在牛奶生产中的使用，在发达国家已几乎不再出现牛分枝杆菌导致结核病感染的病例。卡式分枝杆菌较为罕见，且似乎仅出现于非洲之角(东北非洲)，但也有少数几例病例出现于非洲裔移民中。田鼠分枝杆菌也较为罕见，且几乎仅出现于免疫不全人群，但其盛行率可能被严重低估。

microrna(即mirna)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的微小rna，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirna也可以调节同一个基因。mirna可与靶基因3′utr非编码区结合，通过阻止mrna翻译和/或通过促进mrna降解降低靶蛋白的表达水平(参见文献bartel,d.p.micrornas:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.cell.116,281-297(2004)和xie,x.etal.systematicdiscoveryofregulatorymotifsinhumanpromotersand3'utrsbycomparisonofseveralmammals.nature.434,338-345(2005))。最近的研究表明mirnas在mtb逃避自噬清除过程中起关键作用(kim,j.k.,kim,t.s.,basu,j.&jo,e.k.micrornaininnateimmunityandautophagyduringmycobacterialinfection.cellmicrobiol.19(2017))。研究表明，mtb上调mir-33，抑制巨噬细胞中atg5、atg12、lamp1、lc3b、ampk和foxo3等关键自噬效应分子抑制自噬(ouimet,m.etal.mycobacteriumtuberculosisinducesthemir-33locustoreprogramautophagyandhostlipidmetabolism.nat.immunol.17,677–686(2016))。此外，kumar等人报道了mtb下调mir-17的表达，以增强其靶蛋白mcl1，进而与beclin-1相互作用抑制自噬(kumar,r.etal.microrna17-5pregulatesautophagyinmycobacteriumtuberculosis-infectedmacrophagesbytargetingmcl-1andstat3.cell.microbiol.18,679–691(2016))。在mtb感染的巨噬细胞中上调mirna-125a靶向紫外辐射抵抗相关基因(uvrag)以预防自噬(kim,j.k.etal.microrna-125ainhibitsautophagyactivationandantimicrobialresponsesduringmycobacterialinfection.j.immunol.194,5355–5365(2015))。最近，kim等人还发现mtb诱导mir-144*靶向dram2(dna损伤调控自噬调制器2)，从而抑制自噬(kim,j.k.etal.mir144*inhibitsantimicrobialresponsesagainstmycobacteriumtuberculosisinhumanmonocytesandmacrophagesbytargetingtheautophagyproteindram2.autophagy.13,423-441(2017))。

技术实现要素：

本发明的目的是提供mir-27aantagomir的一种新用途，以用于治疗以肺结核为代表的结核病。

本发明的发明人在研究和筛选抗结核菌药物的过程中，意外地发现mir-27aantagomir能够对结核分枝杆菌(mtb)产生明显的抑制作用。

具体地，本发明第一方面提供了一种mirna抑制剂在制备抗结核菌药物中的应用，所述mirna抑制剂的核苷酸序列如seqidno.1所示：

5’-gcggaacuuagccacugucaa-3’。

同时，本发明第二方面提供了一种抗结核菌药物，其包含mir-27aantagomir和一种或多种药学上可接受的载体；其中，所述mir-27aantagomir的核苷酸序列如seqidno.1所示。并且，所述抗结核菌药物特别适用于治疗肺结核。

值得说明的是，本文所述的药学上可接受的载体应当与本发明所述抗结核菌药物中的rna相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的药效。

在本发明的一个优选实施方式中，所述药学上可接受的载体为体内转染试剂。

在本发明的一个进一步优选的实施方式中，所述体内转染试剂选自以下任一种：mpeg-pcl-ppeea(聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯)，聚乙烯亚胺，脂质体，血清运铁蛋白。

在本发明的一个优选实施方式中，所述药学上可接受的载体为生理盐水；例如，磷酸盐缓冲生理盐水。

在本发明的一个优选实施方式中，所述药学上可接受的载体选自以下任一种或多种：填充剂，粘合剂，增溶剂，崩解剂，助流剂，着色剂，调味剂和抗氧化剂。

此外，本发明所述的抗结核菌药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者的性别、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定给药剂量。本文所述的剂型可以是口服液、注射剂、舌下含服剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、贴剂、喷雾剂等。

发明人通过一系列实验证实，mir-27aantagomir能够降低结核菌感染巨噬细胞后的胞内存活。并且，相关动物实验结果表明，mir-27aantagomir能够有效减轻肺部的病理损伤，且能够明显降低肺内结核菌的荷菌量。

综上所述，本发明提供了mir-27aantagomir这种mirna抑制剂在制备抗结核菌药物中的新用途，显然，mir-27aantagomir能有效抑制结核菌的感染，有利于为结核病的治疗提供有效的药物支持，从而具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为结核菌感染分别经nc、mir-27a-m、mir-27a-i处理后的巨噬细胞的胞内cfu图和细菌存活率图；

图2为对小鼠肺部切片实施苏木精——伊红染色(hematoxylin-eosinstaining，h&e)的结果图；

图3为结核菌感染小鼠1、7、28天后的肺部荷菌量的统计图；

图4为结核菌感染小鼠后的肺部抗酸染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

实施例1

将c57bl/6小鼠腹腔原代巨噬细胞以1*10⁵个/孔接种于48孔细胞培养板中，约2h待细胞贴壁后，移去完全培养基1640，然后加入新鲜的完全培养基培养过夜。第二天，在转染前换上新鲜的含双抗和10％血清的1640，在细胞中分别转染nc，mir-27a-m(mimic：模拟剂)以及mir-27a-i(inhibitor：抑制剂)。其中，mir-27a-i的核苷酸序列如seqidno.2所示：

5’-ugcucacaagcagcuaagcccu-3’。

接着，将细胞置于培养箱中培养48h后，以moi＝5的剂量感染结核菌(h37rv)。感染2-3h后，弃去上清，用含有阿米卡星的培养基培养细胞2h，再弃去上清并换上不含双抗而含有10％血清的1640继续于37℃，5％co2培养箱中培养细胞24h。然后，弃去上清，并用pbs洗涤细胞，再用含有1％triton-100的pbs裂解细胞，取细胞裂解液涂于含有两性霉素b的middlebook7h10琼脂培养板上，置于37℃培养箱内培养2-3周，最后进行菌落计数。

计数结果如图1所示，实验结果表明，mir-27a能够促进结核菌感染巨噬细胞后的胞内存活，反之，mir-27a-i(inhibitor)能够降低结核菌感染巨噬细胞后的胞内存活。

实施例2

将c57bl/6小鼠分为两组，将mir-27a^-/-小鼠(即mir-27a敲除小鼠)分为两组，每组6只，分别气溶胶感染结核菌(h37rv)，剂量为200cfu/只小鼠，感染2周后，腹腔注射给药mir-27aantagomir和ncantagomir(nc指阴性对照)。药物制备方法：将mir-27aantagomir和ncantagomir与体内转染试剂进行预处理；首先将50nmolmir-27aantagomir或ncantagomir溶于375μl高压灭菌的ddh2o中，然后与375μl无菌10％葡萄糖溶液混合，作为a液；然后，将375μl无菌10％葡萄糖溶液与375μlentranstertm-体内转染试剂混合，作为b液；最后，将a液和b液(1:1)混合，得到工作溶液。发明人用300μl工作液(约10nmolmir-27aantagomir/ncantagomir)/只小鼠腹腔注射给药，并按每周两次的频率连续给药1个月。脱颈椎处死小鼠，取出肺脏中的一叶，用4％多聚甲醛固定，石蜡切片后，实施h&e染色，观察肺部病理损伤情况。

实验结果如图2所示，可见，给予mir-27aantagomir药物处理的小鼠肺部病理损伤明显减轻；因此，本实施例的实验结果表明，mir-27aantagomir能够有效减轻小鼠肺部的病理损伤。

实施例3

将实施例2中感染后给药1个月的小鼠肺组织取其三分之一，并用1ml含1％triton-100的pbs研磨处理，梯度稀释，分别取10^-3、10^-4的组织混悬液100ml均匀涂布于含有两性霉素b的middlebook7h10琼脂培养板上，然后置于37℃培养箱中培养2-3周，进行菌落计数，结果如图3所示。

本实施例的实验结果表明，mir-27aantagomir显著降低了小鼠肺内结核菌的荷菌量。

实施例4

将实施例2中感染后给药1个月的小鼠肺组织石蜡切片后，实施抗酸染色，主要包括以下步骤：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗；3％盐酸酒精脱色30秒～1分钟；用水冲洗；用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。

本实施例的实验结果如图4所示。

值得说明的是，实施例3中通过平板菌落计数反映了肺内荷菌量的总体数量趋势。本实施例的实验结果显示了细菌在肺内的具体位置及数量，从而能更进一步通过肉眼观察到结核菌在肺内数量的减少，所以，实施例4的实验结果更进一步佐证实施例3反映的数值的正确性；据此可得出结论：mir-27aantagomir处理过的小鼠的肺内结核菌的量显著减少。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海市肺科医院

<120>一种mirna抑制剂在制备抗结核菌药物中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcggaacuuagccacugucaa21

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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