用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法与流程

本发明属于仿生化纳米制剂技术领域，涉及一种低毒仿生化纳米系统，具体涉及用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法，该纳米系统用于递送核酸类药物。

背景技术：

现有技术公开了胰腺癌作为一种消化道恶性肿瘤，致死率高，患者的五年生存率不足6％且预后极差。由于胰腺癌早期诊断困难和病程发展快，手术切除率低，术后五年生存率很低。临床实践中，化疗是胰腺癌治疗的重要环节，吉西他滨是一线化疗用药，但是作为一种核苷类似物，已有报道其具有很高的肾毒性；此外，folfirinox治疗方案(奥沙利铂+伊立替康+5-氟尿嘧啶)虽能提高患者响应，但具有更大的毒副作用，所以目前胰腺癌的化学治疗需要探索新思路。

近年有研究发现，约80％的胰腺癌存在kras信号突变的现象，肿瘤通过这种突变改变摄取营养的方式，即特异性刺激大胞饮机制的过度激活，从而介导摄取大量胞外蛋白类营养物质至胞内降解为氨基酸，维持肿瘤细胞增殖的需要；但kras信号属于非成药性的靶点，故选用核酸类药物如dna和rna具有巨大的治疗潜能；dna在递送过程中易降解并在胞质中转运困难，另外其无法进入细胞核而使转运效率降低；而具有沉默疾病相关基因作用的sirna在胞质中发挥作用，因此与dna相比，sirna具有更高的应用价值；然而，sirna本身不稳定且在血浆中易代谢，

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟基于仿生学原理设计提供一种高密度脂蛋白纳米递释系统，具体涉及用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法，以使所递送的药物能够高效低毒地发挥抗肿瘤作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种高密度脂蛋白纳米递释系统，具体涉及用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法，所述纳米系统以磷酸钙作为内核包载核酸类药物，通过疏水结合的途径在外层包裹脂质体并自组装全段的人重组蛋白，构建低毒的高密度脂蛋白仿生化纳米系统(sir-cap-hdl)，靶向递送药物于肿瘤部位，并使sirna药物充分释放以提高药效。

具体的，本发明的用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统，利用反相微乳法将sirna包载于磷酸钙内核，通过薄膜水化法将磷脂包裹于内核外层形成脂质体，再与apoe3自组装形成均一稳定的仿生化纳米系统(sir-cap-hdl)，所采用的磷酸钙构建纳米粒内核，包载核酸类药物sirna具有较高的稳定性和包载效率；该纳米系统具有提高靶向肿瘤部位的效果。

本发明中，采用的模型药物为针对胰腺癌细胞kras^g12d突变的核酸类药物sirna，磷酸钙内核包载sirna，具体序列为5’-guuggagcugauggcguagtt-3’，通过静电吸附作用与磷酸钙内核的钙相结合；当载药颗粒递送到细胞之后，磷酸钙内核由于溶酶体的酸性环境解离出钙离子，导致溶酶体肿胀而破裂，所载的sirna从溶酶体中逃逸至细胞胞浆，具有强烈的基因沉默效应。

本发明纳米系统中高效包载核酸类药物，例如dna,rna，寡聚核苷酸cpgodn等，其作为一种新型的基因载体，被证实具有良好的生物安全性。

本发明所采用的脂质材料为dopa和dmpc，dopa是一种两亲性磷脂，与载药的磷酸钙内核的钙离子络合作为内层磷脂；dmpc通过薄膜水化法以疏水建与dopa结合形成脂质双分子层；所得到的脂质体为核心含磷酸钙纳米粒的脂质体；所采用的载脂蛋白是全段的人重组apoe3蛋白，其与dmpc形成的脂质体自组装构建的仿生化纳米载药系统(cap-hdl)可以很好的模拟体内高密度脂蛋白在结构和功能上的特性，由于粒径较小(约30nm)，大部分可规避mps的吞噬从而在体循环中长时间保持稳定，系统本身安全性好，并且与单纯的脂质体相比可以被肿瘤细胞更多地摄取，从而更高效的递送药物以实现杀伤肿瘤细胞的效果。本发明的实施例中，内层磷脂选用与多价离子具有很强络合能力的两亲性磷脂1,2-油酰磷脂酸(dopa)，其磷酸极性头部在油水界面与磷酸钙纳米粒的钙离子络合，疏水性尾部分布在油相，在纳米粒表面形成一层疏水层以稳定纳米粒；外层磷脂选用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)；载脂蛋白选用全段的人重组apoe3蛋白，其与dmpc形成的脂质体自组装形成的高密度脂蛋白仿生结构能很好地模拟体内高密度脂蛋白的结构和功能特性，粒径较小、均一稳定，毒性较小，且在体内循环时间较长，生物相容性良好，所述apoe3与肿瘤细胞高表达的ldlr和lrp1结合，介导纳米系统转运至细胞内。

本发明中，所述纳米系统是一种核壳结构的仿生纳米粒子，由磷酸钙构成的内核载药，脂质双分子层与载脂蛋白自组装作为外壳。

本发明所构建的仿生化纳米载药系统，自组装的apoe3蛋白能够与胰腺癌肿瘤细胞表面高表达的ldlr和lrp1结合，靶向递送于肿瘤部位，并基于大胞饮途径被高效摄取进细胞内，形成大胞饮体在胞内转运，最后与溶酶体融合，载体的apoe3蛋白和脂质成分被溶酶体酶降解，磷酸钙颗粒由于溶酶体的酸性环境而解离，释放出大量钙离子改变溶酶体的渗透压，从而使溶酶体肿胀破裂，所载药物发生溶酶体逃逸，释放至胞浆发挥基因沉默效应。

本发明所采用的纳米粒构建方法具体如下：①以反相微乳法制备包载sirna的磷酸钙内核，反相微乳是由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚的环己烷油相溶液中制备得到，随后用内层磷脂dopa修饰，分散于氯仿中备用；②薄膜水化法制备外层，即将预先制备的磷酸钙内核、脂质膜材料共同成膜，水化之后加入apoe3恒温摇床孵育，得到自组装的基于磷酸钙内核的高密度脂蛋白仿生化纳米粒。

本发明所采用的人源胰腺癌细胞panc-1为kras^g12d突变细胞，bxpc-3为kras^wt细胞，均为本领域所认可且可市售获得。kras突变是胰腺癌进程中非常重要的因素之一，有文献证实kras信号通路突变会诱导肿瘤细胞膜褶皱形成大且不规则的大胞饮体，从而转运胞外蛋白等营养物质至胞内降解为氨基酸，为肿瘤细胞提供营养。

本发明通过流式细胞术和免疫组化实验证明载体系统生物安全性良好；细胞特异性摄取实验和体外药效学实验证明，该药物递送系统能通过大胞饮途径被癌细胞大量摄取，释放sirna发挥基因沉默作用；体内药效学实验证明，该药物递送系统能特异地靶向肿瘤部位，增加药物在肿瘤部位的蓄积和渗透，实现抗肿瘤的效果。与临床一线药物吉西他滨相比，本递药系统的抗肿瘤疗效更好且没有明显的脏器毒性。

本发明基于仿生学原理设计高密度脂蛋白纳米递释系统，其内核为载有sirna药物的磷酸钙，外层包裹自组装apoe3的脂质体结构。基于仿生学原理构建的高密度脂蛋白纳米粒可以规避单核吞噬系统(mononuclearphagocytesystem,mps)从而在体循环中长时间保持稳定；而纳米系统自组装的载脂蛋白apoe3能够与胰腺癌肿瘤细胞表面高表达的ldlr和lrp1结合，并基于大胞饮途径被高效摄取进细胞内，形成大胞饮体在胞内转运，最后与溶酶体融合并破裂，释放出sirna至胞浆发挥基因沉默作用。与传统化疗药物相比，基于磷酸钙内核的高密度脂蛋白仿生化纳米粒安全性好，细胞水平上显示该载药体统的细胞毒性较小；在动物水平上，多次给药载药纳米粒后荷瘤裸鼠肾脏中没有出现明显的肾小球肿胀，说明其与吉西他滨相比毒副作用小，且生存期优于吉西他滨，能够高效低毒地发挥抗肿瘤作用，具有较高的临床应用前景及转化价值。

附图说明

图1.仿生化纳米递释系统的表征，其中，

(a)sir-cap-hdl模式图，

(b)cap-hdl与cap-lnc的粒径分布，

(c)cap-hdl与cap-lnc的透射电镜图。标尺：50nm。

图2.胰腺癌细胞对仿生化纳米递释系统的摄取及摄取机制，其中，

(a)panc-1细胞对cap-lnc和cap-hdl的摄取定性及定量结果，标尺：200μm，

(b)panc-1细胞和bxpc-3细胞摄取cap-hdl后，cap-hdl与大胞饮标记物右旋糖酐(dextran)的共定位结果，标尺：10μm，

(c)不同胞吞途径抑制剂对panc-1细胞摄取cap-hdl的影响结果，

(d)panc-1细胞对cap-lnc和cap-hdl的摄取透射电镜图，大胞饮体由红色箭头标出。

图3.仿生化纳米递释系统的体外药效学评价，其中，

(a)仿生化纳米递释系统能促进载药sirna的溶酶体逃逸，标尺：10μm，

(b)panc-1与bxpc-3细胞给药后的细胞流式凋亡结果，

(c)panc-1与bxpc-3细胞给药后的cck-8结果，

(d)panc-1细胞给药后kras蛋白表达定性与定量结果。

图4.仿生化纳米递释系统的体内分布及药效学评价，其中，

(a)cap-lnc和cap-hdl在荷瘤小鼠肿瘤及主要器官中的分布。

图5.仿生化纳米递释系统的体内药效学评价，其中，

(a)给药期间荷瘤裸鼠的体重变化曲线，

(b)多次给药后荷瘤裸鼠的生存期情况，

(c)苏木精-伊红染色(he染色)评价药物的体内安全性，裸鼠肾脏中的肾小球用箭头标出。标尺：200μm。

具体实施方式

实施例1

按说明书所述的方法制备低毒仿生化纳米系统，将14ml环己烷与6ml壬基酚聚氧乙烯醚搅拌均匀作为油相，100μg/mlsirna溶于300μl2.5m的cacl2溶液，搅拌加入油相中作为钙相，12.5mmnah2po4溶液搅拌加入油相中作为磷相。两相分散均匀后钙相加到磷相中搅拌5min，随后加入dopa反应1h。上述体系加入无水乙醇破乳30min，离心弃上清以洗去油相，离心参数为12500g,20min,4℃。同样条件再用无水乙醇洗沉淀两次，得到白色固体挥干10-20min，分散于氯仿中保存。随后用薄膜水化法制备脂质体，取500μlcap-氯仿溶液加入1mgdmpc和2ml氯仿，在旋转蒸发仪上40℃旋蒸1h，加入2ml三蒸水水化完全。得到的脂质体在用100w功率探头超声6min后7000rpm离心7min，加入200ugapoe3，置于摇床上100rpm,37℃孵育即可形成载sirna的低毒仿生化纳米系统，称为sir-cap-hdl。其中不加apoe3的脂质体称为sir-cap-lnc，不载药的含和不含apoe3的脂质体分别为cap-hdl和cap-lnc，载乱序sirna的含apoe3的脂质体称为nc-cap-hdl，均为对照组。载荧光探针的纳米粒是将荧光探针加入dmpc及磷酸钙纳米粒一起旋蒸，其他步骤同前；

结果显示：图1a是本低毒仿生化纳米系统的构建模式图；图1b是cap-hdl与cap-lnc的粒径分布，cap-hdl和cap-lnc粒径分别为28.21nm±1.53nm和24.36nm±2.86nm，cap-hdl的多分散系数更小，且cap-hdl比cap-lnc的平均粒径大5nm左右，表明apoe3已成功组装，图1c为cap-hdl与cap-lnc的透射电镜图，由图中可以看出cap-hdl为规则的球形且均匀分布，结构与天然成熟的球形hdl相似，对照组cap-lnc呈现不规则球形，大小不均一且会发生聚集，两者相比cap-hdl具有更高的分散度和均一性。

实施例2

为证明自组装的apoe3蛋白对细胞摄取仿生化纳米粒的重要性，选用kras^g12d突变的panc-1细胞考察其对cap-hdl及cap-lnc的摄取情况。仿生化纳米粒用细胞膜红色荧光探针(dii)进行荧光标记。panc-1细胞种96孔板24h后，吸出培养基，按预先设好的浓度梯度表加纳米粒，细胞摄取2h后吸出纳米粒，经过磷酸盐缓冲液(pbs)清洗、4％多聚甲醛固定15min和细胞核染料(hoechst试剂)避光染核8min后，高内涵分析系统考察细胞摄取的定性和定量结果。另将panc-1细胞培养于培养瓶中，加入dmpc为25μg/ml的cap-hdl或cap-lnc，3h后透射电镜拍摄摄取情况；

为证明kras突变细胞通过大胞饮机制摄取仿生纳米系统cap-hdl，选用带异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(fitc-dextran)作为大胞饮通路标记物，panc-1和kras^wt的bxpc-3细胞分别种培养皿24h，配制含1.3mg/mlfitc-dextran的dmem培养基，从中取1ml与50μlcap-hdl-dii(dmpc浓度为25μg/ml)混合均匀，加入共聚焦小皿中，放进培养箱2h后固定染核，激光共聚焦观察两种细胞的摄取情况以及纳米粒与右旋糖酐的共定位情况。另将panc-1细胞种96孔板孵育24h，加纳米粒之前先在每孔加入90μl各胞吞途径抑制剂孵育30min，再加110μl含cap-hdl-dii的培养基(dmpc浓度为25μg/ml)，共孵育3h后弃培养基，分别经过pbs清洗、4％多聚甲醛固定15min和hoechst试剂避光染核8min后，高内涵分析细胞摄取的定量结果；

结果显示：图2a是panc-1细胞对cap-lnc和cap-hdl的摄取定性及定量结果，可看出cap-hdl处理组panc-1细胞内荧光强度明显高于对照组cap-lnc，且随着给药浓度的增加，细胞摄取cap-hdl呈浓度依赖性增加，但在dmpc浓度为50μg/ml时摄取有所下降，说明组装apoe3能在一定范围内(0-25μg/ml)促进细胞大量摄取纳米粒，超出范围则会由于受体竞争性抑制而影响摄取效率；图2b显示了共聚焦实验，与bxpc-3细胞相比，panc-1摄取cap-hdl更多且cap-hdl与大胞饮标记物dextran共定位明显，说明kras突变的胰腺癌细胞可诱导形成大胞饮体，介导大部分cap-hdl纳米粒的内吞；图2c显示了摄取抑制实验结果，表明除了能量抑制组合脱氧葡萄糖和叠氮钠(nan3+dog)之外，大胞饮通路抑制剂eipa和阿米洛利对细胞摄取cap-hdl的抑制最强，大约能够抑制60％的摄取；而微管解聚剂秋水仙素(colchicine)，细胞骨架相关抑制那可达唑(nocodazole)和具有高尔基体破坏作用的抑制剂brefeldina对摄取均有不同程度的抑制效果，说明细胞通过大胞饮途径摄取cap-hdl纳米粒，摄取过程需要能量和细胞骨架的参与，胞内转运需要高尔基体的参与；而图2d透射电镜从超微结构证明了大胞饮体的存在，被panc-1细胞摄取的cap-hdl在细胞内形成大小不一的大胞饮体进行转运，与对照组cap-lnc相比，cap-hdl在被摄取后在胞内形成的大胞饮体更多；上述结果均表明，kras突变的胰腺癌细胞通过大胞饮机制摄取cap-hdl纳米粒。

实施例3

为证明低毒仿生化纳米系统递送sirna可促进其发生溶酶体逃逸，进而发挥基因沉默的作用，在制备纳米粒时选用带羟基荧光素fam标记的sirna(fam-sirna)，并用dii标记脂质体。panc-1细胞种于共聚焦皿中孵育24h，随后每皿直接加入50μlfam-sir-cap-hdl-dii(dmpc浓度为25μg/ml)放进培养箱孵育2h。配制溶酶体红色荧光探针(lyso-trackerred)稀释液，每皿各加1ml再孵育0.5h，取出，固定染核，激光共聚焦观察共定位情况。另外，用流式细胞术和cck-8试剂盒以考察各载药纳米粒的细胞毒性。流式细胞术具体是两种细胞种6孔板培养24h后，分别给与各对照组和实验组制剂，继续培养24h后收集细胞，用annexinv-fitc/pi试剂盒评价细胞凋亡情况，cck-8实验是两种细胞给药培养24h后，按试剂盒说明操作，最后用酶标仪测定紫外吸收，计算细胞存活率。此外，panc-1细胞给含25μg/mldmpc的各载药纳米粒及15ug/ml的吉西他滨孵育24h，提总蛋白进行westernblot实验，考察kras蛋白的表达情况；

结果显示：图3a表明，2h时cap-hdl与溶酶体共定位而sirna已有一部分与溶酶体不共定位，说明部分cap-hdl载体中蛋白和脂质成分已由于溶酶体酶的作用降解，磷酸钙内核因溶酶体的酸性环境而解离，使溶酶体因渗透压增大而溶胀破裂，所载sirna发生溶酶体逃逸释放至胞浆。本递送系统可以避免sirna被酶降解，使其更高效地发挥基因沉默效应。图3b细胞凋亡实验和图3c细胞毒实验证明，与对照组相比，sirna-cap-hdl对panc-1细胞的杀伤作用显著凋亡细胞占总细胞数的66％，而阴性对照基因序列和未组装apoe3的纳米粒杀伤作用与未处理组相近，均在15％左右，说明载体的细胞毒性较小，安全性好。panc-1细胞比bxpc-3细胞对纳米递送系统的响应更明显，给不同处理后bxpc-3细胞的凋亡细胞数占比在12％到17％之间，说明了kras突变对于纳米粒的摄取和sirna发挥基因沉默效应的重要性。图3d免疫印迹实验结果表明，与各对照组相比，sir-cap-hdl给药后panc-1细胞中kras蛋白的表达下调了75％，说明本递释系统能很好地释放sirna，发挥基因沉默作用。

实施例4

原位胰腺癌动物模型的建立：取对数生长期的panc-1细胞，用胰酶消化后离心，pbs清洗细胞两次后计数，将细胞的浓度调整为1×10⁶cells/ml，置于冰盒备用。150μl5％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，医用胶带固定四肢，用碘酒涂腹部皮肤，用眼科剪于裸鼠的左下腹脾脏附近剪开2-3cm的切口，翻至皮肤外，脾脏下即为胰脏。用移液枪重悬冰上的细胞，取50μl从胰脏尾端朝右前方向进针，可观察到胰腺明显充盈呈半透明状，慢慢移出针头，用蘸有生理盐水的棉签把胰脏、脾脏推回体内。在伤口处滴适量的抗生素，用生物可降解的缝合线先逐针缝合里面的肌肉层，再逐针缝合外层的皮肤，所有操作均在超净手术台中进行。接种后每天观察动物状态和伤口愈合情况，在接种后14天进行实验；

小动物活体成像实验中，纳米粒用细胞膜深红色荧光探针(dir)作荧光标记，所制备的纳米粒分别称为cap-lnc-dir和cap-hdl-dir。用截留分子量10kd的超滤离心管将两种纳米粒分别浓缩至dmpc为4mg/ml。荷瘤裸鼠随机分为两组，每组12只，按20mg/kgdmpc的剂量给药。在给制剂4h,8h,12h和24h后用5％水合氯醛麻醉并固定裸鼠，生理盐水灌流后取肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾，生理盐水冲洗后置于小动物活体成像仪采集图像；

结果显示：图4显示了给药后各时间点cap-hdl在肿瘤部位的荧光强度均高于对照组cap-lnc，且在8h后信号明显增强，在处理24h后仍然较强，说明cap-hdl仿生化纳米载体与cap-lnc相比更多地蓄积于肿瘤部位，并且有更长的体内循环时间。

实施例5

原位胰腺癌动物模型的建立方法同实施例4。荷瘤小鼠随机分为3组，每组12只，每两天分别尾静脉注射15mg/kg吉西他滨，含0.36mg/kgsirna的sir-cap-hdl和相同体积的pbs，共给药5次。给药周期结束后，每组其中6只进行心脏灌流，取出主要脏器进行石蜡切片和he染色，每组另外6只记录裸鼠体重的变化和生存期情况；

结果显示：图5a体重曲线结果表明，sir-cap-hdl在给药期间不会导致裸鼠体重下降，未见有化疗药吉西他滨的系统毒性；图5b各组荷瘤裸鼠的生存曲线显示，多次给药sir-cap-hdl后荷瘤裸鼠的中位生存期为46.5天，长于吉西他滨组的35.5天，说明本载药纳米粒比传统化疗药物吉西他滨的药效更好；图5c脏器he染色结果显示，与正常裸鼠相比，吉西他滨多次给药会导致荷瘤裸鼠肾小球肿胀(黑色箭头所示)，而给药sir-cap-hdl后肾小球的状态与正常裸鼠相近(黄色箭头所示)，其他脏器的切片也与正常裸鼠相似，说明本仿生纳米系统在治疗胰腺癌时没有明显脏器毒性。综上说明载药纳米粒sir-cap-hdl与吉西他滨相比具有更好的肿瘤抑制作用，且安全性较好，系统毒性较低。