本发明涉及一种抑制耐多药结核杆菌的联合用药物，属于医药领域。
背景技术：
连翘(forsythiasuspensa)为木犀科连翘属植物连翘干燥的果实，具有杀菌、清热解毒、镇吐、抗肝损伤等功效。《本草正义》中记载连翘能散结而泄化脉络之热，治瘘疬、痈肿疮疡、结热、蛊毒等功效。
结核病是严重危害人类健康的主要传染病之一，其至今已有超过4000年的历史。我国是世界上结核病负担最高的国家之一，也是耐多药结核病的高负担国家之一。进入二十一世纪以来，我国全面推行以控制传染源为核心的现代结核病控制策略。
为方便治疗耐多药结核病和广泛耐多药结核病，who将抗结核药物分为五组，利福平和异烟肼是初期治疗结核病的主要用药，但异烟肼具有较强的副作用，尤其在高浓度高剂量的时候，会造成肝脏功能损害，过敏，高热，癫痫和周围神经炎等，对机体的损伤较大；服用利福平会造成胃肠功能反应，过敏，血小板及白细胞减少，惊厥以及肝肾的损坏；利福平和异烟肼联用可以降低结核杆菌的耐药率，但由于利福平具有较强的肝药酶诱导作用，会加快异烟肼在肝内的乙酰化过程，从而加重药物的肝毒性。且随着耐药菌的逐渐发展，大部分结核分枝杆菌在耐利福平后会快速耐异烟肼，并加速多耐药结核分枝杆菌的数量增加，在使用一段时间后复合剂也逐渐不能满足治疗需求。寻找新的能够耐多药结核杆菌的新型药物成为防治耐多药结核病的关键。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种抑制耐多药结核杆菌的联合用药物，其特征是：它含有用于同时或者分别给药的连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平，以及药学上可接受的载体；
所述连翘乙酸乙酯部位按照如下的方法制备：
a、取连翘清水洗净、干燥、粉碎过筛；
b、称取连翘粉，加95％乙醇浸泡，回流提取，过滤，药渣同法提取两次，合并滤液，减压回收，冻干后得连翘冻干粉；
c、称取连翘冻干粉碾碎，加入乙酸乙酯，超声，加等体积蒸馏水，振摇萃取，静置，移出上层乙酸乙酯，下层液体加入等体积乙酸乙酯同法萃取，循环往复直至乙酸乙酯的分光光度计吸光值无变化，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，干燥，即为连翘乙酸乙酯部位。
进一步地，所述连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平的质量比为(1600～4000):(48～160):(250～480)。
更进一步地，所述连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平的质量比为1600:160:400或1600:64:480。
进一步地，步骤a所述干燥温度为60℃；所述过筛筛网为3号；
进一步地，步骤b所述连翘粉与95％乙醇的质量体积比为。1:10g/ml；所述浸泡时间为24h；所述回流提取温度为65℃，时间1h。
进一步地，步骤c所述连翘冻干粉与乙酸乙酯的质量体积比为1:20g/ml；所述超声时间20min；所述静置时间1-2h。
本发明还提供了一种连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平在制备抑制耐多药结核杆菌的联合用药物中的用途。
进一步地，所述连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平的质量比为(1600～4000):(48～160):(250～480)。
进一步地，所述连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平的质量比为1600:160:400或1600:64:480。
耐多药结核杆菌：是指至少耐异烟肼、利福平的结核杆菌。
在治疗耐多药结核病和广泛耐多药结核病时，本发明的连翘乙酸乙酯部位、异烟肼和利福平联合用药物可以明显降低异烟肼与利福平的用药量，显著增加协同抑制耐多药结核杆菌效果，从而降低异烟肼与利福平的毒副作用，增加患者的用药依从性，为临床提供了一种新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
具体实施方式
实施例1本发明连翘乙酸乙酯的制备
1、样品前处理
取连翘清水洗净后于干燥箱中60℃烘干，粉碎机粉碎药材后，过3号药典筛备用。
2、回流提取
称取500g连翘粉，倒入10000ml的圆底烧瓶中，然后向烧瓶中倒入5000ml的95％乙醇，浸泡24h，装好回流装置，65℃回流提取1h，倒出提取液，提取液用布氏漏斗过滤。然后向剩余的药渣中加入5000ml的95％乙醇，按上述方法再提取两次。合并三次滤液，于65℃减压回收冻干后得冻干粉。
准确称取连翘冻干粉30g，用碾砵碾碎后加入600ml乙酸乙酯，超声20min，将其转入3000ml的分液漏斗中，向分液漏斗中加入等体积的蒸馏水，剧烈摇晃分液漏斗使药物分散溶解，然后静置1-2h，用20ml移液管吸取上层乙酸乙酯，重复多次直至乙酸乙酯的分光光度计吸光值无变化，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩干燥即为连翘乙酸乙酯部位。
实施例2本发明抑制耐多药结核杆菌的联合用药物溶液的制备
1、药品母液制备
称取异烟肼1.6mg,加入1ml超纯水溶解后，用0.22μm滤膜过滤，此时异烟肼母液浓度为1.6mg/ml，按相同方法配置利福平和连翘乙酸乙酯部位，浓度分别为4mg/ml和2mg/ml的母液，配置好的药品母液过滤后分装于无菌ep管于-20℃保存备用。
2、联合用药物溶液制备
1)取前述药品母液恢复到室温；
2)分别吸取各100μm异烟肼和利福平母液混匀，再加入800μm连翘乙酸乙酯部位母液，混匀、用0.22μm滤膜过滤既得1ml联合用药物溶液，该药物溶液中含1600μg连翘乙酸乙酯部位、160μg异烟肼、400μg利福平，即联合用药物溶液中连翘乙酸乙酯部位、异烟肼、利福平的质量百分比为1600:160:400。
实施例3本发明抑制耐多药结核杆菌的联合用药物溶液的制备
1、药品母液制备
称取异烟肼1.28mg,加入1ml超纯水溶解后，用0.22μm滤膜过滤，此时异烟肼母液浓度为1.28mg/ml，按相同方法配置利福平和连翘乙酸乙酯部位，浓度分别为3.2mg/ml和2mg/ml的母液，配置好的药品母液过滤后分装于无菌ep管于-20℃保存备用。
2、联合用药物溶液制备
1)取前述药品母液恢复到室温；
2)分别吸取50μm异烟肼和150μm利福平母液混匀，再加入800μm连翘乙酸乙酯部位母液，混匀、用0.22μm滤膜过滤既得1ml联合用药物溶液，该药物溶液中含1600μg连翘乙酸乙酯部位、64μg异烟肼、480μg利福平，即联合用药物溶液中连翘乙酸乙酯部位、异烟肼、利福平的质量百分比为1600:64:480。
以下通过试验例说明本发明的有益效果。
一、实验材料
耐多药结核杆菌四川省疾病预防控制中心编号：20170723
二、主要仪器
见表1
表1主要实验仪器
三、主要试剂
连翘乙酸乙酯部位(f8)(制备方法同实施例1)
middlebrook7h9培养基(配方见表2)
oadc营养增强剂(配方见表3)
异烟肼(h)美国sigma公司
利福平(r)美国sigma公司
相关试剂(见表4)
表2middlebrook7h9培养基基础成分表
表3oadc增强剂成分表
表4相关试剂
四、7h9培养基溶液制备方法
按表2称量化学组分，与800ml超纯水混合，使各组分充分溶解后转移至1000ml容量瓶中定容至1000ml，将溶液分装到250ml的瓶中，121℃灭菌20-30min，然后放在4℃冰箱冷藏备用。
按表3称取营养增强剂组分，与800ml的生理盐水混合后，以6nnaoh(或1nhcl)调整溶液的ph值至6.5-6.8，然后将溶液转入1000ml容量瓶中，定容至1000ml，将溶液过0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌备用。
使用时，无菌操作下每90mlmiddlebrook7h9培养基溶液中加入10ml营养增强剂，即得7h9培养基溶液。
五、菌液制备方法
5.1麦氏比浊管(no.1mcfarland)配制
称取0.025gbacl2溶于装有9.912ml蒸馏水的中，然后向比浊管中缓慢加入98μl98％浓h2so4，混匀后观察是否有大颗粒沉淀，如有则需弃去重新配制。每次使用前需剧烈摇晃比浊管使其浊度一致。
5.2菌悬液制备
取一只灭菌的超声分散管，用无菌吸管吸取1-2ml灭菌生理盐水放入，用接种环挑选2-3周长势较好的新鲜菌约1/4环落置于磨菌管底部，盖上盖子后置于细菌超声分散计数仪上超声60s，根据仪器的要求加入需要加入的生理盐水调节菌悬液的od值，使其与标准比浊管浓度一致。此时菌液浓度约为3×108cfu。
5.3菌液的稀释
在无菌带有螺旋盖的试管中以无菌吸管加入2ml灭菌生理盐水，待菌液静置后用枪头吸取20μl的菌液加入，即菌液稀释为3×106cfu,同样方法再进行100倍稀释，即成3×104cfu，备用。
六、药板制备方法
①药板制备全程在生物安全柜中完成；
②取药液，按比例与7h9培养基溶液混合；
③取96孔细胞培养板，在细胞板的四周各孔加入200μl灭菌的蒸馏水，以防止在培养过程中培养基水分蒸发，培养基变干，从而导致实验结果有误，然后向剩下的其余孔中每个加入100μl7h9培养基溶液。
④取100μl步骤②的混合液加入第二行第二孔中，均匀混合后取出100μl加入第三孔，混匀，依次按照上述方法稀释。然后在第11孔设置不加药的培养基，每种药物溶液平行3次。同方法制作两个相同药板。
七、最低抑菌浓度(mic值)检测方法
取制备好的一块药板，在生物安全柜中，依次向每孔中加入100μl的菌液，然后将另一块有相同稀释浓度药液的板子作为对照版，不加菌液。将药板的盖子盖上后装入密封袋中，于37℃恒温培养箱中培养7d后，向孔中加入0.015％的刃天青溶液20μl和12μl的高压灭菌的10％的吐温-80溶液，用酶标仪测量其在od600的值，封盖再继续培养24h。由于微生物的呼吸作用，会使培养基中的刃天青发生反应而变色。用酶标仪检测显色24h-48h后的值和空白对照组的od600的变化，显色前的吸收值减去空白组的值与显色后的值减去空白组的值相比较，确定其最低抑菌浓度。
实验例1抑制耐多药结核杆菌效果对比
1药品母液准备
称取异烟肼(h)2mg，加入1ml超纯水溶解后，用0.22μm滤膜过滤，此时异烟肼母液浓度为2mg/ml，按相同方法配置利福平(r)和连翘乙酸乙酯部位(f8)，浓度分别为10mg/ml和100mg/ml，配置好的药品过滤后分装于无菌ep管于-20℃保存备用。
2药板准备
2.1异烟肼药板
按照“六”项下药板制备方法制备含异烟肼的药孔板，异烟肼药板中异烟肼的药物浓度设置为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml和0.39μg/ml。
2.2利福平药板
按照“六”项下药板制备方法制备含利福平药板的药孔板，利福平药板中利福平的药物浓度设置为500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.63μg/ml、7.81μg/ml、3.91μg/ml、和1.95μg/ml。
2.3连翘乙酸乙酯部位与利福平及异烟肼联合用药物药板
吸取同体积的异烟肼与利福平母液于同一ep管中，然后将连翘乙酸乙酯部位与利福平和异烟肼混合药液以2:8的比例混合，按照“六”项下药板制备方法步骤①、②完成操作，联合用药物药液的浓度为f8+(h+r)(1600+160+400)μg/ml，继续按照“六”项下药板制备方法的步骤③、④操作，完成制备含联合用药物的药孔板，联合用药物药板中f8+(h+r)浓度设置为：(800+80+200)μg/ml、(400+40+100)μg/ml、(200+20+50)μg/ml、(100+10+25)μg/ml、(50+5+12.5)μg/ml、(25+2.5+6.25)μg/ml、(12.5+1.25+3.13)μg/ml、(6.25+0.63+1.56)μg/ml和(3.13+0.32+0.78)μg/ml。
2.4抑菌效果对比试验
按照“五”项下菌液制备方法制备耐多药结核杆菌菌液，分别取异烟肼药板、利福平药板、连翘乙酸乙酯部位与利福平及异烟肼联合用药物药板，按照“七”项下试验方法测定抑菌效果，结果见表5、表6、表7。
表5异烟肼对耐多药结核杆菌的抑菌效果
注：显色前与显色后比，*p＜0.05,具有显著差异；**p＜0.01，具有极显著差异
表6利福平对耐多药菌的抑菌效果
注：显色前与显色后比，*p＜0.05,具有显著差异；**p＜0.01，具有极显著差异
表7联合用药物对耐药结核杆菌的抑制作用
注：显色前与显色后比，*p＜0.05,具有显著差异；**p＜0.01，具有极显著差异
分析表5可见：耐多药结核杆菌在异烟肼浓度0μg/ml、0.78μg/ml、3.13μg/ml和6.25μg/ml时，显色前与显色后的od值具有极显著差异(p＜0.01)，在1.56μg/ml和0.3μg/ml时显色前与显色后的od值具有显著差异(p＜0.05)，在12.5～100μg/ml时显色前后的od值无显著差异(p＞0.05)，表明最低抑菌浓度为6.25～12.5μg/ml。
分析表6可见：耐多药结核杆菌在利福平浓度0～31.25μg/ml时，显色前与显色后的od值具有极显著差异(p＜0.01)，在62.5～500μg/ml时，显色前与显色后的od值无显著差异(p＞0.05)，表明最低抑菌浓度为31.25～62.5μg/ml。
分析表7可见：耐多药结核杆菌在联合用药物中f8+(h+r)浓度为0～(3.13+0.32+0.78)μg/ml，时显色前与显色后的od值具有极显著差异(p＜0.01)，在(6.25+0.63+1.56)μg/ml和(12.5+1.25+3.13)μg/ml时显色前与显色后的od值具有显著差异(p＜0.05)，在(25+2.5+6.25)～(800+80+200)μg/ml时显色前后的od值无显著差异(p＞0.05)，表明最低抑菌浓度为(12.5+1.25+3.13)～(25+2.5+6.25)μg/ml。
分析结果显示：连翘乙酸乙酯部位(f8)与异烟肼(h)和利福平(r)以质量比1600:160:400联合用药时，可以使异烟肼最低抑菌浓度从6.25～12.5μg/ml降低到了1.25～2.5μg/ml，利福平最低抑菌浓度从31.25～62.5μg/ml降低到了3.13～6.25μg/ml。由此可见，在耐多药结核杆菌导致的肺结核治疗中，连翘乙酸乙酯部位(f8)与异烟肼(h)和利福平(r)按比例联合用药可极大的较少异烟肼及利福平的用量。