苍术酮在制备抗肝癌分子靶标药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及中药单体苍术酮（atractylon）的医药新用途，尤其涉及苍术酮在制备抗肝癌分子靶标药物中的应用。

背景技术：

原发性肝癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一，给世界各国人民健康带来极大危害。据2013年世界卫生组织统计，原发性肝癌引发的死亡人数是775517人，我国死亡人数占比超过50%，是原发性肝癌重灾区。

目前肝癌治疗尚无特效药，基本上采用综合治疗方案，例如使用靶向药物索拉非尼、化疗以及综合对症处理，以此控制肿瘤生长和转移，延长患者生存期。目前国内外都在积极开展相关研究，以期找到肝癌治疗的分子靶标，研发分子靶标药物。中药单体作为潜在药物靶标的研究是其中一个方向。

针对原发性肝癌的治疗，中医也有一定的方法，使患者减轻临床症状，延长生存期。但是目前尚未形成统一的辩证分型和治疗方法，且所用中药的作用机理更是模糊不清，这是中药治疗的一大缺陷，也是阻碍中药发展的一大原因。

苍术为菊科草本植物茅苍术atractylodeslancea(thunb.)dc.或北苍术atractylodeschinensis(dc.)koidz.的干燥块茎，是很多中药方剂的组成成分，具有抗病毒、抗炎、保肝和抗癌功效。

苍术酮是从苍术中提取的倍半萜主要成分。苍术酮分子式c15h20o，化学结构式见（i）。

关于苍术酮在肝癌领域的研究非常少，目前只有深圳大学（郭楠楠，2015）研究了苍术酮对肝癌细胞hepg2凋亡的影响，发现苍术酮能够抑制hepg2细胞生长。但是该研究稍显简单，且不够严谨，作用机制也没有得到深入研究，具体缺陷主要体现在以下两方面：第一，研究仅针对肝癌细胞hepg2。没有对其它肝癌细胞（例如mhcc97h，smcc7721等）进行研究，并不能证明在其它肝癌细胞上是必然有效的，所以结果具有一定的偶然性，说服力不强。第二，没有开展动物实验研究。本领域技术人员都知道，细胞实验的成功并不意味着动物实验必然成功，这是因为细胞系具有相对稳定和均一的理化环境，得到的是理想情况下的理论结果；而动物体就复杂得多，更能代表实际情况下的结果，因此具有更强的说服力。这也是为什么许多靶标药物在细胞上效果很好，却无法在动物上取得相同效果的原因。同理，细胞实验证明苍术酮能够抑制hepg2细胞生长，并不意味着苍术酮必然可以制成抗肝癌分子靶标药物，所以开展动物实验是十分必要的。

目前尚无苍术酮在抗肝癌方面的动物实验研究，也没有对苍术酮在抗肝癌分子靶标药物中应用的具体研究。

由于目前没有针对肝癌的特效药，因此通过基础研究找到新的潜在分子靶标药物十分有必要，中医药为寻找分子靶标药物提供了重要参考。

本发明通过严谨而全面的设计，系统地研究了苍术酮对肝癌增殖转移的作用以及剂量效应，从而确定了苍术酮的体内作用及其机制。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题，是提出苍术酮的新医药用途，即苍术酮在制备抗肝癌分子靶标药物中的应用。

本发明从苍术中提取分离得到足够量的苍术酮(结构式（i）)，通过药理实验，证实下述结构式（i）表示的苍术酮能够用于制备抗肝癌分子靶标药物。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供下述结构式(i)表示的苍术酮在制备抗肝癌分子靶标药物中的应用。

优选的，所述苍术酮具有抑制肝癌细胞侵袭转移的功能，所述抗肝癌分子靶标药物是具有抑制肝癌细胞侵袭转移功能的药物。

优选的，所述肝癌细胞是mhcc97h细胞和hepg2细胞。

更优选的，所述苍术酮抑制肝癌细胞侵袭转移的最佳有效剂量为20um。

优选的，所述苍术酮具有抑制裸鼠肝癌肿瘤生长的功能，所述抗肝癌分子靶标药物是具有抑制肝癌肿瘤生长功能的药物。

更优选的，所述苍术酮抑制裸鼠肝癌肿瘤生长的最佳有效剂量为10mg/kg。

优选的，所述苍术酮具有降低鼠瘤体内的抗肝癌分子标志物ki-67表达的功能，所述抗肝癌分子靶标药物是具有降低体内抗肝癌分子标志物ki-67表达功能的药物。

优选的，所述抗肝癌分子靶标药物含有药学上有效量的苍术酮以及药学上可接受的载体。

按本领域常用的制药工艺，所述药物可以被制成任何一种药学上可接受的剂型。优选的，所述任何一种药学上可接受的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等。

本研究发现，苍术酮处理的肝癌细胞（mhcc97h，hepg2，smcc7721）增殖和活力受到明显抑制，肝癌细胞（mhcc97h，hepg2）的凋亡水平显著提高，特别是本发明首次发现了苍术酮具有抑制肝癌细胞侵袭转移的新性质。分子指标检测显示凋亡相关蛋白（bcl-2，bax，cleavedcaspase-3）以及侵袭转移相关蛋白（mmp-2，mmp-9，timp-2）在苍术酮处理组均有显著变化，从分子层面解释了苍术酮促进细胞凋亡和抑制肝癌细胞侵袭转移的机理。

动物实验结果表明，苍术酮处理组的裸鼠瘤体显著小于对照组，瘤体体积和重量统计分析结果显示苍术酮处理组显著低于对照组，显示苍术酮具有抗肿瘤作用；ki67标志物免疫组化结果显示，苍术酮处理后裸鼠瘤体内的ki67表达降低，说明肿瘤增殖受到明显抑制；he染色结果显示，苍术酮对心，肝，肺，肾各器官无毒性，说明苍术酮具有良好的生物安全性。

与现有技术相比，苍术酮具有抑制肝癌细胞侵袭转移的性质和作用是本发明首次发现的，且在动物实验中也进一步证明了苍术酮具有抑制裸鼠肝癌肿瘤生长的功能，对裸鼠有显著的抗肿瘤作用，达到了本领域预料不到的技术效果，具备新颖性和创造性。

本发明从分子、细胞和动物水平综合结果证实了苍术酮对肝癌的良好抗肿瘤作用，而且苍术酮具有良好生物安全性，这些结果说明苍术酮在制备肝癌分子靶标药物的应用中具有广阔前景和极高应用价值。

附图说明

图1是本发明试验例1中苍术酮对肝癌细胞增殖的作用示意图。

图2是本发明试验例1中苍术酮对肝癌细胞克隆形成的作用示意图。

图3是本发明试验例2中苍术酮促进肝癌细胞凋亡的示意图。

图4是本发明试验例2中凋亡相关蛋白检测结果示意图。

图5是本发明试验例3中苍术酮对肝癌细胞侵袭转移的作用示意图。

图6是本发明试验例3中侵袭转移相关蛋白检测结果示意图。

图7是本发明试验例4中苍术酮对裸鼠瘤体抑制作用示意图。

图8是本发明试验例4中裸鼠瘤体体积和重量统计结果示意图。

图9是本发明试验例5中ki67标志物免疫组化结果示意图。

图10是本发明试验例5中裸鼠心肝肺肾he染色结果示意图。

具体实施方式

以下试验例和实施例中采用的试药、试剂、耗材、仪器、细胞及动物说明如下：

1.试药、试剂、耗材、仪器

苍术酮委托成都瑞芬思生物科技有限公司提取和纯化，纯度为96.72%。

超净工作台产自新加坡esco公司生产，co2培养箱产自美国thermoelectroncorporation公司，正置/倒置荧光显微镜产自日本olympus公司，流式细胞仪产自美国bd公司，低速自动平衡离心机产自湖南湘义离心机仪器有限公司。

dmem培养基购自上海索莱宝生物科技有限公司，青链霉素、胎牛血清、dmso、胰酶消化液均购自美国gibco公司。annexinv/pi染液、matrigel均购自美国bd公司。transwell小室购自美国millipore公司。mts购自东仁化学科技（上海）有限公司。

bcl-2，bax，cleavedcaspase-3，mmp-2，mmp-9，timp-2，ki67，gapdh抗体均购自美国abcam公司。

2.细胞、动物

肝癌细胞系mhcc97h，hepg2，smcc7721，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。裸鼠购自北京北京华阜康生物科技股份有限公司。

下面通过试验例以苍术酮的药理和活性实验及结果进一步说明本发明。

试验例1.苍术酮抑制肝癌细胞增殖与活力

1、实验分组：4组苍术酮浓度梯度处理，0、5、10、20um，其中0um为不加苍术酮的对照组，加入的是0.2%dmso。

2、细胞增殖实验（mtt法）

不同药物浓度处理的细胞消化接种于96孔板中，每孔培养液总体积100μl（3000cells）；置于37℃，co2培养箱中培养，待细胞贴壁，更换培养基，每孔加入混有10%mts检测试剂的培养液，37℃孵育1h，从培养箱取出室温平衡后在490nm处检测吸光度，分别检测24h，48h以及72h三个时间点细胞活力。绘制细胞生长曲线，统计分析。

3、克隆形成实验

（1）细胞接种

吸弃培养基，胰酶工作液分别收集细胞，以条件培养基洗2遍后，将细胞悬浮于条件培养基中，计数3次，取均值，调整细胞悬液浓度至1x103／ml。6孔培养板中加入4ml培养液，在c02培养箱中平衡后，每孔加入0.4ml细胞悬液(400个细胞)，终体积为3ml。接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使细胞尽量均匀分布。

（2）细胞培养

细胞在标准条件下培养2～3周，每3天更换条件培养基，观察克隆形成情况。

（3）克隆染色

当细胞形成肉眼可见的克隆(每个克隆细胞数在50-150个左右)时终止培养。弃去培养基，用pbs小心浸洗细胞2次后，加入多聚甲醛1ml／孔，固定10min后，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，每孔加入lml的结晶紫液染色30min，以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥。

（4）克隆计数

将培养板放置在凝胶成像系统，使用可见光条件，以随机所带软件计数克隆数目，扫描并保存图像。克隆形成率(％)=克隆数目／接种细胞数x100％。调整后的克隆形成率(％)=克隆形成率(％)／对照组克隆形成率(％)。

实验结果如图1和图2所示，说明：苍术酮处理对mhcc97h和hepg2细胞增殖和克隆形成抑制效果较好，20um剂量效果最佳。因此后续细胞实验均以此两株细胞为研究对象。

试验例2.苍术酮促进肝癌细胞凋亡

annexinv-fitc/pi 双染法，分组同上，细胞为mhcc97h和hepg2。

（1）悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1～5）×106/ml。

（2）500～1000r/min离心5min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min。用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min，500～1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次，加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测fitc荧光，另一波长大于560nm的滤器检测pi。

（3）westernblot检测凋亡相关蛋白（bcl-2，bax，cleavedcaspase-3），内参蛋白为gapdh。

结果如图3和图4所示，以上结果说明：苍术酮可以显著促进肝癌细胞凋亡，20um剂量效果最佳。

试验例3.苍术酮抑制肝癌细胞侵袭转移

分组同上，细胞为mhcc97h和hepg2。

取matrigel胶在冰上融化，用预冷的无血清培养基按1:6的比例稀释；取稀释好的matrigel胶100ul小心垂直加入到预冷的8um聚碳酯膜的transwell小室（要在冰上操作）；将铺好胶的24孔板放入37℃培养箱中孵育2h；胶凝固后加入细胞悬液100ul（密度为1×106/ml）进行后续实验；细胞培养24小时进行染色观察；随机选取6个视野计数，并统计结果。

westernblot检测侵袭转移相关蛋白（mmp-2，mmp-9，timp-2），内参蛋白为gapdh。

结果如图5和图6所示，以上结果说明：苍术酮可以显著抑制肝癌细胞侵袭转移，20um剂量效果最佳。

试验例4.苍术酮抑制裸鼠瘤体生长

细胞：hepg2，用于构建裸鼠皮下瘤

动物：裸鼠，6-8周龄，购自北京北京华阜康生物科技股份有限公司。

药物处理浓度梯度设置：0,5,10mg/kg，共三组。其中0mg/kg为不加苍术酮的对照组，加入的是0.2%dmso（二甲基亚砜）。

（1）选用6-8周龄的裸鼠(18g左右)，饲养在spf级别的环境中，适应环境5-7天，待体重达到20g左右后进行接种。

（2）扩大培养细胞，用胰酶消化，收集细胞。用不含血清和抗生素的培养基洗2-3次后计数。混悬均匀后放冰上待接种用。

（3）在各组裸鼠的左背侧皮下分别进行皮下接种，100μl细胞悬液(1×107个细胞/只)。

（4）接种后观察，待接种部位长出肿瘤(约50-100mm3)时随机分为3组(6只/组):对照组、5mg/kg组、10mg/kg组。

（5）分组当天（第0天）记录裸鼠肿瘤大小，连续3周。

（6）每天进观察裸鼠进食情况、活动规律、肿瘤大小及生存情况。每3天用游标卡尺测量一次肿瘤体积（见图7），根据计算得到的肿瘤体积平均值绘制肿瘤生长曲线（见图8）。

如图7-图8所示，以上研究结果说明：苍术酮处理裸鼠能够有效抑制肝癌瘤体生长，瘤体体积和重量均显著低于对照组，其中10mg/kg剂量组肿瘤抑制效果最佳。

试验例5.苍术酮病理和分子研究

（1）对完成试验例4的裸鼠进行断颈处死，取肿瘤组织进行拍照并称重；

（2）肿瘤组织做免疫组化，检测ki-67标志物的表达情况，结果见图9；

（3）取心，肝，肺，肾组织做he染色，进行器官毒性安全评价，结果见图10。

如图9、图10所示，以上结果说明：苍术酮处理后裸鼠瘤体内的ki67表达降低，从病理和分子层面说明了肿瘤增殖能力受到明显抑制（见图9）。心（heart），肝(lung)，肺（liver），肾（kidney）的he染色结果显示，苍术酮处理组与对照组无明显病理变化，说明对各器官无毒性，苍术酮具有良好的生物安全性(见图10)。

本研究发现，苍术酮处理组的裸鼠瘤体显著小于对照组，瘤体体积和重量统计分析结果显示苍术酮处理组显著低于对照组，显示苍术酮具有抗肿瘤作用；ki67标志物免疫组化结果显示，苍术酮处理后裸鼠瘤体内的ki67表达降低，说明肿瘤增殖受到明显抑制；he染色结果显示，苍术酮对心，肝，肺，肾各器官无毒性，说明苍术酮具有良好的生物安全性。

本研究从动物、病理、分子水平综合结果证实了苍术酮对肝癌的良好抗肿瘤作用，而且苍术酮具有良好生物安全性，这些结果说明苍术酮在制备肝癌分子靶标药物的应用中具有广阔前景和极高应用价值。

以下通过制备实施例进一步来进一步说明本发明

实施例1、苍术酮片剂的制备

成分每片用量

苍术酮50mg

糊精37.45mg

微晶纤维素10.5mg

淀粉17.5mg

乳糖10.5mg

硬脂酸镁1.05mg

按处方量将苍术酮(按实施例1方法制得)加入糊精、微晶纤维素、淀粉、乳糖混匀，制成颗粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得(每片含苍术酮0.05g)。成人推荐口服用量1-4片/次，每日2~3次。

实施例2、苍术酮胶囊的制备

成分每粒用量

苍术酮50mg

糊精37.45mg

微晶纤维素10.5mg

淀粉17.5mg

乳糖10.5mg

按处方量将苍术酮(按实施例1方法制得)糊精、微晶纤维素、淀粉、乳糖混匀，制成颗粒后，填装入0号硬胶囊壳，打光即制得(每粒胶囊含苍术酮0.05g)。成人推荐口服用量1-4粒/次，每日2~3次。