本发明属于生物化学技术领域，具体地，涉及一种glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽在制备治疗胆汁性肝硬化等疾病的预防和/或治疗药物中的应用。
背景技术：
肝硬化影响到全球数亿人的健康，肝硬化可进一步导致肝癌的发生。每年，肝硬化造成全世界120万人死亡，死亡率高于5种主要癌症，2015年全球因肝癌死亡人数高达81万(fitzmauricec,allenc,barberrm,etal.jamaoncol,2017,3:524-548.)。
肝纤维化是慢性肝病在修复过程中导致的病理状态,肝纤维化是肝硬化的早期阶段,肝硬化病程超过5年，约10％的患者将发展为肝癌(张文东等，药学学报，抗肝纤维化药物研发进展，2018,53(5):667-675)。肝纤维化是持续性肝损伤的必然结果,先天性异常、先天性代谢障碍、肝脏感染、炎症、化学物质和药物毒性、肝血流改变、肝内循环紊乱和胆汁流动阻塞等都可导致肝纤维化。其中，长期慢性胆汁淤积是引起肝纤维化的重要因素，胆酸及胆红素可引起肝细胞变性、坏死及肝纤维化，最终导致肝硬化，病理学上将这种疾病称为胆汁性肝硬化。已知原因的胆汁淤积性肝硬化称之为继发性胆汁性肝硬化(sbc)；未知原因的肝内胆汁淤积性肝硬化称之为原发性胆汁性肝硬化(pbc)，而肝脏纤维化程度能对肝硬化起到良好的预测作用(angulo,p.etal.gastroenterology,2015,149,389-397.e10.)。
当前，可通过胆总管结扎术(bileductligation,bdl)建立肝脏纤维化大鼠模型。bdl的基本原理是通过胆总管的结扎，形成人为的肝外胆道梗阻,从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、胆道内压力增高，并可引发肝内胆小管破裂，由于肝内血管受到扩张胆管的压迫及胆汁外渗,肝细胞会发生缺血和坏死,胶原组织大量沉积,纤维组织大量增生并向胆管伸展,包围肝小叶并散布于肝细胞周围,随着肝纤维化的加深,最终形成肝硬化(kimtw,leehk,songib.etal.platycodindattenuatesbileductligation-inducedhepaticinjuryandfibrosisinmice[j].foodchemtoxicol,2013,1(51):364.)。
目前，临床上有效的治疗原发性胆汁性肝硬化(pbc)的药物只有熊去氧胆酸(ursodeoxycholicacid,udca)和奥贝胆酸(obeticholicacid,oca)。udca作为治疗pbc的药物被广泛应用，然而有多达40％的pbc患者对udca治疗反应不良，而且这类患者的肝移植生存率明显低于udca治疗反应良好的患者。oca联合udca用于对udca反应不足的pbc成人患者，或作为单药疗法用于对udca不耐受的pbc成人患者。但是，奥贝胆酸(oca)的不良反应不容小觑，最常见的不良反应有瘙痒、低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低。文献报道，瘙痒的发生率达到30％-94％，且发生率有随着剂量增加而升高的趋势。甚至部分患者由于瘙痒严重而不得不中断服药(kowdleykv,jonesd,luketicv,etal.aninternationalstudyevaluatingthefarnesoidxreceptoragonistobeticholicacidasmonotherapyinpbc.j.hepatol,2011,54,13.)。
熊去氧胆酸(udca)已经上市20多年，且很多患者对其治疗反应不良。2016年获批上市的奥贝胆酸(oca)也是仅对部分患者治疗有明显改善，且伴随一些不容忽视的不良反应。虽然有一些细胞因子制剂对治疗胆汁性肝硬化有一定的治疗效果，但至今没有一种能用于临床治疗。因此，研发防治胆汁性肝硬化的新药是目前医药科研工作亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明中，发明人提供一种发明专利pct/ib2013/003191中涉及到的glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽的新生物活性及其治疗和适应症用途。
本发明的目的在于提供一种glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽在抑制和改善胆汁性肝硬化及相关肝纤维化病程方面的生物活性及治疗用途。
本发明人经过大量的实验研究，证明该类glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽能够显著抑制体外人肝星状细胞lx-2的活化，提示活性多肽具有良好的体外抗肝纤维化效应。同时该类多肽能够明显改善bdl诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度。证明该类glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽对胆汁性肝硬化等疾病具有显著的治疗作用。
本发明的又一个目的在于提供一种glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽新的适应症治疗用途。该glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽有望作为新一代对胆汁性肝硬化及相关肝纤维化疾病的预防或治疗药物。
本发明中涉及含有以下氨基酸序列表示的母体肽的glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽：
his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-xaa10-ser-xaa12-xaa13-leu-asp-ser-xaa17-xaa18-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-xaa27-ala-gly-xaa30
其中，xaa10＝tyr或lys；
xaa12＝lys，glu，arg或ser；
xaa13＝lys或tyr；
xaa17＝glu，arg，gln或lys；
xaa18＝arg，ser或ala；
xaa27＝glu或val；
xaa30＝gly或arg。
其中xaa30可以是gly。
其中如果xaa17是glu，则xaa18是arg，并且如果xaa17是arg，则xaa18是ser。
其中如果xaa10是tyr，xaa12是lys，并且xaa13是lys，并且xaa27是val。
其中如果xaa10是lys，xaa13是tyr，并且xaa27是glu。
本发明还提供含有本发明的glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽的药物组合物，以所述glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽作为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料制成药物组合物。
本发明多肽对胆汁性肝硬化及相关肝纤维化病程疾病具有改善和治疗作用。本发明多肽可用于直接或间接治疗由胆汁性肝硬化及相关肝纤维化病程所引起的或者以其为特征的病症。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。
适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂、以及可用于注射的无菌溶液。
含有本发明多肽的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
本发明多肽在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。
本发明的优点在于：
1)具有良好的生物学活性；
2)在药物的药代实验中显示稳定性，稳定性好，易于放大生产，成本低；
3)与小分子化合物相比具有更低毒性，安全窗口更大，用量更小。
在具体的实施方案中，涉及下述glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽，其具有序列：
化合物1(涉及seqidno:1)：
his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-lys(ge-palmitoyl)-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-val-ala-gly-gly-nh2
hsqgtftsdyskk(ge-palmitoyl)ldserardfvawlvagg-conh2
化合物2(涉及seqidno:2)：
his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-lys(ge-palmitoyl)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-nh2
hsqgtftsdk(ge-palmitoyl)seyldserardfvawleagg-conh2
化合物3(涉及seqidno:3)：
his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-lys(ge-palmitoyl)-ser-arg-tyr-leu-asp-ser-arg-ser-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-nh2
hsqgtftsdk(ge-palmitoyl)sryldsrsardfvawleagg-conh2
化合物4(涉及seqidno:4)：
his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-lys(ge-palmitoyl)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly
hsqgtftsdk(gepalmitoyl)seyldserardfvawleagg-cooh
本发明中所用缩写具体含义如下:
boc为叔丁氧羰基，fmoc为芴甲氧羰基，t-bu为叔丁基，ivdde为1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基-丁基的脱除与亲脂取代基，resin为树脂，tfa为三氟乙酸，edt为1,2-乙二硫醇，phenol为苯酚，fbs为胎牛血清，bsa为牛血清白蛋白，hplc为高效液相，glp-1r为胰高血糖素样肽1受体，gcgr为胰高血糖素受体，glp-1为胰高血糖素样肽，mpeg为单甲氧基聚乙烯二醇，oxm为胃泌酸调节素，his为组氨酸，ser为丝氨酸，d-ser为d-型丝氨酸，gln为谷氨酰胺，gly为甘氨酸，glu为谷氨酸，ala为丙氨酸，thr为苏氨酸，lys为赖氨酸，arg为精氨酸，tyr为酪氨酸，asp为天冬氨酸，trp为色氨酸，phe为苯丙氨酸，iie为异亮氨酸，leu为亮氨酸，cys为半胱氨酸，pro为脯氨酸，val为缬氨酸，met为蛋氨酸，asn为天冬酰胺，homolys为高赖氨酸，orn为鸟氨酸，dap为二氨基庚二酸，dab为2,4-二氨基丁酸，nle为正亮氨酸，aib为2-氨基异丁酸，palmitoyl为棕榈酰基团，aeea为[2-[2-(氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸。
附图说明
图1为显示大鼠肝脏he染色病理切片图。
图2为显示大鼠肝脏siriusred染色病理切片图。
图3为显示大鼠肝脏siriusred染色病理切片统计柱状图(****：表示与对照相比在99％置信度内(p<0.0001))。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
实施例1、本发明实施例中所合成的多肽化合物结构(表1)：
实施例2、glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽对肝纤维化的体外抑制效应
选用人肝星状细胞株lx-2，研究并观察不同剂量受试物对lx-2细胞活化标志物α-sma表达量的影响。
将人肝星状细胞lx-2铺板于35mm细胞培养皿，用dmem(高糖)+10％fbs+1％双抗培养基(thermofisher)进行培养，在37℃，5％co2条件下待细胞生长至70％汇合时无血清过夜，翌日早上，用上述glp-1r/gcgr双激动剂多肽1-4(溶于pbs)处理48小时后提取细胞蛋白，进行westernblot，以β-actin为内参，以imagej1.50i灰度分析α-sma和β-actin的表达量。阴性对照仅加入与实验组相同体积的pbs。
采用浓度15.0μm的上述多肽化合物进行处理，可见它们在所有浓度下，均能够降低α-sma的表达，并有一定的量-效关系；而阴性对照对α-sma的表达没有影响(表2)。
下表2中示出选用15.0μm浓度的本发明的化合物1-4，利拉鲁肽(liraglutide)标准品(购于吉尔生化(上海)有限公司，纯度>98％，醋酸利拉鲁肽casno.:204656-20-2.)和艾塞那肽(exenatide)标准品(购买于杭州湃肽生化科技有限公司，纯度>98％，醋酸艾塞那肽，casno.:141732-76-5)进行肝纤维化体外抑制实验结果。以阴性对照组中α-sma/β-actin的整合灰度为100％，分析受试多肽的肝纤维化体外抑制活性。
表2.将化合物1-4对人肝星状细胞株lx-2的细胞活化标志物α-sma相对表达量的影响。
由以上表2可见，本发明的双靶点激动剂多肽化合物1-4跟glp-1类似物利拉鲁肽和艾塞那肽相比均显示出更优异的体外抑制lx-2细胞活化标志物α-sma表达。我们进一步进行体内动物学评价。
实施例3、glp-1r/gcgr双激动多肽对胆总管结扎(bdl)诱导的大鼠肝脏纤维化(胆汁性肝硬化大鼠模型)的改善治疗作用
1.试验药物：多肽化合物1、2、3、4和利拉鲁肽。保存条件-20℃。
2.试验方法：
将56只雄性sd大鼠，体重200-230g，随机分成7组，分别为：
1).假手术组(shame组，仅游离胆总管，不予结扎n＝8)；
2).bdl+生理盐水对照组(nacl组，bdl术后给予生理盐水皮下注射，n＝8)；
3).bdl+1(75μg/kg)组(bdl术后给与75μg/kg皮下注射，n＝8)；
4).bdl+2(75μg/kg)组(bdl术后给与75μg/kg皮下注射，n＝8)；
5).bdl+3(75μg/kg)组(bdl术后给与75μg/kg皮下注射，n＝8)；
6).bdl+4(75μg/kg)组(bdl术后给与75μg/kg皮下注射，n＝8)；
7).bdl+liraglutide(75μg/kg)组(bdl术后给与75μg/kg皮下注射，n＝8)；
spf级sd大鼠，200-230g，雄性兰州大学实验动物中心提供。大鼠入室(spf环境)检疫一周后，模型鼠及假手术组大鼠均采用0.6％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，麻醉后于超净台施行手术，模型鼠分离胆总管后双侧结扎，假手术组大鼠仅分理处胆总管，不予结扎，术后第二天开始给药。
于术后第一天开始给药，每日皮下注射，给药剂量75μg/kg，生理盐水组每日一次，给药过程中每日观察大鼠生命体征的变化。
并于给药周期2周(14天)结束后，处死大鼠取材进行后续生物测定实验。取出肝脏进行he染色、天狼星红(siriusred)染色。用image-proplus和graphpad软件统计。
he染色图1、天狼星红染色图2和统计图3结果显示：胆总管结扎给生理盐水对照组(nacl组)中央静脉区域周围有炎性细胞浸润，肝细胞水肿变性，汇管区及肝小叶间隔有大量胶原纤维沉积；多肽化合物1、2、3和4给药组对胶原纤维沉积抑制显著，并且能显著降低胆管结扎诱导的小鼠肝纤维化和炎症。表明多肽化合物1、2、3和4跟利拉鲁肽相比，更能明显治疗改善bdl诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度。其中，多肽化合物1治疗作用最为明显。
综合上述实验结果表明，多肽化合物1、2、3和4能够明显治疗改善bdl诱导的大鼠胆汁淤积性肝纤维化程度，对胆汁性肝硬化等疾病具有显著的治疗作用。该类双靶点激动剂多肽可用于预防或治疗胆汁性肝硬化及相关肝纤维化疾病。
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<110>深圳市图微安创科技开发有限公司
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