一种黑枸杞发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体为一种黑枸杞发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用。
背景技术：
：黑枸杞又叫黑果枸杞(lyciumruthenicummurr.)，为茄科、枸杞属多棘刺灌木，分布于陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏等地，黑枸杞味甘、性平，经科学检测，其钙、铁、尼克酸含量分别为红果枸杞的2.3、4.6、16.7倍，尤其是原花青素(opc)含量超过蓝莓，这是迄今为止发现opc含量最高的天然野生果实，也是最有效的天然抗氧化剂，其功效是vc的20倍、ve的50倍，具有超强的增强免疫力、延缓衰老的滋补作用，在化妆品中具有较好的应用前景。植物活性成分因其高的安全性和功能活性，已普遍应用于食品、医药、化妆品等行业。因此，利用各种提取技术从植物中提取具有高活性的成分已经成为目前的研究热点。传统的提取技术包括溶剂提取法、蒸馏、超声提取、微波提取等，这些方法存在耗时长、污染大、成本高且活性成分易降解等缺点。近年来，发酵技术在化妆品植物活性原料开发上越来越受到青睐，因为微生物发酵不仅能降低有机试剂的使用，减少污染及能耗，还能够有效富集植物活性成分、提高功效，将大分子物质分解成小分子活性物质，利于皮肤吸收，此外，还可以降低来自植物中其他物质的毒副作用，已然成为化妆品工业上的研究热点之一。专利cn102060833a公开了一种从黑枸杞果实中提取花色苷的方法，专利wo2017185290a1公开了一种黑枸杞提取物的制备方法，专利cn105963167a公开了一种黑枸杞爽肤水，均未见有黑枸杞发酵液在化妆品中的应用报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种黑枸杞发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种黑枸杞发酵液的制备方法，包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干粉和水混合，得发酵初始体系；(2)、在发酵初始体系中加入酶，得黑枸杞发酵原液；(3)、加入发酵菌进行发酵，得所述黑枸杞发酵液。本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法，该制备工艺简单、成本低、安全环保，可用于大规模生产；而且还保留了黑枸杞的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失。本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中富含黄酮、多酚和多糖等活性物质，且具有较好的自由基清除能力和抑制酪氨酸酶抑制能力，可用于美白、抗衰老等化妆品中。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述发酵初始体系还包括灭菌步骤，所述灭菌为巴氏灭菌。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述黑枸杞干粉和水的之比为：黑枸杞干粉：水＝1:5～1:30。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述酶在黑枸杞发酵原液中的量为50～500u/ml；所述酶为纤维素酶和/或果胶酶。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述酶为纤维素酶和果胶酶。采用纤维素酶和果胶酶共同使用时，能为发酵提供充分条件，提高发酵产物中有效物质的含量。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述纤维素酶与果胶酶的重量之比为：纤维素酶：果胶酶＝1:1～1:20。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述黑枸杞发酵原液中，发酵菌的浓度为105～108cfu/ml。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述发酵菌为酵母菌和/或乳酸菌。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述发酵菌为酵母菌和乳酸菌。采用酵母菌和乳酸菌共同添加时，获得的黑枸杞发酵液中的黄酮和多糖含量较为均衡。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述酵母菌为酿酒酵母菌，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌中的至少一种。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述发酵的温度为25～40℃，所述发酵的时间为12～96h。采用上述发酵温度和时间，发酵条件较适合发酵菌的生长和代谢，获得的黑枸杞发酵液中的黄酮和多糖含量较高。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，所述黑枸杞发酵液的ph为3.0～5.0。作为本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述发酵结束后还包括离心和除菌的步骤；所述离心的条件为：转速为3000～5000r/min，时间为10～30min；所述除菌的方式为过0.22～0.45μm微孔滤膜。本发明的目的还在于提供一种采用所述黑枸杞发酵液的制备方法制备而成的黑枸杞发酵液。本发明的目的还在于提供所述黑枸杞发酵液在化妆品中的应用。本发明的目的还在于提供所述黑枸杞发酵液在美白和/或抗衰老化妆品中的应用。所述化妆品剂型包括膏霜、乳液和水剂，但不限于上述剂型。通过实验证明，本发明制备的黑枸杞发酵液具有良好的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，可作为制作美白、抗衰老化妆品的原料。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种黑枸杞发酵液的制备方法，本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法最大程度地保留了原料的功效成分及活性，避免了提取方法造成的活性成分的损失，且具有较好的自由基清除能力和酪氨酸酶抑制能力，可广泛用于美白、抗衰老等化妆品中。本发明的制备工艺简单，成本低，且不含任何的有机试剂，绿色环保，能够实现大量生产、工业化生产，并能够保证产品质量的稳定性。本发明还提供了采用所述黑枸杞发酵液的制备方法制备而成的黑枸杞发酵液。本发明还提供了所述黑枸杞发酵液在化妆品中的应用。本发明还提供了所述黑枸杞发酵液在美白和/或抗衰老化妆品中的应用。附图说明图1实施例3所得黑枸杞发酵液对dpph自由基清除能力的影响；图2实施例3所得黑枸杞发酵液对abts自由基清除能力的影响；图3实施例3所得黑枸杞发酵液对小鼠b16黑色素瘤细胞存活率的影响；图4实施例3所得黑枸杞发酵液对小鼠b16黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响。具体实施方式本发明下述实施例所述黑枸杞发酵液中总黄酮的测定方法参照《中国药典》2015版一部附录的山楂叶总黄酮检测的具体方法，以芦丁为对照品，采用nano2-al(no3)3-naoh法进行检测。多糖含量检测参照sn/t4260-2015，采用苯酚硫酸法进行检测，其主要的实验步骤如下：精密吸取样品溶液0.2ml，置于10ml具塞试管中，加水补至1.0ml，精密加入1.0ml5％的苯酚溶液，摇匀，然后快速加入浓硫酸5ml(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min后，使用旋涡振荡器反应充分混合均匀，然后放置于30℃水浴中反应20min，用紫外可见分光光度计在488nm下进行检测。多酚检测参照。本发明下述实施例采用的试剂均为普通市售品，商业酿酒酵母(ec118)、果胶酶(ex-v)购自上海杰兔工贸有限公司，纤维素酶(bomei，30u/mg)购自合肥博美生物科技有限责任公司，乳酸菌购自北京川秀国际贸易有限公司。为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入300ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取12mg果胶酶和30mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)、准确称取90mg活性干酵母，加入10倍量的无菌水在35℃活化10min，再加入1倍量的黑枸杞发酵原液，活化15min，得活化菌液；(4)、将活化菌液与剩余的黑枸杞发酵原液混合，置于室温下发酵24h；(5)、发酵结束后，于3500r/min下离心15min，收集上层清液，过0.22～0.45μm微孔滤膜，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量0.75mg/ml，多糖含量17.91mg/ml，ph值为4.39。实施例2本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入300ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取12mg果胶酶和30mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)、准确称取300mg乳酸菌，加入10倍量的无菌水充分溶解后与黑枸杞发酵原液混合，置于37℃下发酵24h；(4)、发酵结束后于3500rpm/min下离心15min，收集上层清液，过0.22～0.45μm微孔滤膜，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量0.51mg/ml，多糖含量53.86mg/ml，ph为3.80。实施例3本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入300ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取12mg果胶酶和30mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)、准确称取90mg酵母菌和300mg乳酸菌，活化后与黑枸杞发酵原液混合，置于37℃下发酵24h；(4)、发酵结束后于3500rpm/min下离心15min，收集上层清液，过0.22～0.45μm微孔滤膜，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量为0.65mg/ml，多糖含量33.76mg/ml，ph为4.34。实施例4本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入300ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取12mg果胶酶和120mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)、准确称取120mg酵母菌和200mg乳酸菌，活化后与黑枸杞发酵原液混合，置于37℃下发酵96h；(4)、发酵结束后于3500rpm/min下离心20min，收集上层清液，过0.22～0.45μm微孔滤膜，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量为0.90mg/ml，多糖含量41.25mg/ml，ph为4.21。实施例5本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入600ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取6mg果胶酶和60mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)、准确称取150mg酵母菌和100mg乳酸菌，活化后与黑枸杞发酵原液混合，置于37℃下发酵96h；(4)、发酵结束后于4500rpm/min下离心20min，收集上层清液，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量为0.42mg/ml，多糖含量25.14mg/ml，ph为3.98。实施例6本发明所述黑枸杞发酵液的制备方法的实施例，本实施例所述制备方法包括以下步骤：(1)、将黑枸杞干果打粉，称取30g，加入600ml无菌去离子水，摇匀，在65℃下灭菌30min，形成发酵初始体系；(2)、分别称取36mg果胶酶和120mg纤维素酶，充分溶解后加入冷却至室温的发酵初始体系中，形成黑枸杞发酵原液；(3)准确称取300mg酵母菌和300mg乳酸菌，活化后与发酵原液混合，置于37℃下发酵48h；(4)、发酵结束后于4500rpm/min下离心30min，收集上层清液，过0.22～0.45μm微孔滤膜，即得所述黑枸杞发酵液。本实施例所述黑枸杞发酵液的制备方法制得的黑枸杞发酵液中，黄酮含量为0.52mg/ml，多糖含量38.21mg/ml，ph为4.01。实施例7为了进一步探究发酵菌的配比对黑枸杞发酵液中黄酮含量和多糖含量的影响，设置以下试验组，试验组的黑枸杞发酵液的制备方法与实施例3的不同之处仅在于发酵菌的配比的不同，发酵菌的总量与实施例3保持一致，试验组的发酵菌种类和黑枸杞发酵液中的黄酮、多糖和ph情况见表1。表1发酵菌的种类对黑枸杞发酵液的影响组别发酵菌种类黄酮(mg/ml)多糖(mg/ml)ph值试验组1酵母菌0.8517.284.35试验组2乳酸菌0.4555.643.75试验组3酵母菌：乳酸菌＝2:10.7820.154.31试验组4酵母菌：乳酸菌＝1:10.7528.454.25试验组5酵母菌：乳酸菌＝1:30.6034.123.80试验组6酵母菌：乳酸菌＝1:40.5245.323.78试验组7酵母菌：乳酸菌＝1:50.4946.343.73从表1的结果可以看出，随着乳酸菌添加量的增加，黑枸杞发酵液中多糖含量增加，而黄酮含量会有所降低，酵母菌和乳酸菌两种菌混合使用时获得的黑枸杞发酵液中黄酮和多糖含量比较均衡。实施例8dpph自由基清除能力检测dpph自由基清除能力常用来表示物质的抗氧化能力，其原理是dpph自由基溶液呈紫色，最大吸收波长为517nm，当有自由基清除剂存在时，由于其与dpph中电子配对使dpph液吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成一定关系，因而可用紫外分光光度法进行定量分析。将发酵液稀释80倍后，准确吸取1ml样品溶液，加入5mldpph溶液，混匀后在室温下(25℃)避光静置30min，测定517nm处的吸光值，计算清除率，dpph自由基清除率公式如下：y＝(a0-a1-a2)/a0*100％y-清除率，％a0-1ml蒸馏水+5mldpph溶液的吸光度a1-1ml样品/trolox标准液+5mldpph溶液的吸光度a2—1ml样品/trolox标准液+甲醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)。将实施例3中所得的黑枸杞发酵液分别稀释50、100、125、200、250、500倍后，检测其对dpph自由基的清除能力，结果见图1，由图可知，当发酵原液稀释500倍，即浓度为0.2％时，其对dpph自由基清的除能力为12.56％；当稀释50倍，浓度为2.0％时，其对dpph自由基清的除能力仍可达87.52％，随着黑枸杞发酵液浓度的增加，其对dpph自由基清的除能力增加，由此可见，所得的黑枸杞发酵液具有较好的抗氧化能力，能够防止细胞氧化，延缓衰老。实施例9abts自由基清除实验abts自由基清除能力也常用来表示抗氧化能力，其原理是与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基abts·+，抗氧化活性物质与该离子反应，单个电子从抗氧化剂分子转移到氧化剂分子上，使反应体系中的蓝色褪去，可在紫外分光光度计下测定734nm处的吸光度变化值从而来评价其清除自由基的能力。准确吸取0.2ml样品溶液，加入7.8mlabts自由基工作液，混匀后在室温下(25℃)避光静置10min，测定734nm处的吸光值，计算清除率，以清除率为y、trolox溶液浓度(μg/ml)为x制作标准曲线。y＝(a0-a1-a2)/a0*100％y—清除率，％a0—0.2ml蒸馏水+7.8mlabts自由基工作液的吸光度a1—0.2ml样品/trolox标准液+abts自由基工作液的吸光度a2-0.2ml样品/trolox标准液+乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间颜色的误差)以trolox标准工作液为阳性对照，以无水乙醇为空白对照。将实施例3中所得的黑枸杞发酵液分别稀释10、20、40、50、100倍后，检测其对abts自由基的清除能力，结果见图2。由图2可知，当发酵原液稀释100倍，即浓度为1.0％时，其对abts自由基清的除能力为13.26％；当稀释10倍，浓度为10.0％时，其对abts自由基清的除能力可达99.0％，随着黑枸杞发酵液浓度的增加，其对abts自由基清的除能力增加，由此可见，所得的黑枸杞发酵液具有较好的抗氧化能力，能够防止细胞氧化，延缓衰老。实施例10黑枸杞发酵液对小鼠b16黑素瘤细胞存活率的影响本发明采用噻唑蓝(mtt)法检测黑枸杞发酵液对小鼠b16细胞增殖的影响，目的在于找出一个合适的安全剂量范围。将本发明实施例3中的黑枸杞发酵液，用真空冷冻干燥后，用培养基配制成1000μg/ml的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×104个/ml，将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，37℃，5％co2饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的黑枸杞发酵液，使每孔中黑枸杞发酵液的终浓度分别为：50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：200μg/ml)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。向每孔加20μl浓度为5mg/mlmtt溶液，在孵箱中作用4h后.小心吸除培养孔内的上清，再向每孔加入100μldmso，震荡10min，使结晶完全溶解后，放置于酶标仪上，选取检测波长为492nm，测定吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：测试结果如图3所示，由图可知，本发明提供的黑枸杞发酵液在浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml时，使b16黑素瘤细胞的存活率分别为112.72％、141.87％、154.62％、159.22％、163.66％，说明本发明的黑枸杞发酵液对小鼠黑色素瘤b16细胞无细胞毒性作用。实施例11黑枸杞发酵液对小鼠b16细胞酪氨酸酶活性的影响酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的合成。美白功效评价的评价方法有：生物化学法，细胞生物学法和人体试用试验。本发明采用细胞生物学法评价黑枸杞发酵液的美白功效。本发明采用多巴氧化法测定小鼠b16细胞酪氨酸酶活性。将本发明实施例3中的黑枸杞发酵液，用真空冷冻干燥后，用培养基配制成1000μg/ml的母液冻存备用。取对数生长期的细胞，用培养基调节成细胞密度至3.5×104个/ml，将细胞接种于96孔板中，每孔100μl，于37℃，5％co2饱和湿度环境下孵育24h。向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的黑枸杞发酵液，使每孔中黑枸杞发酵液的终浓度分别为：50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml，并设立对照组：单纯培养基组、阳性药对照组(熊果苷，浓度：200μg/ml)，和空白对照组(培养基)，置于孵箱中作用48h。吸去药液，用pbs洗2次后，每孔加1％tritonx-100溶液100μl，迅速放入-80℃冰箱冻存1h，随后移至室温下融化使细胞完全破裂、分解，在37℃预温后每孔加入0.1％l-dopa100μl，于37℃水浴2h，后置酶标仪下测a492，测定吸光度值，并计算酪氨酸酶活性，酪氨酸酶活性的计算公式如下：实验重复三次。测试结果如图4所示，本发明提供的黑枸杞发酵液浓度在50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml时使b16黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活性分别降低为97.59％、90.41％、68.20％、46.80％、27.81％，用graphpadprism6.0计算黑枸杞发酵液浓度导致酪氨酸酶活性下降50％的抑制浓度(ic50)为378.0μg/ml。而具有较高美白活性的熊果苷在浓度为200μg/ml时，b16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性降低为43.57％。说明本发明提供的黑枸杞发酵液具有较好的美白作用，可以作为美白原料添加到化妆品中。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12