丁苯酞在急性酒精中毒引起脑内海马γ网络振荡保护中的应用的制作方法

本发明涉及丁苯酞药物的新用途，具体地，涉及丁苯酞在急性酒精中毒引起的脑内海马γ网络振荡保护中的应用以及在缓解急性酒精中毒对神经元损伤中的应用。

背景技术：

丁苯酞(nbp)是我国成功研制出的具有自主知识产权的一类化学新药，为人工合成的消旋体，其左旋体存在于芹菜种子中。已有研究发现，nbp具有较强的抗脑缺血作用，缩小局部脑缺血的梗塞面积，减轻脑水肿，改善脑能量代谢和缺血脑区的微循环和血流量，抑制神经细胞凋亡，并具有抗脑血栓形成和抗血小板聚集作用，以及改善全脑缺血后的能量代谢、抑制ca²⁺内流、保护线粒体功能。

近年来，酒精中毒发生率逐年上升，已经成为目前非常普遍的医学和社会问题。酒精具有脂溶性高的特点，能快速通过血脑屏障，对中枢神经系统具有广泛的抑制作用。酒精暴露浓度达到50mm以上可能导致急性中毒症状，急性酒精中毒可严重损害中枢神经系统的正常功能，引起学习和记忆方面的认知功能障碍。海马γ网络振荡与学习记忆功能密切相关。学习和记忆能力减退是海马衰老或病变的一个重要特征。最近的研究表明急性酒精中毒也伴随着γ振荡的抑制，其细胞和突触机制尚不清楚。急性酒精中毒表现出的海马ca3区功能损害和γ网络振荡受到抑制可能是学习记忆能力下降的一个重要原因。

急性酒精中毒是指在短时间内摄入过量的酒精，因酒精脂溶性较高，能迅速透过血脑屏障进入脑组织，对中枢神经系统具有广泛的抑制作用，因而能对与认知、学习、记忆相关部位造成损害，损害海马ca3区神经元可造成学习记忆能力下降。另一方面，急性酒精中毒可增加线粒体膜的通透性，降低线粒体atp酶活性，降低神经细胞内钙离子的含量，引起线粒体结构和功能的改变，导致细胞的能量代谢发生异常，严重抑制神经元的活动，最终使小鼠的学习记忆能力下降。

海马γ网络神经网络振荡随着学习记忆过程同步增加，这说明γ神经网络振荡参与认知、学习和记忆的过程，且具有特异性。在海马、前额叶皮层只有γ频率同步增加参与了认知、学习和记忆的过程，其他频率的能力则减少。也就是说，海马γ网络振荡不仅参与特异性的学习记忆过程，而且参与记忆的重现过程。抑制性中间神经元组成的网络与海马γ网络振荡的产生密切相关。抑制性中间神经元突触传递的延迟时间会影响γ振荡活动的频率以及同步性。而且，低频海马γ网络振荡频率表现为突触延迟时间延长，振荡频率降低。海马神经元ca3区，200nmka(红藻氨酸)可以激活ka受体产生持续的γ振荡，篮状细胞神经元在振荡活动中作用十分重要，振荡的频率由抑制性中间神经元的篮状细胞神经元产生抑制电位的时间决定。而海马γ网络振荡可易化突触传递且可以调节神经网络，是形成网络神经元同步化活动的可能机制。海马γ网络振荡参与存取信息、整合信息、记忆信息等重要的大脑功能。低频γ网络振荡更是与记忆提取和恢复密切相关，它能够跨区域协调海马网络神经元，从而记忆可以被激活和编码。

目前，我国在丁苯酞对急性酒精中毒方面有关海马γ网络振荡的保护作用及相关机制研究很少，随着对急性酒精中毒对认知、学习、记忆功能损伤海马γ网络振荡机制的研究越来越深入，将为丁苯酞对急性酒精中毒的预防与治疗提供更多可能。为明确海马γ网络振荡在急性酒精中毒状态下的变化、了解丁苯酞对急性酒精中毒海马ca3区的保护作用、探究丁苯酞对急性酒精中毒导致学习记忆能力减退的保护机制，开发改善和提高急性酒精中毒相关的学习记忆功能减退的药物，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的是提供丁苯酞的一个用药新用途，即本发明发现丁苯酞在急性酒精中毒引起的脑内海马γ网络振荡中具有保护作用，能够显著缓解急性酒精中毒对神经元损伤进而缓解酒精中毒对学习记忆能力的损害。

为了实现本发明目的，本发明应用场电位记录30只c57bl/6小鼠(3月龄、6月龄、12月龄)急性酒精中毒前后、丁苯酞作用前后的海马γ网络振荡的辐值及频率等变化情况。结果发现在n＝10脑片上，100mm酒精使不同年龄组小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)海马γ网络振荡的能谱分别下降39.26±4.97％、53.85±6.65％、28.30±13.68％。这些变化都具有显著意义(***p<0.001，配对t检验，自身对照)。100μm丁苯酞使不同年龄组急性酒精中毒小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)海马γ网络振荡的能谱分别上升57.37±8.94％、107.82±18.67％、47.82±7.26％。这些变化都具有统计学意义(*p<0.05，配对t检验，自身对照)。这说明丁苯酞能够有效减轻急性酒精中毒对海马ca3区神经元造成的损伤，缓解急性酒精中毒对小鼠学习记忆能力的损害。

基于本发明的研究，本发明提供了丁苯酞在制备急性酒精中毒引起的脑内海马γ网络振荡保护药物中的应用。

进一步地，本发明提供了一种含有丁苯酞或其衍生物的药物，该药物能够保护急性酒精中毒引起的脑内海马γ网络振荡。

更进一步地，本发明提供了丁苯酞在制备急性酒精中毒引起的脑内海马ca3区γ网络振荡保护药物中的应用。

本发明提供了一种含有丁苯酞或其衍生物的药物，该药物能够保护急性酒精中毒引起的脑内海马ca3区γ网络振荡。

本发明提供丁苯酞在制备减轻脑内海马ca3区神经元损伤药物中的应用。

具体地，是由急性酒精中毒引起的脑内海马ca3区神经元损伤。

本发明提供一种含有丁苯酞或其衍生物的药物，该药物能够减轻酒精引起的脑内海马ca3区神经元损伤。

本发明提供了丁苯酞在制备缓解急性酒精中毒症状药物中的应用。

进一步提供一种缓解急性酒精中毒症状的药物，该药物含有丁苯酞或其衍生物。

本发明提供了丁苯酞在制备缓解酒精中毒对脑记忆损坏的药物中的应用。

进一步提供一种促进脑记忆恢复的药物，该药物含有丁苯酞或其衍生物，所述的脑记忆是酒精中毒后引起脑记忆损伤导致的记忆力下降。

更进一步地本发明提供了丁苯酞在制备提高学习记忆能力药物或保健品中的应用。以及含有丁苯酞或其衍生物的用于提高学习记忆能力的药物或保健品也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：本发明提供了丁苯酞的新用途弥补了现有技术的空白。本发明研究发现丁苯酞能保护酒精作用下神经元的结构和功能、减轻酒精对神经功能损伤程度、抑制神经细胞凋亡，减少了酒精对γ网络振荡的抑制作用，从而使急性酒精中毒小鼠学习记忆能力增加和智力水平上升。进一步预示了丁苯酞可用于制备减轻急性酒精中毒对海马ca3区神经元造成的损伤的药物，缓解急性酒精中毒对脑神经学习记忆能力的损害。

附图说明

图1-图3为不同年龄组小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)应用红藻氨酸诱导的γ网络振荡达到稳态时、应用100mmetoh后在小鼠海马ca3区记录到的细胞场电位1s稳态时、应用100μmnbp后在小鼠海马ca3区记录到的细胞场电位1s稳态时的原始曲线。

图4-图6为不同年龄组小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)的γ网络振荡达到稳态时、应用100mmetoh后的功率谱，该功率谱显示出了γ频谱的网络振荡活动。

图7-图9为不同年龄组小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)应用200nmka后、应用100mmetoh后、应用100μm丁苯酞(nbp)后的时效曲线。

图10为应用200nmka、100mmetoh、100μmnbp对海马γ网络振荡能谱均值的影响。(***p<0.001，自身对照，配对t检验，n＝10)

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

清洁级c57bl/6小鼠，3-12月龄，雄性，共30只，每个年龄组10只，体重约20-40g，由郑州大学动物中心提供。按照年龄分为3月龄组、6月龄组、12月龄组，每组10只。

milli-q由美国millipore公司提供。t1000s振动切片机购于美国leica公司。界面式浴槽(自制)，micro1401、humbug、nl900d由digitimer有限公司生产。hj-3恒温磁力搅拌器购于常州国华电器有限公司。tc324b温控装置由美国warnerinstruments生产。uls-3蠕动泵购于美国gilson公司。kph计购于美国mettler公司。bs精密立体变倍显微镜由美国wpi生产。l-97拉直仪由美国sutterinstrument生产。分析天平由瑞士普利塞斯公司提供。kainate购于sigma公司。lenscleaningtissue购于英国whatman公司。nbp批号:118170424由石药集团恩必普药业有限公司提供。其他试剂均为国产或进口分析纯品。

实施例1

1、主要试剂的配制

1.1人工脑脊液(acsf)的配制用500ml烧杯，加入milli-q水至400ml，依次加入7.363gnacl、0.224gkcl、0.235gmgso4、0.150gnah2po4、2.016gnahco3、0.222gcacl2、1.8gglucose,用磁力搅拌器搅拌使之完全溶解后定容至1000ml，保鲜膜密封，通混合气体(95％o2+5％co2)30min后ph值稳定在7.35-7.45之间，保存于室温，当日使用。

1.2切片脑脊液的配制用500ml烧杯，加入milli-q水至350ml，依次加入38.475gsucrose、0.112gkcl、0.361gmgso4、0.075gnah2po4、1.008gnahco3、0.028gcacl2、0.9gglucose,用磁力搅拌器搅拌使之完全溶解后定容至500ml，保鲜膜密封，-80℃冰箱冰冻30min取出，通混合气体(95％o2+5％co2)30min后ph值稳定在7.35-7.45之间，当日使用。

1.310％水合氯醛的配制称取10g水合氯醛，用milli-q水稀释到100ml，4℃避光保存，近期使用。

1.4ka溶液的配制以milli-q水溶解后配成10μmol/l的储存液，分装成20μl/瓶，-20℃避光保存，避免反复冻融。实验当日以人工脑脊液稀释至终浓度为200nmol/l。

1.5nbp溶液的配制以二甲基亚砜dmso溶液溶解后配成10mmol/l的储存液，分装成10μl/瓶，-20℃避光保存，避免反复冻融。实验当日以人工脑脊液稀释至终浓度为100μmol/l。

2、实验步骤

2.1检测对象及方法

用显微镜对小鼠脑片进行形态学观察，采用细胞外微电极记录(interfacechamberrecording)小鼠离体脑片的活动。

2.2建立恒温界面式浴槽灌流系统

在界面式浴槽下方接通混合气体(95％o2+5％co2)，界面处铺满lenscleaningtissue用于引流人工脑脊液(ph：7.35-7.45)，通过minipuls-3蠕动泵调节流速(1.5ml/min)，使人工脑脊液通过tc324b温控装置加温(30℃-32℃)完全湿润lenscleaningtissue，在界面式浴槽上方使用载玻片将其界面处封盖，以便于温度的恒定和氧气的弥漫。为了排除噪音，所有装置需接入地线。界面式浴槽灌流系统采用双重氧供装置，使得制备的小鼠海马脑片能够更好的保存及使用，脑片最长保存时间可达24小时。

2.3制备脑片

不同年龄组(3月龄、6月龄、12月龄)的c57bl/6小鼠，雄性，体重约20-40g，制备成厚度为350-400μm的横向海马脑片，每只小鼠可制备2-3张较好的海马脑片。

2.3.1取材实验小鼠通过注射10％的水合氯醛(0.3ml/kg)进行腹腔麻醉，以便于更好的准备切片。当所有的深浅反射消失后打开胸腔，后用眼科剪剪破其右心耳，在心尖部用预冷(5℃)切片脑脊液(ph：7.35-7.45)经心灌流至四肢变白，快速断头并放置于冰内2分钟。使用眼科剪在后颈部做倒t形切口，后挑起颅骨剪开，充分暴露双侧大脑半球并去除小脑及脑干，小心将脑组织取出放入已接通混合气(95％o2+5％co2)的0℃切片脑脊液中(ph：7.35-7.45)平衡3-5分钟。

2.3.2切片使用502胶将脑组织以水平方向固定在leicavt1000s振动切片机凹槽内，凹槽内灌满0℃切片脑脊液(ph：7.35-7.45)并接通混合气体(95％o2+5％co2)，水平切割(即产生横向海马切片)厚度为350-400μm的小鼠大脑切片。

2.4建立神经网络振荡模型

采用细胞外微电极和界面浴槽记录，脑片置于恒温界面浴槽式灌流系统中孵育约l小时后即可用于实验。将记录电极置于海马ca3区，加入红藻氨酸受体激动剂(200nmkainate)，20-30分钟后即开始出现海马γ(20-60hz)网络振荡，1.5-2小时后达到稳定状态，后加入无水乙醇(100mmetoh)，作用30-40分钟后达到稳态，加入丁苯酞溶液(100μmnbp)，观察其对γ网络振荡的影响。

2.5电生理记录和数据分析

使用显微镜对海马脑片进行形态学观察，健康的海马脑片轮廓完整清晰。采用细胞外微电极和界面浴槽记录，脑片置于恒温界面浴槽式灌流系统中孵育约l小时后即可用于实验。nl900d的两个通道负责细胞外区域的记录，将人工脑脊液充入玻璃微电极(电阻：2-5mω)放置在海马ca3区，通过a.c.preamp单元，将信号放大10倍，并通过ac-dcamp单元进一步将信号放大100倍。然后信号经由filters单元在0.5至200hz之间进行滤波。在胞外记录中来自交流电源的电子干扰通过使用50hz的humbug噪音消除器消除，所有的仪器需接入地线用于进一步消噪。之后，通过使用ced1401adc板将数据以5至10khz的采样速率数码化。

数据使用来自spike2的软件离线分析(土木工程署，剑桥，英国)。生成的功率谱用来在一段记录中提供频率分量的定量测量，而功率、振动强度的定量测量，被划分成与各自的频率对应。使用由spike2提供的快速傅立叶变换算法构建细胞外区域记录的0-150s时期的功率谱。切片中用于测量振荡活动所使用的两个主要参数是峰值频率(hz)和区域功率(μv²)。

2.6统计学分析

所有的统计测试使用sigmaplot软件执行(spss公司，加利福尼亚州，美国)。统计结果以平均值(mean，m)±标准差(standarderrorofthemean,se)的方式表达。两组或三组间对比后的统计显著性视文中或图例中所述检验决定。如果p＜0.05，测量被认为是具有统计学意义。如果p＜0.01，测量被认为是具有显著统计学意义。如果p＜0.001，测量被认为是极具有统计学意义。

3、结果

3.1不同年龄组小鼠海马脑片应用红藻氨酸诱导的γ网络振荡

显微镜下观察到黄色清晰的小鼠海马脑片，在恒温的半浸入式浴槽灌流系统中，大部分的小鼠海马脑片与灌流的人工脑脊液(ph7.35-7.5)接触，并暴露在混合气体(95％o2+5％co2)中。在3组不同年龄组小鼠(3月龄、6月龄、12月龄)制备的海马脑片中，将细胞外场电位记录电极放置于小鼠海马脑片ca3区，加入红藻氨酸(ka)可诱导出明显的神经生物信号(见图4、图5、图6)，其中振荡频率20-59hz的神经生物信号为γ网络振荡(见图1的a1、，图2的a4)。

3.2酒精对不同年龄组小鼠海马脑片γ网络振荡的影响

在大约70分钟后海马γ振荡达到稳态，后采用100mm酒精(etoh)灌流脑片30min，发现酒精对γ振荡的能谱有抑制作用(见图1的a2，图2的a5和图3的a8)。在n＝10脑片上，100mm酒精使不同年龄组小鼠海马脑片γ网络振荡的能谱分别下降39.26±4.97％、53.85±6.65％、28.30±13.68％(见图7-10)。这些改变都具有显著意义(***p<0.001，配对t检验，自身对照)。上述结果表明，100mm酒精严重抑制了ka诱导的不同年龄组海马γ网络振荡。

3.3丁苯酞对不同年龄组急性酒精中毒小鼠海马γ网络振荡的影响

在100mm酒精(etoh)灌流脑片30min后，实验表明酒精对海马γ网络振荡的能谱及频率有明显抑制作用。在不同年龄组急性酒精中毒小鼠海马γ网络振荡达到稳态时，应用100μm丁苯酞(nbp)灌流脑片30-40分钟，发现丁苯酞对γ网络振荡的能谱有改善作用(图1的a3,图2的a6,图3的a9)。在n＝10脑片上，100μm丁苯酞使不同年龄组急性酒精中毒小鼠海马脑片(3月龄，6月龄，12月龄)海马γ网络振荡的能谱功率分别上升57.37±8.94％、107.82±18.67％、47.82±7.26％(图7-10)。这些变化都具有统计学意义(***p<0.001，配对t检验，自身对照)。上述结果表明，丁苯酞可有效改善不同年龄组小鼠急性酒精中毒小鼠海马γ网络振荡。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。