一种智能改善多种皮肤问题的干细胞微囊组合物的制作方法

本发明属于美容护肤技术领域，具体涉及一种智能改善多种皮肤问题的干细胞微囊组合物。

背景技术：

间充质干细胞（msc）是一类多能干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以从骨骼、骨髓、脂肪、肌肉、脐带、胎盘等组织中分离。间充质干细胞通过旁分泌机制来分泌多种细胞因子作用于其他细胞来发挥作用，能促进损伤组织的再生与修复，还拥有良好的免疫调节能力，通过调控免疫细胞的增殖、分化和功能状态,调节炎症因子水平,对于各种炎症相关疾病具有很好的应用前景。

最近研究发现msc释放的膜微囊(microvesicles，mv)是一种膜状结构，膜结构直径不超过100nm，在体外具有很强的促进血管内皮细胞增殖活性，体内可促进缺血组织中血管新生，可由多种细胞在激活增殖乃至静息状态下释放，是细胞间相互作用的重要介质，mv参与了包括血管生成，免疫细胞发育，神经组织发育等多种生理过程。

另外，间充质干细胞通过分泌的大量功能性因子维持和促进成纤维细胞基质外胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸的再生，进而减少皱纹的产生和维持皮肤弹性。同时，间充质干细胞能分泌白细胞介素-10(interleukin-10,il-10)，这是一种重要的抗炎症细胞因子,具有强大的抑制炎症和巨噬细胞的功能。

在护肤方面，表皮基底层干细胞对于皮肤细胞的新陈代谢起到至关重要的作用：皮肤外层的表皮终身不断自我更新，其基底部的干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞，从而进行组织结构的更新，外层细胞的死亡脱落与基底干细胞的分裂维持一定的平衡，这是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。

能够激活表皮基底层干细胞就可以加强干细胞自我复制分化能力，增加向外分泌营养物质能能力，对于改善各种皮肤状态，可以帮助皮肤组织的修复，皮肤抗炎抗过敏，皮肤因为血管萎缩老化降解导致的衰老，补充皮肤细胞所需的营养物质等有显著的作用。改善皮肤细胞的问题从而改善皮肤的问题。且利用此原理制备的原料，比一般护肤品或药品效果更佳,效力自然比传统技术更胜一筹。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种智能解决多种皮肤问题的干细胞微囊组合物，以改善多种皮肤问题：

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所指的干细胞微囊组合物，由以下组方组成：（1）间充质干细胞微囊；（2）智能诱导组合物。

所述（1）间充质干细胞微囊包括：脐带间充质干细胞微囊、胎盘间充质干细胞微囊、骨髓间充质干细胞微囊，或者其他来源的间充质干细胞微囊。

所述（2）智能诱导组合物包括：（a）表皮生长因子（egf），用量为20-200ng/ml，推荐用量为25-100ng/ml，最佳浓度为50ng/ml；（b）碱性成纤维细胞生长因子（bfgf），用量为0.1-100ng/ml，推荐用量为2.5-20ng/ml，最佳浓度为10ng/ml；（c）胰岛素样生长因子-1（igf-1），用量为10-100ng/ml，推荐用量为20-50ng/ml，最佳浓度为50ng/ml；（d）血管内皮生长因子（vegf），用量为0.1-100ng/ml；推荐用量为10-20ng/ml，最佳浓度为10ng/ml；（e）促红细胞生成素（epo），用量为0.1-10u/ml，推荐用量为0.5-5u/ml，最佳浓度为1u/ml；（f）γ-干扰素（γ-ifn），用量为100-5000u/ml，推荐用量为500-2000u/ml，最佳浓度为1000u/ml；（g）抗坏血酸，用量为20-200ug/ml，推荐用量为20-100ug/ml，最佳浓度为50ug/ml。

本发明的干细胞微囊组合物在护肤品中的应用。

本发明的干细胞微囊组合物在皮肤疾病治疗药物中的应用。

本发明的优点在于：

（1）本发明提供的是一种智能改善多种皮肤问题的干细胞微囊组合物，使用本组合物可以有效刺激皮肤细胞，使自身的皮肤细胞内源性的分泌多种营养物质，从而改善各类皮肤问题，达到修复皮肤或是抗皮肤衰老的目的；

（2）本发明干细胞微囊组合物的成分明确，使用安全可靠，避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病的风险；

（3）本发明能应用于多种皮肤问题的改善，如：利用干细胞的再生能力，产生新的微血管，对应于血管萎缩老化性衰老有显著效果；能够刺激成纤维细胞产生胶原蛋白弹性纤维蛋白，重塑皮肤结构，改善皮肤皱纹；能够分泌抗炎因子，改善皮肤炎症反应，适用于痘痘或者易过敏肤质；能够活化皮肤细胞，改善皮肤色素沉着，适用于肤色斑的改善。对改善皮肤问题具有显著的效果，适用于美容护肤品或皮肤疾病治疗药物的生产制备。

附图说明

图1为透射电子显微镜观察间充质干细胞微囊的形态特征。微囊直径为50-100nm，为囊状或圆球状结构。标示：100nm。

图2为在不同培养体系中间充质干细胞分泌抗炎因子il-10的表达量。将培养至第3代的人间充质干细胞，分别悬浮于含10wt%干细胞微囊组合物的alpha-mem培养基（干细胞微囊组合物组）、含10wt%fbs的alpha-mem培养基（阴性对照组）中，培养72小时后试剂盒检测il-10表达量。纵坐标：il-10表达量。横坐标：实验分组。

图3为不同培养体系人成纤维细胞蛋白表达量。将培养至第3代的人成纤维细胞，分别悬浮于含1wt%fbs的dmem/f12（阴性对照）、含10wt%fbs的dmem/f12（阳性对照）及含10wt%干细胞微囊组合物的dmem/f12（实验组）中，培养5天后，测定培养基上清中的蛋白含量。纵坐标：od值。横坐标：实验分组。

具体实施方式

本发明提供的是一种智能改善多种皮肤问题的干细胞微囊组合物，用于美容护肤品或是皮肤疾病治疗药物的制备，尤其是干细胞相关美容护肤品的制备。

以下是利用本发明方案为基础的实施例。实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

下述实施例及试验中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1间充质干细胞分泌微囊实验

1.实验材料：脐带间充质干细胞（msc），第三代，来源于健康人。

2.实验方法：

（1）将msc悬浮于含10wt%干细胞微囊组合物的alpha-mem培养基中，按照2×10⁶个细胞/皿接种于直径为150mm的培养皿内，放置于普通二氧化碳细胞培养箱，培养时间72小时。

（2）收集培养上清，2000×g离心10min以去除细胞碎片，之后经0.45um滤膜过滤，将上清经100000×g离心2h，沉淀经pbs洗涤2h，加入含5mmol/lkcl，1mmol/lmgcl2和136mmol/lnacl缓冲液，加入体积为50ul，将微囊分装后置于-80℃备用。

3.实验结果：

结果如图1所示。在透射电子显微镜下直接观察间充质干细胞微囊的形态特征，放大10000倍照相。观察形态学表现微囊直径为50-100nm，为囊状或圆球状结构，符合膜微囊特点，表明组培养上清中获得的沉淀物均为膜微囊。

实施例2elisa检测间充质干细胞分泌抗炎因子il-10

1.实验材料：脐带间充质干细胞（msc），第三代，来源于健康人。

2.实验方法：

（1）将msc悬浮于含10wt%干细胞微囊组合物的alpha-mem培养基中作为干细胞微囊组合物组，将msc悬浮于含10wt%fbs的alpha-mem培养基中作为阴性对照组，分别按照2×10⁶个细胞/皿接种于直径为150mm的培养皿内，放置于普通二氧化碳细胞培养箱，培养时间72小时。

（2）收集培养上清，2000×g离心10min以去除细胞碎片，之后经0.45um滤膜过滤，置于-4℃备用。

（3）按试剂盒说明，用elisa法检测细胞培养上清液中il-10的浓度，在酶标仪上测定450nm处吸光度a值，求出样品中il-10浓度。

3.实验结果：

结果如图2所示。加入干细胞微囊组合物培养间充质干细胞表达il-10的表达量，显著高于阴性对照组（p<0.01）。结果显示，干细胞微囊组合物具有优良的刺激干细胞表达il-10的效果。

实施例3成纤维细胞蛋白分泌检测

1.实验材料：成纤维细胞系hef-1，第三代，来源于健康人。

2.实验方法：

（1）胰蛋白酶消化法收集人成纤维细胞，悬浮于无血清培养基中，计细胞数。调整细胞密度至2.0×10⁷cells/ml。

（2）取三个1.5mlep管，分别标示为1、2和3。按照下述表格分别加入不同的培养基。

（3）将细胞悬液转移至96孔板，每孔含20000个细胞，总体积为100µl。将细胞置于37℃，5wt%co2条件下培养5天后，收集培养上清，2000×g离心10min以去除细胞碎片，之后经0.45um滤膜过滤，置于-4℃备用。

3.实验结果：

（1）使用bradford法蛋白检测试剂盒检测蛋白含量。结果如图3所示，统计学分析显示，与阴性对照组比较，干细胞微囊组合物和阳性对照组od值显著高于阴性对照组（p<0.001）干细胞微囊组合物od值与阳性对照组od值无显著差别（p=0.05）。结果显示，干细胞微囊组合物与含10wt%fbs的dmem/f12（标准对照）比较，两者促成纤维细胞蛋白表达能力相当，说明干细胞微囊组合物具有优良的刺激干细胞蛋白表达的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。