本发明属于化妆品
技术领域：
，尤其涉及一种青龙衣染发剂及其制备方法和使用方法。
背景技术：
：目前，市场上染发剂的主流产品为苯胺类化学合成染发剂。苯胺类染发剂染发效果好、操作简便、价格低廉，但也存在一定的安全风险。采用苯胺类染发剂染发不仅会损伤头发，刺激皮肤，造成肝肾损伤，还会引发白血病和多种癌症。这是因为苯胺类染发剂中必不可少的苯二胺及其衍生物质，在染发时会经由毛孔和呼吸道进入人体，却需要六个月的时间才能逐渐通过代谢而不完全地排出。这些成分虽然在量微时对人体无害，但随着染发次数的增加，累积的剂量加上持续作用，就可能破坏造血干细胞，并引发器官组织癌变。而天然染发剂的主要成分是从天然植物中提取的，一般不会对头发产生原发性刺激，被认为安全无毒、无过敏性；从环保角度来看，天然植物染发剂对环境污染小并且可自然降解，这就使得天然植物染发日益受到人们的青睐，越来越多的化妆品、医药企业将目光投向天然色素染发剂的开发。但是由于天然色素稳定性差、着色能力弱、着色不均匀、染色保留时间短等多种原因，造成现今市场上天然色素染发剂品种较少且染发效果并不理想。因此以安全的天然色素为原料开发染色能力强、着色稳定、染色保留时间长的天然染发剂成为人们的研发热点。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种青龙衣染发剂，包括a剂和b剂；所述a剂主要由如下重量份数的各组分制备而成：核桃青皮2-10表面活性剂4-9乙醇胺2-5增稠剂2-4l-半胱氨酸4-10植物渗透剂3-6；所述a剂的ph值为6-12，所述a剂应用尿素调节ph值；所述b剂主要由如下重量份数的各组分制备而成：表面活性剂4-9抗氧化剂1-2增稠剂2-4亚铁盐3-6核桃青皮汁40-90；所述b剂的ph值为3.5-7.5。核桃青皮：又名青龙衣，为胡桃科植物核桃的果实的外果皮，具有解毒消肿的功效。本发明中用于制备a剂的核桃青皮为干燥的核桃青皮。核桃青皮汁为采用新鲜核桃青皮压榨过滤后得到的液体。本发明采用核桃青皮作为主要原料制备染发剂，核桃青皮中的多酚氧化酶(ppo)存在于核桃青皮叶绿体的类囊体和其它质体的基质中，在正常情况下呈无活性状态，当核桃青皮的细胞结构在外力或低温冻伤等情况下受到破坏时，多酚氧化酶被激活，和存在于核桃青皮的细胞液泡中的酚类物质发生反应，产生黑色和褐色物质沉淀，从而实现给头发染色的效果；同时，本发明提供的染色剂中还加入了亚铁离子，亚铁离子可以和植物活性成分发生络合反应，生成锁闭在头发内部的大分子不溶性色素，使头发颜色变深，从而进一步加强染色效果和染色的稳定性。本发明提供的青龙衣染发剂采用植物色素和植物渗透剂，安全无刺激、性能稳定、着色能力强、着色均匀、染色保留时间长，适合各种人群长期染发使用。在本发明提供的染色剂中，表面活性剂可以选用阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的任意一种或几种，包括油醇醚-5、癸基葡糖苷、十二烷基硫酸钠、甜菜碱、聚乙二醇、鲸蜡硬脂醇聚醚-20等。乙醇胺包括一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺中的任意一种或几种。增稠剂可以选用水溶性聚合物中的任意一种或几种，包括海藻酸丙二醇酯、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维钠、阿拉伯树胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、黄原胶、明胶、瓜尔豆胶等。植物渗透剂包括薄荷、川芎、肉桂、丁香、当归、桉叶、高良姜、甘草的乙醇提取液和/或水提取液中的任意一种或几种。植物渗透剂的制备方法包括：(1)乙醇提取液：以75％的乙醇为提取剂，固液比1:20，超声提取，浓缩至1/4时离心、过滤，取上清液即可；(2)水提取液：以纯水为提取剂，固液比1:20，超声提取，浓缩至1/4时离心、过滤，取上清液即可。抗氧化剂可以选择化妆品行业常用的抗氧化剂，包括异抗坏血酸、抗坏血酸、亚硫酸钠等。亚铁盐为化妆品中允许使用的任何含fe2+的盐类，包括氯化亚铁、硫酸亚铁、七水合硫酸亚铁、硝酸亚铁等。b剂的ph值采用ph值调节剂进行调节，包括柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、盐酸、硫酸中的任意一种或几种。优选的，用于制备a剂的核桃青皮先制备成核桃青皮提取液再加入a剂。优选的，核桃青皮提取液的制备方法包括：将核桃青皮粉碎后用75％乙醇浸提，料液比为1:20，过滤、浓缩获得核桃青皮提取液。青龙衣染发剂的制备方法包括：首先将核桃青皮制备成核桃青皮提取液；然后将制备a剂的其他组分加入核桃青皮提取液中，搅拌均匀，再应用尿素将ph值调至6-12之间即可获得a剂；将制备b剂的其他组分加入核桃青皮汁中，搅拌均匀，再将ph值调至3.5-7.5之间即可获得b剂。优选的，所述l-半胱氨酸为7-10份。在本发明中，l-半胱氨酸添加量过少，会影响头发染黑的效果；而l-半胱氨酸添加量过多，不会对头发染色的效果有进一步的改进。进一步的，制备所述a剂还包括0.5-2份的没食子酸或没食子酸衍生物，和/或，4-6份的单宁酸或单宁酸衍生物。在本发明提供的青龙衣染发剂中，加入没食子酸或单宁酸，或是将没食子酸和单宁酸合用，都可以使青龙衣染发剂实现将头发染成黑色的技术效果。本发明中的没食子酸衍生物为藉由水解可以游离出没食子酸的化合物。本发明中的单宁酸衍生物为藉由水解可以游离出单宁酸的化合物。进一步的，制备所述a剂还包括10-50份的五倍子。在制备本发明提供的青龙衣染发剂的原料中同时加入五倍子和核桃青皮比单独使用核桃青皮染出的头发颜色更黑。五倍子：又名百虫仓、百药煎、棓子，为同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生于漆树科植物“盐肤木”及其同属其他植物的嫩叶或叶柄，刺伤而生成一种囊状聚生物虫瘿，经烘焙干燥后所得。优选的，将五倍子制备成五倍子提取液加入a剂中。优选的，五倍子提取液可以为五倍子水提取液、五倍子乙醇提取液、或者是五倍子水提取液和五倍子乙醇提取液的1:1混合物。其中，五倍子水提取液的制备方法包括：将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于纯水中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩即可获得五倍子提取液。五倍子乙醇提取液的制备方法包括：将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于75％乙醇中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩即可获得五倍子提取液。优选的，制备所述a剂包括30-40份的五倍子。在本发明提供的青龙衣染发剂中，五倍子添加量过少，会影响头发染黑的效果；而五倍子添加量过多，则会增加成本，但是对头发染色的效果并不会有进一步的改进。进一步的，制备所述a剂还包括0.3-0.6份的黑豆皮和10-50份的五倍子。当本发明提供的青龙衣染发剂中不包含没食子酸或单宁酸时，在制备青龙衣染发剂的原料中同时加入五倍子和黑豆皮也可将头发染成黑色。黑豆皮：又名黑豆衣，为豆科植物黑豆的种子的干燥外皮。优选的，将黑豆皮制备成黑豆皮提取液加入a剂中，将五倍子制备成五倍子提取液加入a剂中。优选的，黑豆皮提取液的制备方法包括：将黑豆皮粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于10倍重量的2％的氢氧化钠溶液中，3-4天后，将浸泡液的ph调至7-8即可获得黑豆提取液。优选的，五倍子提取液可以为五倍子水提取液、五倍子乙醇提取液、或者是五倍子水提取液和五倍子乙醇提取液的1:1混合物。进一步的，在本发明提供的青龙衣染发剂中，可以加入羊毛脂、橄榄油、硅油等增脂剂或者维生素、水解蛋白等活性成分来改善染发后头发的营养状况，使头发光亮，易梳理。本发明还提供一种上述青龙衣染发剂的制备方法，包括：首先将核桃青皮制备成核桃青皮提取液；然后将制备a剂的其他组分加入核桃青皮提取液中，搅拌均匀，再应用尿素将ph值调至6-12之间即可获得a剂；将制备b剂的其他组分加入核桃青皮汁中，搅拌均匀，再将ph值调至3.5-7.5之间即可获得b剂。优选的，所述核桃青皮提取液的制备方法包括：将核桃青皮粉碎后用75％乙醇浸提，料液比为1:20，过滤、浓缩获得核桃青皮提取液。进一步的，制备所述a剂还包括0.5-2份的没食子酸或没食子酸衍生物，和/或，4-6份的单宁酸或单宁酸衍生物。进一步的，制备所述a剂还包括10-50份的五倍子，将所述五倍子制备成五倍子提取液加入所述a剂中。优选的，五倍子提取液可以为五倍子水提取液、五倍子乙醇提取液、或者是五倍子水提取液和五倍子乙醇提取液的1:1混合物。其中，五倍子水提取液的制备方法包括：将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于纯水中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩即可获得五倍子提取液。五倍子乙醇提取液的制备方法包括：将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于75％乙醇中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩即可获得五倍子提取液。优选的，五倍子的添加量为30-40份。进一步的，制备所述a剂还包括0.3-0.6份的黑豆皮和10-50份的五倍子，将所述黑豆皮制备成黑豆皮提取液加入所述a剂中，将五倍子制备成五倍子提取液加入a剂中。优选的，黑豆皮提取液的制备方法包括：将黑豆皮粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于10倍重量的2％的氢氧化钠溶液中，3-4天后，将浸泡液的ph调至7-8即可获得黑豆提取液。优选的，五倍子提取液可以为五倍子水提取液、五倍子乙醇提取液、或者是五倍子水提取液和五倍子乙醇提取液的1:1混合物。本发明还提供一种应用上述青龙衣染发剂的染发方法，包括：先将a剂均匀涂抹在头发上，在25-45℃下加热头发25-40min，然后用清水洗净头发上的a剂；头发干后将b剂均匀涂抹在头发上，在25-45℃下加热头发25-40min，再用清水洗净头发上的b剂即可完成染发。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供的青龙衣染发剂采用核桃青皮作为主要原料，应用植物色素和植物渗透剂，安全无刺激、性能稳定、着色能力强、着色均匀、染色保留时间长，适合各种人群长期染发使用。具体实施方式实施例1一种青龙衣染发剂，包括a剂和b剂；所述a剂由如下重量的各组分制备而成：核桃青皮2g癸基葡糖苷4g乙醇胺2g羟乙基纤维素2gl-半胱氨酸4g薄荷渗透剂3g；应用尿素将a剂的ph值调整为6；所述b剂由如下重量的各组分制备而成：癸基葡糖苷4g抗坏血酸1g羟乙基纤维素2g氯化亚铁3g核桃青皮汁90g；应用盐酸将b剂的ph值调整为3.5。实施例2一种青龙衣染发剂，包括a剂和b剂；所述a剂由如下重量的各组分制备而成：核桃青皮10g甜菜碱9g乙醇胺5g羧甲基纤维素钠4gl-半胱氨酸10g肉桂渗透剂6g；应用尿素将a剂的ph值调整为12；所述b剂由如下重量的各组分制备而成：甜菜碱9g亚硫酸钠2g羧甲基纤维素钠4g硝酸亚铁6g核桃青皮汁40g；应用酒石酸将b剂的ph值调整为7.5。实施例3一种青龙衣染发剂，包括a剂和b剂；所述a剂由如下重量的各组分制备而成：核桃青皮4g油醇醚-55g乙醇胺4g海藻酸丙二醇酯3gl-半胱氨酸7g丁香渗透剂4g；应用尿素将a剂的ph值调整为9；所述b剂由如下重量的各组分制备而成：油醇醚-56g异抗坏血酸1.5g海藻酸丙二醇酯3g硫酸亚铁5g核桃青皮汁60g；应用柠檬酸将b剂的ph值调整为4；青龙衣染发剂的制备方法包括：首先将核桃青皮粉碎后用75％乙醇浸提，料液比为1:20，过滤、浓缩获得核桃青皮提取液；然后将制备a剂的其他组分加入核桃青皮提取液中，搅拌均匀，再应用尿素将ph值调整为9即可获得a剂；将制备b剂的其他组分加入核桃青皮汁中，搅拌均匀，再应用柠檬酸将ph值调整为4即可获得b剂。实施例4一种青龙衣染发剂，与实施例1不同的是，制备a剂还包括0.5g的没食子酸。实施例5一种青龙衣染发剂，与实施例2不同的是，制备a剂还包括2g的没食子酸。实施例6一种青龙衣染发剂，与实施例3不同的是，制备a剂还包括1g的没食子酸。实施例7一种青龙衣染发剂，与实施例4不同的是，制备a剂还包括10g的五倍子。实施例8一种青龙衣染发剂，与实施例5不同的是，制备a剂还包括50g的五倍子。实施例9一种青龙衣染发剂，与实施例6不同的是，制备a剂还包括30g的五倍子；青龙衣染发剂的制备方法包括：将核桃青皮粉碎后用75％乙醇浸提，料液比为1:20，过滤、浓缩获得核桃青皮提取液；将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于2倍重量的纯水中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩至原体积的1/5即可获得五倍子水提取液；然后将五倍子水提取液和制备a剂的其他组分加入核桃青皮提取液中，搅拌均匀，再应用尿素将ph值调整为9即可获得a剂；将制备b剂的其他组分加入核桃青皮汁中，搅拌均匀，再应用柠檬酸将ph值调整为9即可获得b剂。实施例10一种青龙衣染发剂，与实施例7不同的是，制备a剂还包括4g的单宁酸。实施例11一种青龙衣染发剂，与实施例8不同的是，制备a剂还包括6g的单宁酸。实施例12一种青龙衣染发剂，与实施例9不同的是，制备a剂还包括5g的单宁酸。实施例13一种青龙衣染发剂，与实施例1不同的是，制备a剂还包括10g的五倍子和0.3g的黑豆皮。实施例14一种青龙衣染发剂，与实施例2不同的是，制备a剂还包括50g的五倍子和0.6g的黑豆皮。实施例15一种青龙衣染发剂，与实施例3不同的是，制备a剂还包括30g的五倍子和0.5g的黑豆皮；青龙衣染发剂的制备方法包括：将核桃青皮粉碎后用75％乙醇浸提，料液比为1:20，过滤、浓缩获得核桃青皮提取液；将黑豆皮粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于10倍重量的2％的氢氧化钠溶液中，3-4天后，将浸泡液的ph调至7-8即可获得黑豆皮提取液；将五倍子粉碎成粉末，用纱布包裹，浸泡于2倍重量的纯水中，静置24-48h，将浸泡液煮沸浓缩至原体积的1/5即可获得五倍子水提取液；然后将黑豆皮提取液、五倍子水提取液和制备a剂的其他组分加入核桃青皮提取液中，搅拌均匀，再应用尿素将ph值调整为9即可获得a剂；将制备b剂的其他组分加入核桃青皮汁中，搅拌均匀，再应用柠檬酸将ph值调整为4即可获得b剂。对比例1一种染发剂，与实施例3不同的是，采用4g氮酮代替实施例3中的4g丁香渗透剂。对比例2一种染发剂，与实施例6不同的是，制备a剂还包括10g的五倍子。对比例3一种染发剂，与实施例6不同的是，制备a剂还包括50g的五倍子。对比例4一种染发剂，与实施例9不同的是，a剂中l-半胱氨酸的添加量为5g。对比例5一种染发剂，与实施例9不同的是，a剂中l-半胱氨酸的添加量为12g。对比例6一种染发剂，与实施例3不同的是，制备a剂还包括30g的五倍子和5g的单宁酸。对比例7一种染发剂，与实施例3不同的是，制备a剂还包括30g的五倍子。对比例8一种染发剂，与实施例3不同的是，制备a剂还包括0.5g的黑豆皮。染发效果评价1.将部分实施例提供的青龙衣染发剂和对比例提供的染发剂对发束进行染色。染发方法包括：先将a剂均匀涂抹在发束上，在40℃下加热发束30min，然后用清水洗净发束上的a剂，擦干发束；再将b剂均匀涂抹在发束上，在40℃下加热发束30min，再用清水洗净发束上的b剂，擦干即可。观察经过染发剂染色后的发束颜色，结果如表1所示：表1染发剂染发颜色对比表试验序号应用染色剂发束染色后的颜色1实施例3棕色2实施例6黑色-13实施例9黑色-34实施例12黑色-35实施例15黑色-26对比例1浅棕黄色7对比例2黑色-28对比例3黑色-39对比例4黑色-210对比例5黑色-311对比例6黑色-312对比例7亚麻绿色13对比例8深棕色注：在表1中，黑色-1、黑色-2、黑色-3三种黑色的颜色依次变深，且均可以肉眼看出区别。由上述试验结果可知：(1)对比经实施例3和对比例1提供的染发剂染色的发束的颜色，虽然经过上述两种染发剂染色的发束都是棕黄色系，但实施例3提供的染发剂的着色力明显更好，使染出的发束颜色较深。由此可知本发明提供的染色剂采用丁香渗透剂这样的植物渗透剂不仅安全性好，其染色效果也比采用氮酮作为渗透剂效果更好。(2)对比经实施例6和实施例3提供的染发剂染色的发束的颜色，经实施例6提供的染发剂染色的发束是黑色，而经实施例3提供的染发剂染色的发束是棕色。由此可知在本发明提供的染发剂中加入0.5-2份的没食子酸可以使染发剂实现将头发染成黑色的技术效果。(3)对比经实施例6、实施例9、对比例2和对比例3提供的染发剂染色的发束的颜色，虽然经过上述四种染发剂染色的发束都是黑色，但是存在颜色的深浅不一样。其中，实施例9和对比例3的染发剂染色的发束黑色最深，且两者肉眼无法看出明显区别；对比例2的染发剂染色的发束的黑色深度次之；实施例6的染发剂染色的发束的黑色最浅。由此可知，在本发明提供的染发剂中加入10-50份的五倍子和核桃青皮一起作为制备a剂的原料比单独使用核桃青皮染出的发束颜色更黑，因此在本发明提供的染发剂中加入五倍子具有促进头发被染黑的效果。而五倍子的添加量也以30-40份的效果更佳，五倍子添加量过少，会影响头发染黑的效果；而五倍子添加量过多，则会增加成本，但是对头发染色的效果并没有有进一步的改进。(4)对比经实施例9、对比例4和对比例5提供的染发剂染色的发束的颜色，虽然经过上述三种染发剂染色的发束都是黑色，但是存在颜色的深浅不一样。其中，实施例9和对比例5的染发剂染色的发束黑色明显较深，且两者肉眼无法看出明显区别；而对比例4的染发剂染色的发束黑色明显偏浅。由此可知，在本发明提供的染发剂中l-半胱氨酸的添加量在7-10份之间比较合适，l-半胱氨酸添加量过少，会影响头发染黑的效果；而l-半胱氨酸添加量过多以后也不会对头发染色的效果有进一步的改进。(5)对比经实施例9、实施例12和对比例6提供的染发剂染色的发束的颜色，经过上述三种染发剂染色的发束都是黑色，且三者肉眼无法看出明显区别。由此可知，在本发明提供的染发剂中可以用单宁酸或单宁酸衍生物来代替没食子酸或没食子酸衍生物，或者将两者配合使用，可以达到相同的染发效果。(6)对比经实施例15、对比例7和对比例8提供的染发剂染色的发束的颜色，可以得出：当本发明提供的染发剂中不包含没食子酸或单宁酸时，单独在原料中添加五倍子或黑豆皮都不能将头发染成黑色，但是同时添加五倍子和黑豆皮可将头发染成黑色。2.选择四名头发黑白相间的人作为受试者，将实施例6、实施例9、实施例12和实施例15提供的染发剂分别为四名受试者染发。染发方法包括：先将a剂均匀涂抹在受试者头发上，在40℃下加热30min，然后用清水洗净头发上的a剂，擦干后再将b剂均匀涂抹在受试者的头发上，在40℃下加热30min，再用清水洗净、晾干即可。染发过程中a剂和b剂的使用量需要根据受试者的发量和发长进行调整，保证受试者的所有头发均能被a剂或b剂涂抹到。染发后，四名受试者的头发都明显变黑且颜色均匀，头发黑亮且发质未发生明显变化，四名受试者在染发后均未出现过敏或是其他不适症状；一个月后，四名受试者染过的头发均能依旧保持乌黑发亮，但发根处均可见新生出的白发。因此可知，本发明提供的青龙衣染发剂染发能力强，染发效果持久。安全性评价1.菌落总数检测(1)营养琼脂培养基的制备：1000ml纯水+1g牛肉膏+5g蛋白胨+5g氯化钠+15g琼脂→熔化→调节ph(7.2-7.4)→电热炉上沸腾两次→分装到培养皿→捆扎→灭菌(高压蒸汽灭菌15-30min)→检查灭菌情况(即28-30℃培养2-3d)。(2)样品稀释：取实施例1-15的青龙衣染发剂各1ml，分别置于灭菌试管中，用灭菌吸管吸取9ml生理盐水，注入到上述样品中(注意勿使吸管接触液面)，充分摇匀，即配成1:10的稀释液；同理可得1:100、1:1000的稀释液。(3)样品接种：取各个样品1：10、1：100、1：1000的待测液各1ml分别注入灭菌马铃薯培养基内，每个稀释度各用2个培养基，充分摇匀，置28℃培养箱中培养。(4)对培养后的样品中的菌落总数进行计数，各个样品的菌落总数计数结果均小于1000cfu/ml，符合国家化妆品卫生标准的要求。2.霉菌和酵母菌检测(1)马铃薯培养基制备：马铃薯(去皮、去芽眼)→切成片(玉米大小)→称取200g+1000mlh2o→煮沸20-30min→双层纱过滤→取滤液并补足1000ml+20g葡萄糖+20g琼脂→熔化→调节ph(自然ph)→电热炉上沸腾两次→分装到培养皿→捆扎→灭菌(高压蒸汽灭菌15-30min)→检查灭菌情况(即28-30℃培养2-3d)。(2)样品稀释：取实施例1-15的青龙衣染发剂各1ml，分别置于灭菌试管中，用灭菌吸管吸取9ml生理盐水，注入到上述样品中(注意勿使吸管接触液面)，充分摇匀，即配成1:10的稀释液；同理可得1:100、1:1000的稀释液。(3)样品接种：取各个样品1：10、1：100、1：1000的待测液各1ml分别注入灭菌马铃薯培养基内，每个稀释度各用2个培养基，充分摇匀，置28℃培养箱中培养。(4)对培养后的样品中的霉菌和酵母菌进行计数，各个样品的霉菌和酵母菌的计数结果均小于100cfu/ml，符合国家化妆品卫生标准的要求。3.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌检测(1)样品稀释：取实施例1-15的青龙衣染发剂各4ml分别置于灭菌试管中，用灭菌吸管吸取36ml生理盐水，分别注入到上述各样品中(注意勿使吸管接触液面)，充分摇匀，即配成1:10的稀释液。(2)样品分装：取上述各样品32ml于4个灭菌培养皿内，每皿8ml。(3)革兰氏染色：取片：取洁净的载玻片，将涂菌的部位通过火焰上方2-3次；涂片：先在载玻片上滴一滴无菌水，然后左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近打开棉塞；右手持接种环在火焰中灼烧灭菌，待冷却后从试管中沾取一环稀释后的样品，涂于洁净的载玻片上，最后将接种环在火焰上灼烧灭菌；晾干：自然干燥；固定：让涂菌部位朝上，通过火焰上方2-3次，使其固定(温度适宜)；染色：在涂片上滴一滴草酸铵结晶紫液，保持1-2min；水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染液；媒染：滴加1滴碘液，保持1-3min，水洗；脱色：连续滴加95％乙醇脱色20-30s至流出液没有紫色，立即水洗；复染：滴加蕃红复染10-20s，水洗，至此革兰氏染色结束。(4)镜检革兰氏染色后的各个样品，可以看到，各个样品经革兰氏染色后都被染成紫色，没有红色，因此样品中不存在革兰氏阴性菌，即没有大肠杆菌和铜绿假单胞菌。在显微镜下金黄色葡萄球菌排列成葡萄串状，而在各个样品中也未观察到类似菌落，所以样品中也不存在金黄色葡萄球菌。因此，在本发明提供的青龙衣染发剂中未检出金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和铜绿假单胞菌，符合国家卫生规范标准。最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12