本发明属于医药、保健品领域，涉及一种酸枣仁生物碱与黄酮配伍组合物及其在治疗抑郁症、失眠疾病方面的应用。
背景技术：
随着生活节奏的加快，生活和工作压力的增大，抑郁和失眠等中枢神经系统疾病已成为目前除心血管疾病、糖尿病、肿瘤之外影响人类健康的常见病、多发病。相关流行病学调查研究显示，慢性失眠症的患病率在6％～30％之间，抑郁和失眠常同时出现，60％～80％的抑郁症患者存在失眠症状，或失眠为前驱症状；而失眠可显著増加受试者抑郁症的发生率，且存在失眠症状的患者与非失眠患者相比，抑郁的患病率高3～4倍。既往失眠被认为是抑郁症的症状之一，但近来的研究发现失眠与抑郁之间可以相互预测，他们可能是双向相关的。
目前临床治疗使用的镇静催眠药和抗抑郁西药，普遍具有明显的毒副作用，服用过程中，随着病程的延长，这些毒副作用也逐渐显现，造成难以忽视的后果。由于中医药具有毒副作用小，治疗效果显著，并且适宜长期服药的需要，因此中医药对抑郁症及失眠症的治疗具有独特优势。中药有效组分配伍可以克服以原药材或粗提物为原料有效成分含量低，使用剂量大，服用不方便，疗效和安全性低等问题，易被患者接受。
传统的解郁安神中药酸枣仁(semenziziphispinosae)为鼠李科植物酸枣ziziphusjujubemil1.var.spinosa(bunge)huexh.f.chou的干燥成熟种子，主治“虚烦不眠”症，为食药两用中药，无毒副作用，兼具解郁与安神双重功效。国外常以酸枣仁泡水治疗失眠，已有研究证实，酸枣仁生物碱、皂苷、黄酮均为其有效部位，但单一有效部位的镇静催眠及抗抑郁药效具有一定局限性，表明酸枣仁中不同有效部位的功效各有不同和侧重，发挥解郁安神作用是不同部位协同作用的结果。相关专利(申请号cn201010278726)公开了一种包含酸枣仁有效部位总皂苷90-160份，酸枣仁总生物碱12-16份，酸枣仁总黄酮0-10份在制备治疗失眠症、抑郁症药物的应用，但其结果显示酸枣仁不同部位、剂量配伍的效用并非直接相关，表明酸枣仁发挥药理效用与其成分和剂量并非呈线性关系，因此其有效部位发挥药效的最佳配伍及配比需要深入研究。
本发明是在中医药整体理论指导下，以“解郁安神”为治疗原则，研制出一种以酸枣仁生物碱与黄酮配伍组合物用于防治抑郁症、失眠症。本发明与现有技术相比，本发明所述的有效部位组合物源于同一药材，具有安全性高、副作用少、作用机理相对清楚等优势，其解郁安神效果强于酸枣仁药材、酸枣仁单一部位及酸枣仁3种不同有效部位配伍组合物，因此具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种防治抑郁和失眠疾病的中药有效部位组合物，其有效部位具有协同作用，疗效显著，能满足临床上防治抑郁和失眠疾病联合用药的需求。
本发明通过如下技术方案予以实施。
本发明防治抑郁和失眠疾病的中药有效部位组合物，由酸枣仁生物碱与黄酮两种原料组成。其中，所述的酸枣仁总生物碱与总黄酮两种有效部位的重量比为1∶0.5～25。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的药物组合物中，酸枣仁总生物碱与总黄酮两种有效部位的重量比为1∶8～14。
更为优选地，本发明组合物中，酸枣仁总生物碱与总黄酮两种有效部位的重量比为1∶12。
上述总生物碱有效部位中总生物碱不低于提取物的50％(w/w)，总黄酮有效部位中总黄酮不低于提取物的60％。
本发明所述的组合物可以加入相应辅料，制成药学上可接受的剂型，所述的剂型包括但不限于丸剂、片剂、颗粒剂、口服液、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂中的任一种。然后可以再加入其他具有治疗的有效部位、有效成分、化学合成品或者半合成品，然后再加入相应辅料，制成丸剂、片剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂中的任一种。
本发明中药组合物的制备方法包括以下步骤：
(1)总生物碱的制备：取酸枣仁药材，分别以7倍量和4倍量0.5％(w/v)盐酸水溶液浸渍2次，每次24h，合并酸水提取液，滤过。提取液按照树脂量与生药量比例1∶1通过大孔吸附树脂分离，先以去离子水洗至澄清，再用2bv/h速度的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，得总生物碱，含量不得低于总提取物的50％。
(2)总黄酮的制备：提取总生物碱后的酸枣仁药材，以水洗涤，干燥后，再以70％乙醇回流提取2次，每次2h，合并乙醇提取液，减压条件下浓缩至干。提取物以1％naoh溶液洗涤3次，合并碱水液，用5％hcl调节ph5，再分别以2倍量(v/v)正丁醇萃取4～5次，合并正丁醇溶液，减压条件下浓缩干燥，得总黄酮，含量不得低于总提取物的60％。
上述大孔吸附树脂可以是x-5、ab-8、d-101型，优选x-5型。
本发明的有益之处是：本发明提供的中药组合物是从酸枣仁药材中提取出来的有效部位组合物，酸枣仁总生物碱与总黄酮联合应用后，具有明显的抗抑郁、失眠的协同作用。相比较现有的治疗抑郁失眠疾病的中药，其化学成分简单明确，易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。本发明产品成分明确，疗效稳定，服用量小，安全性高，符合中药现代化的发展要求，对推动我国中药国际化具有重要意义。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。在不违背本发明精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动或改变都将落入本发明保护范围内。
实施例1
对谷氨酸所致pc12细胞损伤保护作用的试验研究
1.试验材料
1.1药物及试剂
细胞系：pc12细胞系(来源：rattμsnorvegicμs肾上腺嗜铬细胞瘤，南京凯基生物科技发展有限公司提供)。
试剂：h-dmem细胞培养基(hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胎牛血清(hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胰酶细胞消化液(碧云天)，青霉素链霉素混合液双抗(以色列bi公司)，l-谷氨酸(klonetech，japan)。四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)(pokeweedmitogen，sigma公司)。
药物：总生物碱、总黄酮、总皂苷(实验室自制)
1.2试验仪器
超净工作台(sw-cj-2g，苏州净化)；二氧化碳培养箱(hf160w，healforce公司)；台式离心机(b600，白洋离心机厂)；酶标仪(promega，glomax-multi)；倒置显微镜(ckx41，日本olympus公司)；移液器(gilson，eppendorf)；96孔板(costar，usa)
2.试验方法
2.1受试样品对l-谷氨酸钠干预的pc12细胞增殖的影响
将pc12细胞用胰蛋白酶细胞消化液消化，培养液终止消化。吹散细胞，形成细胞悬液，计数，调节细胞密度至2×105个/ml。96孔板每孔加入180μl细胞悬液，将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中培养24h。待96孔板中的细胞长满单层后，(1)弃掉培养基，模型组每孔加入终浓度为25mm的l-谷氨酸钠200μl(溶于不完全培养基中)于培养箱内培养24h，即造成pc12细胞损伤模型。(2)弃掉培养基，给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为5μg·μl-1、10μg·μl-1、20μg·μl-1的药物和损伤液的混合液200μl，每个浓度5个复孔。以不含药物的dmem培养基为空白对照组。然后将细胞置入37℃、5％co2培养箱中继续培养24h。每孔加入15μlmtt溶液(5mg·ml-1)。37℃、5％co2孵育4h。终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜。振荡10min，使结晶物溶解。比色，选择490nm比色测定，以空白对照孔调零，在酶标记数仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
3.试验结果
pc12细胞经25mml-谷氨酸钠处理24h后，给予不同浓度测试样品后，计算出各组细胞的细胞存活率，可以反映测试样品对神经细胞的保护作用。分析实验结果可得，模型组细胞经25mml-谷氨酸钠处理24h后，与空白组相比，细胞存活率仅为45.06％，细胞受损显著(p＜0.01)，给予受试样品治疗后，各组细胞存活率均有升高，其中生物碱-黄酮1∶14、生物碱-黄酮1∶8在20μg·μl-1浓度下细胞的存活率分别上升至85.21％、86.11％(p＜0.01)。提示在20μg·μl-1浓度下酸枣仁生物碱-黄酮配伍组(1∶8、1∶14)发挥神经保护作用效果最佳。
表1各组药物对l-谷氨酸钠干预的pc12细胞增殖的影响(
注：**与模型组比较p＜0.01*与模型组比较p＜0.05
##与空白组比较p＜0.01#与空白组比较p＜0.05
实施例2
不同药物配伍组合物对cums抑郁失眠小鼠模型的药效学实验
1实验材料
1.1实验动物
健康雄性icr小鼠(体重20±2g)购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心；实验前饲养3天适应环境。室温22±2℃，相对湿度65％～70％。日光照12h，自由饮食、摄水。
1.2试剂及药品：
药品：酸枣仁皂苷、生物碱、黄酮部位(实验室自制)
2实验方法
2.1动物分组和给药
小鼠随机分成16组，每组10只，分别为空白组、模型组、文拉法辛组、解郁安神颗粒组、生物碱+黄酮组(低剂量)、生物碱+黄酮组(高剂量)、皂苷+生物碱组(低剂量)、皂苷+生物碱组(高剂量)、皂苷+黄酮组(低剂量)、皂苷+黄酮组(高剂量)、黄酮组、生物碱组、皂苷组、皂苷+生物碱+黄酮组(低剂量)、皂苷+生物碱+黄酮组(高剂量)、药材水煎组。除空白组外，其余各组按照“2.2”方法造模；并于每日上午8：00～9：00灌胃一次，给药体积0.1ml·10g-1。
表2动物分组及给药方案
2.2cums抑郁失眠小鼠模型的建立方法
在21天内按随机安排10种应激因素，每天给予任意两种刺激，为避免小鼠产生适应性平均每种刺激给予4次。
表3慢性应激小鼠模型建立日程表
2.3观测指标及方法
(1)体重
测量小鼠在实验过程中的体重变化，即第1天，第10天，第21天的体重，并计算出各组小鼠体重增长量。
(2)悬尾实验(tst)
将小鼠尾端贴在一水平木棍上，木棍离地使动物呈悬空倒挂状，悬挂两侧用隔板挡住小鼠视线。动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。实验进行6min，记录后4min内的不动时间。
(3)强迫游泳实验(fst)
将小鼠单独放入盛有深10cm以上、温度45℃水的透明玻璃缸中，实验进行6min。小鼠为挣扎逃跑至感觉无望后即停止挣扎，仅将头露出水面四肢呈不动状态，记录后4min内小鼠的不动时间。
(4)戊巴比妥钠协同作用实验
在动物实验的第8天灌胃0.5h后腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠，剂量为28mg/kg。记录各组小鼠出现睡眠的只数。第9天灌胃0.5h后腹腔注射阈上剂量戊巴比妥钠，剂量为38mg/kg。注射后开始计时，记录睡眠潜伏期及睡眠时间。以翻正反射消失时为睡眠开始时间，翻正反射恢复为睡眠结束时间。腹腔注射后到睡眠开始时间为睡眠潜伏期，潜伏期超过15min按15min记录。
3结果
3.1不同药物配伍组合物对cums抑郁失眠小鼠体重的影响
由表4可知，模型组小鼠体重明显低于空白对照组小鼠体重，各给药组小鼠体重则高于模型组小鼠体重，其中除黄酮高剂量组除外，其余各组与模型组数据均具有显著统计学差异(p＜0.01)。生物碱低+黄酮组小鼠体重增加最多，与阳性对照药文拉法辛组相当。
表4酸枣仁皂苷不同配伍对小鼠体重的影响(
注：
3.2不同药物配伍组合物对cums小鼠tst实验不动时间的影响
模型组与空白组小鼠tst不动时间相比明显增加。阳性药组、生物碱+黄酮组(低剂量)、药材水煎组的tst不动时间均低于模型组，差异具有统计学意义(p＜0.01或p＜0.05)。黄酮高剂量组和生物碱组、皂苷+生物碱、皂苷+黄酮不同配伍组与模型组数据无统计学差异，结果见表5。
表5酸枣仁皂苷与不同组分配伍对小鼠tst不动时间的影响(
注：
3.3不同药物配伍组合物对cums小鼠fst实验不动时间的影响
由表6结果可知，阳性药组、生物碱+黄酮组(低剂量)组小鼠fst不动时间与模型组相比较明显降低，具有显著统计学差异(p＜0.01)，黄酮低剂量组、生物碱+黄酮组(高剂量)组、药材水煎组数据与模型组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。特别是生物碱+黄酮组(低剂量)组与模型对照组相比，小鼠不动时间减少百分率达到36.47％(p＜0.01)。而黄酮高剂量组、生物碱组、皂苷+生物碱、皂苷+黄酮不同配伍组与模型组相比无统计学差异。
表6各给药组对小鼠强迫游泳不动时间的影响(
注：
3.4不同药物配伍组合物对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠实验的影响
表7各给药组对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠实验的影响
3.5不同药物配伍组合物对阈上剂量戊巴比妥钠协同作用的影响
由表8数据显示，各给药组的睡眠潜伏期时间均短于模型组，睡眠时间均长于模型组，数据差异均存在统计学意义(p＜0.01，p＜0.05)。其中，生物碱+黄酮组(低剂量)组的睡眠潜伏期时间短于阳性药组，睡眠时间长于阳性药组，且与空白组时间均最为接近，表明在此配比下生物碱和黄酮有显著协同催眠作用。
表8各给药组对小鼠阈上剂量戊巴比妥钠实验的影响(
注：
实施例3
生物碱-黄酮不同配比组合物对cums抑郁失眠小鼠的药效学影响
1实验材料
1.1实验动物
同实施例1
1.2试剂及药品：
药品：酸枣仁生物碱、黄酮部位(实验室自制)
2实验方法
2.1动物分组和给药
小鼠随机分成13组，每组10只，分别设置空白组、西药阳性组、中成药阳性组以及各给药组。除空白组外，其余各组小鼠均按实施例1项下方法造模，从造模的第一天开始每天早上8：00-9：00灌胃给药，一天一次，持续21天，分组及给药方案见表9。
表9动物分组及给药方案
注：生物碱-黄酮低剂量组相当于酸枣仁6g·kg-1，生物碱-黄酮中剂量组相当于酸枣仁12g·kg-1，生物碱-黄酮高剂量组相当于酸枣仁24g·kg-1，黄酮量组相当于酸枣仁10g·kg-1，生物碱组相当于酸枣仁1.6g·kg-1，生物碱-黄酮-皂苷组相当于酸枣仁13.2g·kg-1。
2.2cums抑郁失眠小鼠模型的建立方法同实施例1项下内容。
2.3观测指标及方法同实施例1项下内容。
3实验结果
3.1酸枣仁生物碱-黄酮配伍对cums抑郁失眠小鼠体重的影响
实验结果显示：实验从第1天到第21天，各组小鼠的体重都呈缓慢增长趋势。与模型组相比，除阳性颗粒剂组除外，酸枣仁各给药组均有统计学意义(p＜0.01)，而酸枣仁三组分配伍组小鼠体重增长低于酸枣仁生物碱和黄酮配伍组。与空白组小鼠相比较，模型组小鼠体重增长缓慢，差异具有显著性(p＜0.01)，其中，酸枣仁生物碱-黄酮(1∶14)中剂量组、黄酮组、生物碱组的小鼠体重均明显增长，与空白组体重增长水平相当，见表10。
表10各给药组对cums小鼠体重的影响(
*与模型比较p＜0.05**与模型组比较p＜0.01
3.2酸枣仁生物碱-黄酮配伍对cums抑郁失眠小鼠糖水摄入量的影响
模型组小鼠的糖水摄入量较空白组明显减少，而其他各给药组的糖水摄入量均与空白组量相当，且较模型组均有增加趋势，但差异无统计学意义。
表11各给药组小鼠糖水偏好程度影响(
3.3酸枣仁生物碱-黄酮配伍对cums抑郁失眠小鼠tst不动时间的影响
由表12显示，阳性组及各给药组的小鼠悬尾不动时间均小于模型组，且差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。各给药组小鼠的悬尾不动时间减少百分比均具有统计学意义，各给药组的悬尾不动时间减少百分比均较阳性组有所增加。其中，生物碱-黄酮(1∶14)中剂量组、生物碱-黄酮(1∶12)中剂量组、生物碱-黄酮(1∶8)中剂量组、黄酮组、生物碱组的悬尾不动时间减少百分比均明显高于生物碱+黄酮+皂苷低剂量组、高剂量组，且生物碱-黄酮(1∶14)中剂量组与空白组相当。
表12各组小鼠对cums小鼠tst不动时间的影响(
*与模型比较p＜0.05**与模型组比较p＜0.01
3.4酸枣仁生物碱-黄酮配伍对cums抑郁失眠小鼠fst实验不动时间的影响
由表13可见，与模型组相比，除生物碱+黄酮+皂苷低剂量组除外，阳性组及各给药组的游泳不动时间均有显著降低，且数据差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。其中，空白组的强迫游泳不动时间明显低于模型组；生物碱+黄酮+皂苷低剂量组的强迫游泳不动时间减少百分比与模型组无显著差异，中成药阳性组及给药组与模型组相比具有显著差异(p＜0.05或p＜0.01)。生物碱-黄酮配伍组的不动时间减少百分比显著高于模型组，且高于生物碱+黄酮+皂苷低剂量组和高剂量组。
表13各给药组对cums小鼠fst不动时间的影响(
*与模型比较p＜0.05**与模型组比较p＜0.01
3.5酸枣仁生物碱-黄酮配伍对阈下剂量戊巴比妥钠协同作用的影响
由表14实验结果显示，与模型组相比各给药组的睡眠只数百分比均明显升高，且生物碱和黄酮各不同配比组的睡眠百分比高于生物碱和黄酮单独给药组，表明酸枣仁生物碱和黄酮配伍具有协同安神作用。
表14各给药组对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠实验的影响
3.6酸枣仁生物碱-黄酮配伍对阈上剂量戊巴比妥钠协同作用的影响
由表15数据显示，各给药组的睡眠潜伏期时间均短于模型组，数据差异均存在统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。其中，生物碱-黄酮(1∶14)中剂量组、生物碱-黄酮(1∶8)中剂量组、生物碱-黄酮(1∶8)高剂量组的睡眠潜伏期时间与模型组比较差异更明显，表明在此配比下生物碱和黄酮的协同作用较强。通过比较各给药组与模型组的睡眠时间得出，给药组比模型组的睡眠时间明显延长，且差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)，其中生物碱-黄酮(1∶14)中剂量组的睡眠时间最长。综合各组睡眠潜伏期与睡眠时间结果发现，生物碱和黄酮配伍具有显著协同催眠作用。
表15各给药组对小鼠阈上剂量戊巴比妥钠实验
*与模型比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01
实施例4
生物碱-黄酮不同配比组合物对cums抑郁失眠小鼠作用机制研究
1实验材料
1.1实验动物
同实施例3
1.2试剂及药品：
小鼠γ-氨基丁酸(gaba)酶联免疫分析试上海酶联生物科技有限公司
剂盒
小鼠谷氨酸(glu)酶联免疫分析试剂盒上海酶联生物科技有限公司
小鼠神经营养因子酶联免疫分析试剂盒上海酶联生物科技有限公司
1.3仪器
酶标仪promega，glomax-multi
离心机eppendorf，centrifuge5810r
2实验方法
2.1动物分组和给药
分组及给药方案同实施例3项下。
2.2脑组织匀浆的制备
各组小鼠于末次给药30min后，给予1min悬尾刺激。刺激后立即断头处死，取小鼠全脑放入ep管中，加1mlpbs研磨均匀，低温离心后取上清液。
2.3测定方法
采用酶标仪测定od值。
3实验结果
3.1酸枣仁生物碱-黄酮不同配比组合物对小鼠脑内谷氨酸含量影响
结果显示，各给药组与阳性药组小鼠脑内的glu含量均低于模型组，且差异具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。与空白组相比，阳性药组与各给药组小鼠脑内glu含量无显著差异。
同时，酸枣仁生物碱与黄酮配伍组小鼠脑内glu含量均值低于阳性药组以及酸枣仁生物碱-黄酮-皂苷三组分配伍组，且低于生物碱和黄酮单独组分，但数据并无显著性差异。结果显示生物碱与黄酮配伍对小鼠脑内glu含量影响相对明显。
表16各组小鼠脑内glu含量
*与模型比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01
3.2酸枣仁生物碱-黄酮不同配比组合物对小鼠脑内gaba含量影响
各给药组小鼠脑内gaba含量水平均高于模型组，其中生物碱+黄酮+皂苷低剂量组有统计学意义(p＜0.05)，其余各给药组与模型组差异存在显著统计学意义(p＜0.01)。阳性药组与模型组比较差异无统计学意义。
与空白组比较可得，模型组和阳性药组均与空白组数据具有显著统计学意义(p＜0.01)，生物碱+黄酮+皂苷高剂量组小鼠脑内gaba水平具有统计学意义(p＜0.05)，而其余各给药组无统计学差异。
表17各组小鼠脑内gaba含量(ng·ml-1)
*与模型比较p＜0.05**与模型组比较p＜0.01
☆与空白组比较p＜0.05☆☆与空白组比较p＜0.01
3.2酸枣仁生物碱-黄酮不同配比组合物对小鼠脑内gaba含量影响
由表18可得，与模型对照组相比，空白组及各给药组小鼠脑内bdnf含量均有增高趋势，且数据具有显著统计学意义(p＜0.01)。与空白组比较，各给药组数据无统计学差异。
表18各组小鼠脑内bdnf含量
*与模型比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01。