本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及一种化疗后消化道不良反应的模型建立方法、模型和应用。
背景技术：
结肠癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤，主要发生部位为直肠与乙状结肠交接处。近年来，结肠癌在欧美发达国家发病率占癌症发病率的第四位，死亡率为第二位。随着生活方式的改变，我国结肠癌患者数量不断增长，剧流行病学统计，以每年4.2％速度迅速增长，年均新发结肠癌病例超过17万，甚至超过全球平均递增水平，排在恶性肿瘤和致死病因的第四位，已成为威胁我国人民身体健康的恶性肿瘤之一。结肠癌的发病原因尚未完全阐明，导致结肠癌的发病因素主要包括环境、遗传、疾病等因素，结肠癌的发生发展往往是多因素、多步骤、内外因交互作用的结果。
目前，癌症治疗所面临的首要问题就是局部复发癌症的有效治疗和转移性癌的治疗。治疗的首要目标是通过手术彻底的切除病变组织，视疾病的严重程度，进一步的辅助化疗或放疗。根据2017年ncci临床治疗方案，针对结肠癌治疗的方案有如下几种：5-氟尿嘧啶/lv、卡培他滨、卡培他滨+奥沙利铂、folfiri方案(5-氟尿嘧啶+伊立替康+lv)、folfox方案(lv+5fu+奥沙利铂)、folfoxiri方案(lv+5fu+奥沙利铂)、伊立替康等。在众多的治疗方案中，以5-氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂三种化疗药的使用频率最高，这些化疗药在治疗结肠癌时，会伴随着严重的胃肠道毒副作用：dna烷化剂类化疗药，例如顺铂、环磷酰胺和奥沙利铂对胃肠道毒副作用包括可引起恶心、呕吐、腹泻或便秘；抗代谢药类化疗药例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨和甲氨蝶呤对胃肠道毒副作用包括可引起恶心、呕吐、腹泻或腹痛；拓扑异构酶抑制剂伊立替康对胃肠道毒副作用包括可引起恶心、呕吐和剧烈的延迟性腹泻。毒副作用不仅影响患者生存质量，更会限制化疗药的治疗效果。因此建立一种在使用化疗药进行化疗后的消化道不良反应的模型对研制缓解化疗后的消化道不良反应的药物是十分重要的。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种化疗后消化道不良反应的模型建立方法；本发明的第二目的在于提供一种使用上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法建立的模型；本发明的第三目的在于提供上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法或由上述方法得到的模型在制备用于减轻化疗后副作用的药物的应用，缓解了现有技术中存在的缺少一种化疗后消化道不良反应的模型建立方法的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
一种化疗后消化道不良反应的模型建立方法，所述模型建立方法包括：筛选化疗药物的给药剂量，然后按照筛选出的给药剂量对动物肿瘤模型进行化疗处理，获得化疗后消化道不良反应的模型；
所述筛选化疗药物的给药剂量包括对经过化疗药物处理的动物肿瘤模型进行肠毒性评价，得到动物肿瘤模型出现消化道具有不良反应时的给药剂量。
优选地，所述化疗药物包括顺铂、环磷酰胺、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和伊立替康中的一种或者多种；优选为伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和甲氨蝶呤中的一种或多种。
优选地，所述肠毒性评价包括测定动物的生存率，肠道推进率和动物肿瘤模型的排便情况。
优选地，所述动物肿瘤模型包括接种了癌细胞的小鼠；
优选地，所述癌细胞的来源包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和肝癌中的至少一种；
优选地，所述癌细胞包括小鼠结肠癌细胞。
本发明还提供名了一种使用上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法建立的模型。
优选地，所述模型为使用化疗药物连续给药的荷瘤小鼠；所述化疗药物包括伊立替康或奥沙利铂。
优选地，所述荷瘤小鼠为ct荷瘤balb/c小鼠。
优选地，所述伊立替康的给药剂量为60-80mg/kg；优选为70-80mg/kg；更优选为75mg/kg。
优选地，所述奥沙利铂的给药剂量为4-6mg/kg；优选为4.5-5.5mg/kg；更优选为5mg/kg。
本发明还提供了上述模型建立方法或上述动物肿瘤模型在制备用于减轻化疗后副作用的药物的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的化疗后消化道不良反应的模型建立方法，通过筛选化疗药物的给药剂量，然后按照筛选出的给药剂量对动物肿瘤模型进行化疗处理，获得化疗后消化道不良反应的模型；其中筛选化疗药物的给药剂量包括对经过化疗药物处理的动物肿瘤模型进行肠毒性评价，得到动物肿瘤模型出现消化道具有不良反应时的给药剂量。
该方法得到的模型出现的消化道的不良症状是由化疗药物造成的，因此将该种模型用于研发缓解化疗后消化道不良反应的药物时，模型的症状更接近于实际的病理现象，有利于精准的筛选出药物和研究筛选出的药物的缓解化疗后消化道不良反应的机理。基于上述发明构思，本发明还提供了一种使用上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法建立的模型和上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法或由上述方法得到的模型在制备用于减轻化疗后副作用的药物的应用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种化疗后消化道不良反应的模型建立方法，该模型建立方法包括：筛选化疗药物的给药剂量和给药时间，然后按照筛选出的给药剂量和给药时间对动物肿瘤模型进行化疗处理，获得化疗后消化道不良反应的模型；
所述筛选化疗药物的给药剂量和给药时间包括对经过化疗药物处理的动物肿瘤模型进行肠毒性评价，得到动物肿瘤模型出现消化道具有不良反应时的给药剂量和给药时间。
化疗药物在治疗癌症时，常会伴随着消化道的不良反应，例如恶心、呕吐、腹泻或腹痛等，因此对可以缓解化疗后消化道不良反应的药物是十分需要的，但是在研制可以缓解化疗后消化道不良反应的药物时，由于缺少化疗后消化道不良反应的模型，导致研制出的可缓解一般的消化不良的病症的药物不适用或不完全适用于化疗导致的消化不良的症状。本发明提供的化疗后消化道不良反应的模型建立方法，可以得到化疗后具有消化道不良反应的动物肿瘤模型，以进一步用于制备缓解化疗后消化道不良反应的药物，该方法操作简单，适合多种化疗药物与多种实验动物。并且该方法得到的模型出现的消化道的不良症状是由化疗药物造成的，因此将该种模型用于研发缓解化疗后消化道不良反应的药物时，模型的症状更接近于实际的病理现象，有利于精准的筛选出药物和研究筛选出的药物的缓解化疗后消化道不良反应的机理。
在一些可选的实施方式中，所述化疗药物包括顺铂、环磷酰胺、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和伊立替康中的一种或者多种。上述药物均为nccn患者临床化疗方案中包含的药物，上述药物或药物的组合常用于癌症的化疗，可化疗的癌症类型包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌和肝癌等，且上述化疗药物中均会产生恶心、呕吐、腹泻或便秘等消化道不良反应。因此以上述药物作为建立化疗后消化道不良反应的模型适用于多种癌症化疗后造成的消化道不良反应的模型。
其中，伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和甲氨蝶呤为常用化疗药物，广泛用于癌症治疗中，因此在一些优选的实施方式中，所述化疗药物包括伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和甲氨蝶呤中的一种或多种。
伊立替康(cpt-11)属于细胞毒类抗癌药物中的喜树碱类，是一种dna拓扑异构酶(ⅰ)抑制剂，可使抑制dna重连步骤，dna链断裂，dna复制和rna合成受阻，进而出现细胞凋亡，抑制细胞分裂。伊立替康是小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤常用有效化疗药物之一。伊立替康对肠粘膜的毒附作用主要表现为迟发型腹泻，腹泻的发生率高达82％。
奥沙利铂化学名为化学名为(1r,2r)-1,2-二氨环己烷草酸根合铂，是一种有广谱抗肿瘤活性的第三代铂类药物，临床多用于转移性结、直肠癌的治疗。奥沙利铂的作用靶点是dna分子，可抑制dna的合成及复制。奥沙利铂对肠道的毒副作用为可引起恶心、呕吐和腹泻。
5-氟尿嘧啶为尿嘧啶衍生物，为胸苷酸合成酶(ts)抑制剂，在体内转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5f-dump)，可使快速分裂的肿瘤细胞因为胸腺嘧啶缺陷致死。5-氟尿嘧啶抗肿瘤作用广泛，对绒毛膜上皮癌恶性葡萄胎疗效显著，对消化系统肿瘤，例如食道癌、胃癌、肠癌、胰腺癌和肝癌，和乳腺癌治疗效果好。5-氟尿嘧啶可引起骨髓抑制，黏膜炎，腹泻，心脏毒性，中枢神经毒性，脱发，皮肤色素沉着，肝损伤等。
环磷酰胺是一种氮芥类化合物，为细胞周期非特异性氮芥类细胞毒药物，环磷酰胺进入机体后经肝脏微粒体细胞色素p450氧化，活化为4-羟基环磷酰胺，在肿瘤细胞中可分解成对瘤细胞有强烈毒性的磷酰氮芥和丙烯醛，从而起到抗肿瘤的作用。环磷酰胺对肠道的毒副作用为可引起恶心、呕吐、腹痛和腹泻。
甲氨蝶呤化学名为l-(+)-n-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]谷氨酸，其作用机制为通过对二氢叶酸还原酶的抑制，导致二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，而使嘌呤和胸苷酸合成受阻，达到阻碍肿瘤细胞dna和rna合成的目的，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。甲氨蝶呤对肠道的毒副作用为可引起恶心、呕吐、腹痛和腹泻。
在一些可选的实施方式中，所述肠毒性评价包括测定动物的生存率，肠道推进率和动物肿瘤模型的排便情况。
化疗药物剂量过大会导致实验动物死亡，因此测定动物的生存率，以确定合适的化疗药物的剂量，避免实验动物进行化疗处理时由于化疗药物对实验动物毒性过大或剂量过大造成死亡。
肠道推进率实验是指通过测定给药后一定时间内标记物在动物胃肠道内的移动距离，观察药物对胃肠蠕动的影响，测定肠推进率可以定量的评价化疗药物对消化道的副作用，并辅以对动物肿瘤模型的排便情况进行观察，以确定实验动物是否出现化疗后的消化道不良反应。在一些可选的实施方式中，肠推进率的测定方法例如可以为但不限于为碳末推进法、酚红法、葡聚糖蓝法、baso法或塑料球灌胃法等。
由于小鼠体积小，饲养管理方便，易于控制，并且生产繁殖快，拥有大量的具有不同特点的近交系、突变系和封闭群，并已形成多种国际公认的标准品系，被广泛应用于各种营养学实验研究中，因此优选以接种了癌细胞的小鼠作为动物肿瘤模型；优选地，所述癌细胞的来源包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和肝癌中的至少一种；所述癌细胞优选包括小鼠结肠癌细胞。
本发明还提供了一种使用上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法建立的模型，通过上述方法建立的模型，实验动物可以出现化疗后消化道的不良反应，以进一步用于减轻不良反应的药物的实验和研究。
在一些优选的实施方式中，所述模型为使用化疗药物连续给药的荷瘤小鼠；其中所述化疗药物包括伊立替康或奥沙利铂，伊立替康或奥沙利铂可以造成荷瘤小鼠化疗后的肠道不良反应，又不会导致小鼠大量死亡，因此优选伊立替康或奥沙利铂作为化疗药物。更优选地，所述模型为以化疗药物连续给药一周的ct荷瘤balb/c小鼠，该模型下荷瘤balb/c小鼠可在保持存活的条件下出现化疗后的消化道不良反应，可以应用于进一步的对减轻化疗后消化道不良反应的药物的研究和实验。ct荷瘤balb/c小鼠为接种小鼠结肠癌细胞的balb/c小鼠。其中优选地，伊立替康的给药剂量为60-80mg/kg；例如可以为但不限于为60mg/kg、62mg/kg、65mg/kg、67.5mg/kg、70mg/kg、72.5mg/kg、75mg/kg、77.5mg/kg或80mg/kg；优选为70-80mg/kg；更优选为75mg/kg；优选地，奥沙利铂的给药剂量为4-6mg/kg，例如可以为但不限于为4mg/kg、4.2mg/kg、4.5mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、5mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.8mg/kg或6mg/kg；优选为4.5-5.5mg/kg；更优选为5mg/kg。通过调整和优化伊立替康和奥沙利铂的给药剂量可以进一步调整ct荷瘤balb/c小鼠的化疗后消化道不良反应的症状的严重程度。
本发明还提供了上述化疗后消化道不良反应的模型建立方法或由上述方法得到的模型在制备用于减轻化疗后副作用的药物的应用，例如可以为但不限于为用于制备减轻肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌和肝癌化疗后消化道不良的副作用的药物的制备。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例
实验药品：
奥沙利铂(50mg/瓶)(江苏恒瑞医药股份有限公司)，5-氟尿嘧啶(100mg/10ml)(江苏恒瑞医药股份有限公司)，注射用盐酸伊立替康(40mg/瓶)(江苏恒瑞医药股份有限公司)，环磷酰胺(20mg/瓶)，甲胺蝶呤(50mg/瓶)。
给药方案：
将ct荷瘤balb/c小鼠分为九组，选用伊立替康、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺及甲氨蝶呤多类化疗药，除空白组外腹腔注射化疗药，每日给药一次，观察小鼠在给药过程中的生存状况及排便情况，最后以十天后各组小鼠生存率、肠推进率评价各类化疗药引起荷瘤小鼠的肠毒性评价，给药剂量如表1所示：
表1各类化疗药的给药剂量
肠推进率测定：
采用苦味酸标记动物。连续给药，末次给药前禁食24h，末次给药后30min，除空白组外其余各组分别腹腔注射化疗药，15min后，各组灌胃给药0.05％的酚红溶液(0.3ml/只)，20min后，颈椎脱颈法处死，取贲门至直肠末端取肠，取出小肠分离肠系膜，剪取幽门至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量酚红前进的距离。
小肠推进率(intestinaltransit)％＝酚红前进的距离/小肠的全长×100％
实验结果：
伊立替康高剂量组，在给药48h后死亡，低剂量在给药7天后死亡，大剂量的伊立替康造成的腹泻模型中，造成小鼠生存期短，无法对其抑瘤效果有较好的评估。
奥沙利铂持续给药后，高剂量组在第四天全部死亡，较低的生存率影响药效的评定，而低剂量组存活率100％，在第七天后对其排便及肠推进率进行观察，发现在给予奥沙利铂组的小鼠粪便呈小结状，颜色深，提示着小鼠存在排便异常情况，故选择低剂量组作为造模条件。
5-氟尿嘧啶组高剂量在给药四天后死亡，低剂量组在七天后死亡，可观察到明显的腹泻现象。
甲氨蝶呤在给药7天后全组死亡，且未观察到腹泻现象。
环磷酰胺在给药十天后未有明显的状态的改变，根据文献提示，甲氨蝶呤与环磷酰胺不宜作为结肠癌的治疗药物。
在肠推进实验中，空白小鼠的肠推进率为52.3％，伊立替康低剂量组给药七天后测得肠推进率为88.6％，奥沙利铂低剂量组肠推进率为72.9％。依据nccn临床治疗方案及所引起的肠毒性模型的评估，最终确定以伊立替康、奥沙利铂为治疗ct26荷瘤小鼠模型，且伊立替康确定的最大给药剂量为75mg/kg，连续给药一周；奥沙利铂最大给药剂量为5mg/kg，连续给药一周。
通过对多种化疗药引起荷瘤小鼠的肠毒性模型的评估，最后确定造模的初步条件，条件如下：伊立替康给药剂量为75mg/kg，连续给药一周；奥沙利铂给药剂量确定为5mg/kg，连续给药一周。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。