人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用的制作方法

本发明涉及一种间充质干细胞，特别是一种人体子宫内膜来源的间充质干细胞。本发明的人子宫内膜间充质干细胞能够改善损伤心肌细胞的活性和功能，从而可以更好地修复因心肌细胞功能障碍所致的心脏疾病。

背景技术：

随着经济的加速发展，人类生活方式和饮食结构不断发生变化，冠状动脉粥样硬化性心脏病呈持续增长趋势。其可以引起局部心肌细胞凋亡、心肌细胞纤维化、能量代谢障碍等，最终发生心力衰竭。而心力衰竭严重影响人们的生活质量，是造成人类死亡的重要原因。

干细胞是一种具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，具有修复受损组织细胞的潜能，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的种子细胞，是各种疾病尤其是各种难治性疾病可能的新的有效治疗方法。

再生医学不断发展，干细胞移植修复损伤心肌细胞已成为心血管系统疾病最有前景的治疗方法。其中，心肌功能的重塑是关键，包括心肌细胞活性的改善、心肌细胞能量代谢的改善、心肌纤维化的改善等。

通过再生医学能够达到有效改善损伤心肌活性和功能的理想种子细胞，除了应具有增殖能力强，分化良好，免疫原性低，容易获取以及分泌能力强大等特点外，最主要的是应该具有强的成血管能力。

201810930181.6专利申请涉及一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，其从人子宫内膜组织中分离培养得到一种具有强修复再生能力的人子宫内膜间充质干细胞，并证明该间充质干细胞具有更强的增殖能力，即具有更强的活力，具备快速获得更多种子细胞的能力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供人子宫内膜间充质干细胞在改善损伤心肌细胞上的应用。

发明人通过小鼠研究显示，结扎小鼠左冠状动脉后，小鼠的子宫细胞归巢到心肌损伤区参与心肌细胞修复并改善心功能，以及子宫源性的细胞能显著增加血管形成。因此，在人体子宫中存在具有强修复再生能力的干细胞。

发明人已经从人体的子宫内膜组织中分离培养出人子宫内膜间充质干细胞。本发明进一步验证了这种人子宫内膜间充质干细胞具有更强的促血管形成能力，可以更好的改善损伤心肌细胞活性、改善损伤心肌能量代谢及纤维化程度。

基于此，本发明将所培养得到的人子宫内膜间充质干细胞作为改善损伤心肌细胞的药物进行应用。

具体地，本发明是将培养出的人子宫内膜间充质干细胞用pbs重悬后，混匀制成用于改善损伤心肌细胞的人子宫内膜间充质干细胞制剂。

更具体地，本发明是采用培养出的p3～p6代人子宫内膜间充质干细胞制备所述人子宫内膜间充质干细胞制剂。

本发明所制备的人子宫内膜间充质干细胞制剂中，优选每1ml干细胞制剂中含有(3～7)×10⁷个人子宫内膜间充质干细胞。

本发明从体外和在体两方面进行了上述人子宫内膜间充质干细胞制剂改善损伤心肌细胞活性和功能的验证研究。

将添加有人子宫内膜间充质干细胞培养上清的脐静脉内皮细胞单细胞悬液接种于matrigel基质胶上，通过体外实验证明了人子宫内膜间充质干细胞可以促进脐静脉内皮细胞在matrigel上的小管形成。

结扎裸大鼠冠状动脉左前降支进行造模，向造模成功裸大鼠的心肌损伤局部注射人子宫内膜间充质干细胞制剂，心脏彩超观察心功能变化、pet-ct观察心肌细胞活性及能量代谢、masson染色观察纤维化程度，通过在体实验证明人子宫内膜间充质干细胞制剂可以通过更好的改善损伤心肌细胞活性、能量代谢及纤维化程度，起到更好的修复损伤心肌的作用。

附图说明

图1是人子宫内膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞体外促血管形成的形态图。

图2是超声心动图评估各组造模前后裸大鼠的左室心功能变化结果。

图3是pet-ct评估各组造模前后裸大鼠的心肌细胞活性和能量代谢效果。

图4是masson三色染色后显示各组裸大鼠治疗后损伤心肌区的纤维化变化情况。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：制备人子宫内膜间充质干细胞制剂。

将人子宫内膜间充质干细胞用含1%青链霉素的10%fbs-dmem/f12培养基进行培养，将培养瓶放入37℃5%co2的培养箱中，每3～4天更换培养基。待细胞融合达到80～90%时，0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%edta)消化，以1∶3的比例传代，得到第1代人子宫内膜间充质干细胞，记为p1。重复上次操作，制备得到p3～p6代人子宫内膜间充质干细胞。

选取生长状态良好的p3～p6代细胞，细胞融合达到80～90%时，用pbs缓冲液冲洗3遍，洗干净fbs后，加入0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%edta)消化3～4min，显微镜下观察细胞变圆，加入10%fbs-dmem/f12终止消化，吸入15ml离心管中离心，弃上清保留细胞团。

将所得细胞团用pbs液清洗残留血清后，用pbs液以(3～7)×10⁷/ml的浓度重悬，制备得到(3～7)×10⁶/100µl的人子宫内膜间充质干细胞制剂。

以上制备人子宫内膜间充质干细胞制剂的所有操作均在无菌操作台中操作，并且在制作、运输、使用中均执行无菌操作原则。

实施例2：人子宫内膜间充质干细胞matrigel基质胶体外促血管形成实验。

以人子宫内膜间充质干细胞作为实验组，人骨髓间充质干细胞作为对照组。

取人子宫内膜间充质干细胞和人骨髓间充质干细胞，分别接种在12孔板上，以10%fbs-dmem/f12或10%fbs-imdm正常培养基培养，待细胞生长至70～80%融合时，更换为2%fbs-dmem/f12。同时在空白板中加入2%fbs-dmem/f12作为空白组。

以上各组继续培养4天后，收集各组细胞培养上清，进行体外管状结构形成实验。

实验前，将matrigel基质胶置于4℃冰箱内过夜，融化为液体状态。加样的枪头、96孔板在-20℃冰箱过夜，保持低温。

以预冷的枪头吸取100µlmatrigel，铺于预冷的96孔细胞培养板中，以上所有操作均在冰上进行。

铺板完毕后，将96孔细胞培养板置于37℃，5%co2的培养箱内孵育45min以上，使之凝固。

在凝胶等待中，0.05%胰酶消化人脐静脉内皮细胞，以上述收集的各组细胞培养上清制备人脐静脉内皮细胞悬液。

细胞计数，将细胞悬液制备成3×10⁵/ml，每孔以3×10⁴个细胞接种于上述用matrigel基质胶铺好的96孔细胞培养板上，置于37℃，5%co2的培养箱内孵育。

培养3h后，倒置显微镜下观察内皮细胞在matrigel上的小管形成状态并拍照，结果见图1。

图1中a为人子宫内膜间充质干细胞上清促脐静脉内皮细胞形成的管状结构；b为人骨髓间充质干细胞上清促脐静脉内皮细胞形成的管状结构；c为空白培养液促脐静脉内皮细胞形成的管状结构。图中管状结构数量越多，代表具有更强的促进脐静脉内皮细胞形成管状结构的旁分泌功能，成血管能力越强。

matrigel基质胶体外促血管形成实验证明，人子宫内膜间充质干细胞与同年龄段、相同代数的人骨髓间充质干细胞相比，具有更强的促脐静脉内皮细胞成血管能力。

实施例3：人子宫内膜间充质干细胞修复损伤心肌的实验。

结扎裸大鼠冠状动脉左前降支造模，1周后损伤心肌局部组织注射人子宫内膜间充质干细胞治疗心肌梗死。

取200～250g裸大鼠，手术前电推备皮，3%异氟烷混合氧气吸入全身麻醉。

麻醉充分后，将裸大鼠用18g静脉留置针行气管插管，连接小动物呼吸机v8s辅助机械通气，潮气量5～7ml，频率75次/min。仰卧位固定四肢于铺有37℃恒温垫的手术台上，术野皮肤用75%酒精消毒，剪开皮肤、皮下、肌层等逐层开胸，沿左腋前线剪断第3、4肋骨，盐水纱布挡住肺组织，沿心底剪开心包，分离心包后暴露心脏。在肺动脉圆锥与左心耳根部之间找到粉红色走行的冠状动脉前降支，在左心耳下缘3～5mm处用7/0圆针尼龙线结扎左前降支冠脉，深度1～2mm，宽度3mm。损伤心肌呈现苍白，运动减弱，提示造模成功。

造模成功后，用3/0尼龙缝线逐层缝合关闭胸腔。拔出气管插管前，皮下注射长效青霉素150000u/kg。密切观察裸大鼠反应，待裸大鼠出现较强自主呼吸并试图自行脱离呼吸机时给予氧气吸入。观察到呼吸、心率相对平稳时拔除气管插管。

将造模完成的裸大鼠置于37℃恒温垫复温30min，放单独笼中观察，待完全自由活动后归入大笼。

1周后超声心动检测，挑选符合入选条件的裸大鼠18只，随机分成实验组、对照组和空白组，进入下一步实验。

重复上述造模的开胸步骤，所有裸大鼠均选取3个注射点，损伤心肌边界区2个，损伤心肌中央区1个。以胰岛素注射器在上述3个位置心肌局部注射60µl(1.8～4.2×10⁶个细胞)干细胞制剂。其中实验组注射人子宫内膜间充质干细胞制剂，对照组注射人骨髓间充质干细胞制剂，空白组注射等体积pbs液。注射结束后，重复造模关闭胸腔步骤。

实施例4：超声心动图检测各组造模裸大鼠的心功能变化。

裸大鼠造模前、后1周，移植干细胞制剂后1、2周，使用超声心动图评估裸大鼠的心功能情况，并筛选造模成功裸大鼠。

2.0%异氟烷混合氧气诱导麻醉裸大鼠，剔除正中毛，取仰卧位置于37℃远红外恒温垫上，鼻罩持续吸入异氟烷混合氧气。

超声心动图探头取长轴和短轴b超图像及短轴m超图像，超声记录分析左心室收缩末期内径(lvids)及左心室舒张末期内径(lvidd)，由超声机自动计算左室射血分数(ef)、左室短轴缩短率(fs)。

典型造模成功裸大鼠1周后表现为左室前壁部分室壁变薄，左室短轴切面显示左室前壁、前间壁心肌结构消失，回声增强，运动幅度减低或消失。

造模成功进入细胞移植实验的标准为：客观指标fs＜30%，ef＜60%；主观指标判断至少有一个层面的前壁室壁收缩运动明显异常。同时符合两个指标者入选进入下一步实验。

图2中a为lvidd，表示左心室舒张末期内径，b为lvids，表示左心室收缩末期内径，c为ef，表示射血分数，d为fs，表示左室短轴缩短率。

如果造模后裸大鼠的即刻实验结果显示fs＜30%，ef＜60%，则提示造模成功。

随着时间的延长，实验组和对照组的lvidd、lvids值较造模后逐渐减小，ef、fs较造模后逐渐升高，而空白组无明显改善。同时，实验组较对照组的升高明显，且随着时间的延长，这种差异更加明显。

上述实验结论证明，细胞移植可以明显改善损伤心脏心功能，人子宫间充质干细胞较人骨髓间充质干细胞的改善效果更佳。

实施例5：pet-ct评估各组造模裸大鼠的心肌细胞活性、能量代谢。

分别在裸大鼠造模前、后1周，及移植干细胞制剂后2周，采用pet-ct观察细胞移植对心肌梗死区域葡萄糖代谢的影响，从而反应其心肌细胞活性和心肌细胞能量代谢情况。

将各组裸大鼠2.0%异氟烷混合氧气诱导麻醉，尾静脉注射¹⁸f-fdg6mbq/只，40min后置于37℃恒温minerve小动物舱，以保持动物恒温，放置在mico-pet/ct扫描床，选择颈部至上腹部行pet-ct扫描采集成像，期间使用2.0%异氟烷混合氧气维持麻醉。

采用基于蒙特卡洛系统模型的3dordersubsetsexpectationmaximization(osem)算法进行图像重建。设定采集时间20min，同位素选择f-18，其余参数均选择系统默认。采集完成后，在弹出对话框内输入放射性药物剂量及测量时间，由系统自动完成重建。数据重建先选择滤波反投影法，然后用二维有序子集最大期望值法再次图像重建。采用pmod软件进行图像分析。

图3的实验结果显示，空白组(pbs)梗死区域心肌代谢活度明显减低，fdg摄取量明显减低；而细胞移植后可以改善梗死区域心肌代谢活动度，改善梗死区域心肌对fdg的摄取，且实验组改善效果更为明显。提示人子宫内膜间充质干细胞移植可以改善损伤心肌的细胞活性和能量代谢，从而促进损伤心肌的修复。

实施例6：masson三色染色检测各组造模裸大鼠的心肌细胞纤维化情况。

细胞移植后第4周末，前述实验结束后，在异氟烷混合氧气诱导麻醉状态下，静脉注射心脏骤停液处死所有裸大鼠。

取出心脏，取出左心室左前降支供应区域的损伤心肌，置于多聚甲醛浸泡固定，24h后取出，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

将组织切片以二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后，置于bouin液中固定，水洗干净。顺序以weiger'sworkingsolution(a+b=1∶1)染黑色，水洗干净；biebrich染红色，水洗，p/pacid处理；methlyblue染蓝色，水洗。最后分别以1%冰醋酸洗，水洗，酒精梯度脱水后，二甲苯透明，中性树胶封片。置于通风橱中风干过夜，拍照扫片，评估各组损伤心肌区的纤维化程度。

图4给出了masson三色染色后的扫描图片，图中蓝色区为纤维组织，代表纤维化情况。结果显示，实验组移植人子宫间充质干细胞(emscs)后蓝色区域面积减少，而空白组移植pbs的蓝色区域面积大，提示人子宫内膜间充质干细胞移植的心脏纤维化程度明显减轻。