本发明属于医用封闭胶技术领域，涉及一种可促进伤口愈合的医用封闭胶及其制备方法。本申请的医用封闭胶具有可促进伤口愈合的同时，起到抑菌、防感染的功效。
背景技术：
在外科手术中，能够快速、有效和安全的封闭组织是保证手术成功的关键因素之一。优秀的医用封闭胶可以控制创面渗血或组织液，保证手术视野清晰，提高手术效率、加速患者术后恢复。
国内外已经开发出多种医用封闭胶，主要有动物源性医用胶、半合成材料医用胶和合成材料医用胶，其中动物源性医用胶分为含有凝血酶的纤维蛋白胶（如倍绣胶和护固莱士）和胶原及明胶（如流体明胶（surgiflo））；半合成材料医用胶分为明胶-间苯二酚甲醛/戊二醛（如gluetiss）和牛血清白蛋白/戊二醛（如bioglue）；合成材料包括α-氰基丙烯酸酯类（如康派特医用胶和白云医用胶等）和聚乙二醇类（如duraseal和adherus）。其中动物源性医用胶的原料因从人或动物（猪或牛）体内提取，有动物源性，存在潜在动物疾病（如狂牛病）传播的风险。半合成医用胶一般都含有戊二醛交联剂，戊二醛是一种有毒的固定液，用于防腐和制备细胞和组织样品的电子显微镜样品，故而半合成医用胶有生物相容性差的风险。合成材料医用胶中，α-氰基丙烯酸酯类医用胶在交联时放出热量较大，易引起炎症反应，形成的胶膜较硬，降解时间较长，在降解过程中会形成有毒副作用产品（甲醛），可引起炎症，从而延迟伤口愈合。
近年来发展起来的聚乙二醇类医用封闭胶越来越受到关注。例如在申请号为201610168941.5的发明专利中，公开了一种原位交联成型的可生物降解的医用水凝胶。该水凝胶成凝胶时间小于20秒，溶胀率为0-600％，破裂强度不小于50mmhg，开始降解时间为3-40天，降解时间为7-180天。制备该水凝胶的原料包括复合的含有亲核官能团的第一组分和含有亲电官能团的第二组分，两种组分经混合工具物理混合后共价交联形成水凝胶。本发明水凝胶的物理性能、生物降解性能可以通过改变第一组分或第二组分的复合成分的比例进行调节，水凝胶的性能可控、操作简单，可用于不同部位的生物体环境。该水凝胶可用于硬脑（脊）膜密封、血管封合、眼部绷带、疝气修补、防粘连、肺切除密封和肠吻合密合等，应用较广，但此水凝胶只是单纯的水封密合，可以促进伤口的愈合，但是促进伤口愈合的速度较慢，并且起不到抑菌、防感染的功效。
申请号为201410691792.1的发明专利中，公开了一种凝胶止血材料及其制备方法，该止血材料是利用亲核性聚合物和氨基酸的低聚物与一种亲电性聚合物发生交联反应，原位生成体型聚合物，从而达到封闭止血的功效。该发明的止血材料组合物及其制备方法能够精确地控制原料配比，可实现合理的成凝胶时间，其成凝胶时间小于10秒；并且具有期望较高的强度，经测定该生物凝胶止血材料的断裂伸长率为300-600％，抗压强度大于3mpa；能够更好的满足外科手术的需要。该止血材料具有原位交联成型、反应条件温和、凝胶速度可调、低膨胀性、粘结强度高的优点，但此止血材料仍然存在促进伤口愈合的速度较慢，并且起不到抑菌、防感染功效的缺点。
现市售的聚乙二醇水凝胶产品，例如duraseal和adherus，同样存在促进伤口愈合的速度较慢，并且起不到抑菌、防感染功效的缺点。
综上所述，临床上急需一种生物相容性好、具有较好的凝胶时间、具有较好柔软度和较高强度，并且能够加速促进伤口愈合和起到防感染功效的医用封合剂。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种原位交联成型、具有反应条件温和，凝胶速度可调，低溶胀度，粘结强度高，并且能够促进伤口愈合和预防伤口感染的医用封合剂。
本发明是通过下述技术方案实现的。
一种可促进伤口愈合的医用封闭胶，所述封闭胶的制备原料包括含有亲核官能团的第一组分与含有亲电官能团的第二组分，其中第一组分是由树枝状分子、外泌体或透明质酸、壳聚糖组成。第二组分是活性聚乙二醇。
所述树枝状分子为树枝状聚乙烯亚胺、树枝状聚丙烯亚胺、树枝状聚赖氨酸和树枝状聚酰胺的一种或多种。
所述外泌体为脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞中的一种或几种间充质干细胞分泌的外泌体。。
所述壳聚糖为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖醋酸盐和壳聚糖乳酸盐的一种或多种。
所述活性聚乙二醇为二臂n-羟基丁二酰亚胺丁二酸酯基乙二醇(2-arm-peg-ss)、二臂n-羟基丁二酰亚胺戊二酸酯基乙二醇(2-arm-peg-sg)、二臂n-羟基丁二酰亚胺己二酸酯基乙二醇(2-arm-peg-sa)和二臂n-羟基丁二酰亚胺葵二酸酯基乙二醇(2-arm-peg-sseb)的一种或多种。
所述树枝状分子的分子量为1500-2500道尔顿。
所述活性聚乙二醇的分子量为3000-4000道尔顿，浓度应为100-300mg/ml。
所述第一组分和第二组分活性官能团摩尔比为0.75-1.25。
本发明还提供了一种可促进伤口愈合的医用封闭胶的制备方法，是将含有亲核官能团的第一组分溶于ph值为7-12的缓冲液中，得到溶液a，将含有亲电官能团的第二组份溶于ph值为2-8的缓冲液中，得到溶液b，再将溶液a和溶液b混合，第一组分和第二组分发生交联反应，形成封闭胶。
所述制备方法中，所述缓冲液用磷酸盐、碳酸盐、硼酸盐、磷酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠等一种或多种试剂配制而成。缓冲液浓度为0.01-0.1mol/l。
本发明所使用的组分均可以是商购产品，其结构和组成也是本领域技术人员所知晓的。
本发明的亲核组分中含有间充质干细胞分泌的外泌体或透明质酸，而且含有壳聚糖，外泌体和壳聚糖都含有活性氨基，可以和亲电组分进行交联，形成网状结构，而透明质酸可以与凝胶内的高分子发生物理缠绕可增强凝胶机械性能，从而形成具有成胶速度快、反应温和、结构稳定等优点的水凝胶，而且其中外泌体或透明质酸可以促进伤口快速愈合，而壳聚糖可以起到抑菌、防感染的功效。亲核组分中的树枝状分子，可以增加反应的交联点，形成具有更强机械性能的水凝胶，其破裂强度均达到100mmhg以上。本发明的可促进伤口愈合的医用封闭胶将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
具体实施方式
以下结合实施例和比较例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明中对水凝胶的检测采用以下所述检测方法。
成胶时间检测：
（1）待测样品的制备：将含有亲核官能团的第一组分溶于ph值为7-12的缓冲液中，得到溶液a，将溶液a转移到双组份混液器的一支注射器内，再将含有亲电官能团的第二组份溶于ph值为2-8的缓冲液中，得到溶液b，将溶液b转移到另一支注射器内，安装好双组份混液器备用。（2）成胶时间检测：均匀地推送双组份混液器，溶液a、溶液b经双组份混液器混合后，喷射到表面皿上，同时开始计时，直到完全形成凝胶（无流动液体）为止，记录该时间即为成胶的时间。
溶胀率检测：
溶胀率指水凝胶有效交联后在pbs溶液中溶胀饱和时的质量增加百分比。其检测方法包括如下步骤：（1）待测样品的制备：按照成凝胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a、溶液b安装到双组份混液器上，并注射到表面皿中形成凝胶，将得到的凝胶切成1cm*1cm*1cm的正方体凝胶，取水凝胶样品精密称重。（2）配制ph值为7.4的pbs缓冲溶液。（3）溶胀率的检测：将（1）制备的样品移至磨口三角瓶中，加入已预热至37±1℃的ph值为7.4的pbs溶液中，pbs溶液的用量至少为样品质量的40倍，然后将盛有样品的磨口三角瓶转移到37±1℃培养箱内，24h后取出样品用滤纸吸去表面水分，称量。按如下公式计算凝胶的溶胀率。
凝胶溶胀率=（溶胀后称样量-取样量）/取样量×100%
破裂强度检测：除了成胶时间和溶胀率外，水凝胶的破裂强度也是该材料一个重要指标，它反映水凝胶在使用过程中的力学性能。检测方法如下所示。
（1）取新鲜的猪肠衣上开一个直径约0.16cm±0.02cm的孔洞，备用。
（2）按照成胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a和溶液b安装到双组份混液器上。
（3）推送双组份混液器，在肠衣的孔洞上，形成规定厚度的水凝胶，形成完全凝胶后，在肠衣下方均匀加压，知道凝胶破损或玻璃，记录最大的压力数。
体外降解时间的检测：
（1）待测样品的制备：按照成胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a和溶液b安装到双组份混液器上，并注射到表面皿中形成凝胶，将得到的凝胶切成1cm*1cm*1cm的正方体凝胶。（2）配制ph值为7.4的pbs缓冲溶液。（3）体外降解时间的检测：将（1）制备好的样品放入装有pbs缓冲溶液的密闭容器中，并转移到37±1℃培养箱内，观察样品在缓冲液中的变化情况，直至肉眼看不见为止，即为凝胶体外降解时间。
细胞毒性试验：
按照成胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a和溶液b安装到双组份混液器上，并注射到表面皿中形成凝胶，除溶胀吸收容量外，按0.1g加1.0ml浸提介质的比例浸提，浸提介质为含血清mem培养基，浸提温度37±1℃，浸提时间24±2h，取浸提液作为试验液，按照gb/t16886.5-2017中规定的试验方法进行，并按照美国药典进行评级。
皮内反应试验：
按照成胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a和溶液b安装到双组份混液器上，并注射到表面皿中形成凝胶，除溶胀吸收容量外，按0.1g加1.0ml浸提介质的比例浸提，浸提介质为生理盐水和棉籽油，浸提温度37±1℃，浸提时间72±2h，取浸提液作为试验液。取试验液按照gb/t16886.10-2017中规定的试验方法进行。
急性全身毒性试验：
按照成胶时间检测中待测样品的制备方法将溶液a和溶液b安装到双组份混液器上，并注射到表面皿中形成凝胶，除溶胀吸收容量外，按0.1g加1.0ml浸提介质的比例浸提，浸提介质为生理盐水和棉籽油，浸提温度37±1℃，浸提时间72±2h，取浸提液按照gb/t16886.11-2011中规定的腹腔注射试验方法进行。
抑菌试验：
将菌悬液与抑菌产品直接接触，计算抑菌率的大小，根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。细菌：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌。
实施例1-9和比较例1-3，按着表1和表2中所示质量比，将含有亲核官能团的第一组分溶于ph值为7-12的缓冲液中，得到溶液a，将溶液a转移到双组份混液器的一支注射器内，再将含有亲电官能团的第二组份溶于ph值为2-8的缓冲液中，得到溶液b，将溶液b转移到另一支注射器内，安装好双组份混液器，并安装好喷嘴，推送双组份混液器，将两注射器内的液体经双组份混液器混合后喷出，即可快速形成水凝胶。
分别按照凝胶时间检测方法、溶胀率检测方法、破裂强度检测方法、体外降解时间检测方法、细胞毒性试验、皮内反应试验、急性全身毒性试验和抑菌试验对封闭胶的理化性能和生物学进行了检测，结果如表2和表3所示。
通过表1和表2中实施例1-3和实施例9可知，封闭胶的成胶时间主要由酸缓冲液和碱缓冲液的ph值有关，在亲核组分和亲电组分的浓度和配比在一定范围内，酸缓冲液的ph值为4、碱缓冲液的ph值为10时，封闭胶可1s成胶。通过表1和表2中实施例1-9可知，封闭胶的破裂强度与亲核组分和亲电组分的浓度有关，这是由于随着亲核组分和亲电组分浓度的增加，形成的网状结构越致密，交联点越多，从而封闭胶的破裂强度越大。
通过表1和表2中实施例1-9可知，封闭胶的溶胀率和降解时间与聚乙二醇修饰的官能团、亲核组分浓度、亲电组分的浓度、双组份配比有关，随着聚乙二醇修饰的官能团疏水连段的增长，封闭胶的溶胀率逐渐降低，降解时间逐渐延长；随着亲核组分和亲电组分的浓度增加，封闭胶的溶胀率逐渐降低，降解时间逐渐延长。通过表1和表2中实施例1-9和比较例2可知，随着体系内剩余活性氨基组分的增加，封闭胶的溶胀率逐渐增加，降解时间逐渐缩短。通过表1和表2中比较例1可知，酸缓冲液和碱缓冲液的ph值不在规定的范围内时，封闭胶无法成胶。
通过表1和表2中实施例1-9和比较例1-3可知，封闭胶的生物相容性较好，封闭胶的细胞毒性试验、皮内反应试验和急性全身毒性试验均符合医用封闭胶的生物相容性要求。
通过表1和表3中实施例1-9和比较例3可知，只有封闭胶中含有壳聚糖的情况下，封闭胶才具有抑菌作用。
小鼠皮肤伤口模型的建立：
小鼠经乙醚麻醉，背部剪毛，用剃毛刀将背侧毛剃干净，70%乙醇清洗皮肤消毒。在脊柱左右两侧相同位置各做一个稍大于直径1cm的圆形记号，无菌条件下用直径1cm的皮肤活检打孔器在圆形记号内制造一个全层皮肤伤口。造模后伤口暴露，单笼饲养。将致伤当天记为第0天。
试验动物分组
36只spf级18-22g雄性昆明种小白鼠，适应性喂养1周后，随机分为2组，每组18只，包括对照组和试验组。试验组采用实施例1中的配方，对小鼠皮肤伤口进行喷涂；对照组采用与试验组封闭胶相同量的生理盐水对小鼠皮肤伤口进行喷涂。在20天内观察伤口愈合情况。
小鼠皮肤伤口愈合率的测定
致伤后每两天给小鼠伤口拍照，采用image-proplusversion6.0图像分析软件计算小鼠的伤口面积，直至伤口愈合。
愈合率=（原始伤口面积-未愈合伤口面积）/原始伤口面积×100%
伤口愈合（创面完全上皮化）标准：愈合面积大于原始伤口面积的95%或者伤口面积小于原始伤口面积的5%即为完全愈合。
对照组和试验组队小鼠皮肤伤口愈合率的影响详见表4所示。
由表4可知，在用可促进伤口愈合的医用封闭胶进行试验的小鼠伤口在12天的时候就已经达到了愈合，而对照组小鼠在20天的时候仍然未达到伤口愈合，可见本专利所述一种可促进伤口愈合的医用封闭胶具有促进伤口愈合的效果。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。