用于乙型肝炎的环肽药物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于乙型肝炎的环肽药物及其应用。

背景技术：

据世界卫生组织统计，目前，全球约有2.4亿人患有由乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)感染导致的慢性乙肝，其中绝大部分分布在低、中收入国家，每年约有65万人死于慢性乙型肝炎感染所导致的肝纤维化，肝硬化和肝癌。在我国，慢性乙型肝炎是威胁人民身体健康的主要疾病之一，乙肝表面抗原携带率约占人口总数的7.18％，据此推算，有慢性乙肝感染者约9300万人，其中慢性乙肝患者约2000万人，有约700万慢性乙型肝炎患者已经进展至肝纤维化和肝硬化阶段。虽然在hbv预防性疫苗广泛使用后，乙肝病毒新发感染率有了显著下降，但是针对已经建立慢性感染的乙肝患者，目前为止，仍旧缺乏有效的治疗策略。

目前美国食品和药品监督管理局(fda)已经批准用于慢性乙肝病毒治疗的药物分为两类：一类是免疫调节剂，包括干扰素α(ifn-α)和聚乙二醇干扰素α(peg-ifn-α)；另一类是核苷类似物和核苷酸类似物前体药。治疗乙肝的最终目的是消除核内cccdna，或者抑制cccdna的转录活性。干扰素治疗效果持久并且有较高的病毒表面抗原清除率，最近研究表明其具有降解cccdna的作用，但其应答率低且副作用大，例如有流行性感冒症状出现、易疲劳、嗜中性白血球减少症、血小板减少症和精神不振。核苷类似物直接作用于病毒逆转录酶，阻断乙肝病毒复制，缺点是疗程漫长，需要终身治疗，因为核苷类似物是在胞质环境中抑制乙肝病毒复制，对核内cccdna库没有影响。

多肽药物具有适应证广、安全性高、疗效显著、易于合成改造和优化组合、用药量更少、特异性更好、作用效果更好、一般没有副作用或者副作用很小等特点，且生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，以及新药研发的不断深入，多肽类药物从如鲑鱼降钙素、生长抑素、人高血糖素、缩宫素等为主的多肽类激素已经发展到疾病防治的各个领域，越来越多的用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、代谢紊乱等疾病的预防、诊断和治疗。目前，总的来说，全球药物市场上有大约60～70种多肽药物，有200～300种多肽药物在临床试验中，有500～600种正在临床前试验中，更多的多肽药物在实验室研究阶段。但由于多肽半衰期一般很短，不稳定，因为易被降解和难穿越肠黏膜而不能口服。

技术实现要素：

本发明的目的针对上述问题提供一种用于乙型肝炎的环肽药物。

本发明实现其目的采用的技术方案是：

一种用于乙型肝炎的环肽药物，所述环肽为c-peptide-1或者c-peptide-2或者c-peptide-3，c-peptide-1的氨基酸序列为krrrrrrraaaa，其中k采用fitc修饰；c-peptide-2的氨基酸序列为krrrrd/rrraaaa，其中k采用fitc修饰；c-peptide-3的氨基酸序列为krrrrrrpaaaa，其中k采用fitc修饰；三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。

所述环肽药物包括上述的环肽及药学上可接受的辅料。

该多肽药物为任何药物治疗学上可接受的的剂型。

本发明还提供上述环肽药物在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明环肽具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性；大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性；氨基酸组成特点据定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性；本发明环肽很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控。检测结果显示，环肽药物具有一定的抑制hbsag、hbeag、hbvrcdna和hbvcccdna的效果。

附图说明

图1为c-peptide-3的质谱图。

图2为c-peptide-3的色谱图。

图3是本发明环肽药物的10min、2h、20h的高内涵荧光图像。

图4是不同浓度的环肽药物c-peptide-3处理hepg2.2.15细胞6d后的hbsag、hbeag表达情况。

图5是不同浓度的环肽药物c-peptide-3处理hepg2.2.15细胞6d后的hbvrcdna和cccdna表达情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

主要试剂及生产者：

fmoc-ala-oh(sigma-aldrich公司，美国)

dde-lys(fmoc)-oh(吉尔生化(上海)有限公司，中国)

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1环肽药物的设计和制备

首先，由于环状结构导致的构象变化限制，环肽类化合物一般具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性，大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性；其次，氨基酸组成特点决定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性；第三，环肽类化合物很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控。

设计研发的三个环肽药物c-peptide-1、c-peptide-2、c-peptide-3，序列如下：

c-peptide-1：krrrrrrraaaa，其中k采用fitc修饰，

c-peptide-2：krrrrd/rrraaaa，其中k采用fitc修饰，其中d/r是d型氨基酸，比l型的r更容易折叠。

c-peptide-3：krrrrrrpaaaa，其中k采用fitc修饰。

三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。

在上述环肽序列中，氨基酸采用的是单字母缩写，本发明中氨基酸缩写如表1所示：

表1氨基酸三字母和单字母缩写表

设计原理：

1)一般多肽合成有固相合成和液相合成，本申请采用固液结合的方法来做，只用一种方法技术上行不通；多肽序列：c-peptide-11mg>95％；

2)r是d型氨基酸，比l型的r更容易折叠，所以我们把其中一个r换成r；多肽序列：c-peptide-21mg>95％；

3)p是刚性氨基酸可以使肽链转变方向，可以更容易形成环，所以我们把其中一个r换成p；多肽序列：c-peptide-31mg>95％。

树脂:0.5g，取代度sd＝0.3，反应器：20cm*15mm

氨基酸量：0.5g*0.3mmol/g*＝0.15mmol

第一个氨基酸1.3倍投料，第一个氨基酸之后三倍投料，具体步骤为：

(1)称取2-cl树脂0.5g，加入反应器中用dcm(4ml)浸泡5min，用dmf(4ml)洗涤2次，第三次用dcm洗涤一次(勿抽太干)，加入46.65mgfmoc-ala-oh，加入6mldcm，0.2mldiea，反应90min，dcm易挥发，反应的时候可补加dcm。

(2)90min后补加0.5ml分析甲醇，1mldcm，封闭反应20min。

(3)用dmf洗涤4次，加入哌啶(20％哌啶+80％dmf)，脱除fmoc，20min。用dmf洗涤树脂5次，取少量树脂(10-20粒)加入检测管中，加入茚三酮(5g/100ml分析乙醇)2滴，吡啶2滴,100℃加热2min，显色即可。

(4)称取下一个氨基酸fmoc-ala-oh(3倍)+hobt(3倍)，加入反应器中，倒入5mldmf，在加入0.2mmldic反应1h之后用dmf洗涤4次，取少量树脂检测，无色即可。

(5)最后一个氨基酸采用dde-lys(fmoc)-oh,重复步骤(3)、(4)直到肽链偶联结束，脱除fmoc，偶联fitc后再脱除dde(2％水合肼)，然后甲醇抽干。

(6)把树脂放在50ml离心管中，加20ml切割液(20％tfe+80％dcm)，切割4小时。然后过滤得到切割液，旋蒸之后用冻干机冻干得到全保护肽。

(7)用dcm溶解50mg多肽(1mg/5ml)，加入用1mldmf溶解的hobt(多肽三倍量)摇匀，再逐滴加入3倍量dic，过夜环化后旋蒸冻干得到粗品肽。

(8)把粗品肽用hplc纯化到95％纯度，然后把液体冻干就得到粗品肽，并进行ms检测。

检测结果显示，c-peptide-1的产物纯度达到98％，c-peptide-2的产物纯度达到97％，c-peptide-3的纯度达到98％。c-peptide-3的质谱图如图1所示，其色谱图如图2所示。

实施例2环肽药物可穿透进入细胞实验

按照如下步骤操作：

(1)将培养瓶中培养的hepg2.2.15细胞，倒掉培养基，用pbs洗涤1-2遍，加入胰酶进行消化1-2min，加入含10％血清的1640培养基2ml终止反应，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，溶于1ml培养基，取20ul于血球计数板进行计数。

(2)将2d4细胞稀释至5×10⁴个/ml，在96孔板中分别铺板6孔，200ul/孔(即1×10⁴/孔)，置于37度、5％co2培养箱中进行培养。

(3)1d后加入含10ug/mlhoechst33342染色液的100ul培养基进行细胞核染色处理，置于培养箱染色20-30min，弃染色液，用pbs或培养液洗涤2-3次。

(4)进行加药处理，加入浓度为1mm的fitc-aaaa、fitc-rrrrrrr、fitc-rrrrrrraaaa、c-peptide-1、c-peptide-2、c-peptide-36种多肽药物处理，对照(control)是不加药物为对照。

(5)用md观察荧光标记药物进入细胞情况，加药后10min，2h，20h进行高内涵图像采集。检测结果如图3所示，图中，fitc-t4即fitc-aaaa，fitc-r7即fitc-rrrrrrr，fitc-r7-t4即fitc-rrrrrrraaaa，从图3可见环化后的环肽药物仍然能够作为载体穿透进入肝癌细胞系hepg2.2.15，其中c-peptide-2和c-peptide-3的穿透效果更好。

实施例3环肽药物的效果实验

按照如下步骤操作：

(1)将培养瓶中培养的hepg2.2.15细胞，倒掉培养基，用pbs洗涤1-2遍，加入胰酶进行消化1-2min，加入含血清的培养基2ml终止反应，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，溶于1ml培养基，取20ul与血球计数板进行计数。

(2)将2d4细胞稀释至5×10⁴个/ml，在96孔板中铺板18孔，200ul/孔(即1×104/孔)，置于37度、5％co2培养箱中进行培养。

(3)1d后分别加入10um、5um、2um、1um、0.2um和0um浓度的c-peptide-3药物进行处理，每个药物浓度3个复孔。

(4)在加药处理后3d换液，在加药处理后6d收集上清和细胞。

(5)用乙型肝炎表面抗原、e抗原elisa检测试剂盒进行hbsag、hbeag检测，用直接定量pcr试剂盒对第6天的细胞样本进行hbvdna、cccdna检测，评价不同浓度药物的处理效果。

检测结果如图4、5所示：说明c-peptide-3具有一定的抑制hbsag、hbeag、hbvrcdna和hbvcccdna的效果。