本发明属于植入类医疗器械和皮肤营养领域，具体而言，涉及一种交联透明质酸钠复合溶液制剂及其制备方法和应用。所述复合溶液制剂能对皮肤皱纹进行皮肤浅层填充，并能对皮肤胞外基质起到营养作用。
背景技术：
因遗传和环境等因素影响，皮肤会逐渐衰老，出现各种皮肤衰老症状，皱纹就是其中的一种症状，常见的有面部皱纹、眼周皱纹、额头纹、颈纹、手部皱纹、妊娠纹等。
中国专利cn104189952b公布了一种纠正皮肤褶皱注射液及其制备方法，其中含有高分子多糖、氨基酸、水溶性维生素、l-肌肽等。其中提到高分子多糖为水溶性的非交联多糖，其在皮肤维持时间较短。
交联透明质酸钠凝胶作为一种组织填充制剂在临床上广泛使用，使用浓度在10～23mg/ml。这样的产品成一种凝胶状，具有固体和液体的双重属性，适合用于皮下组织填充。其主要原理是通过增加皮下组织体积，修复皮肤凹陷。交联透明质酸钠代谢时长与非交联的相比有显著提升，能维持6～18个月的支持效果。但是这些交联透明质酸钠不适用于皮肤浅层填充，因其具有明显颗粒感，容易形成皮肤结节，影响外观。
技术实现要素：
为了制备一种降解时间更长的皮肤皱纹纠正产品，本发明人将交联透明质酸钠制备成一种溶液状制剂，用于皮内注射填充。所述制剂包括交联透明质酸钠，以及水溶性非交联高分子多糖或其盐形式(例如，非交联透明质酸钠)、多肽、氨基酸和维生素等。该产品既能通过增加皮内组织体积修复皱纹，也能通过营养皮肤作用修复皮肤细胞基质结构。
因此，本发明的一个目的是提供一种交联透明质酸钠复合溶液制剂。所述交联透明质酸钠复合溶液制剂包括交联透明质酸钠，以及水溶性非交联高分子多糖或其盐形式(例如，非交联透明质酸钠)、多肽、氨基酸、维生素等。本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂可用于面部皱纹、手部皱纹、眼周皱纹、颈部皱纹、妊娠纹等皱纹的填充纠正。本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂可应用在植入医疗器械、皮肤美容护理等领域。
本发明的另一个目的是提供上述交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述交联透明质酸钠复合溶液制剂的用途。
根据一个方面，本发明提供了一种交联透明质酸钠复合溶液制剂，其包括：
交联透明质酸钠1～20mg/ml，优选4～10mg/ml，最优选5mg/ml；
水溶性非交联高分子多糖或其盐形式0.1～20mg/ml，优选5～15mg/ml，最优选10mg/ml；
多肽0～20mg/ml，优选0.1～15mg/ml，更优选1～5mg/ml，最优选2.0mg/ml；
氨基酸0～10mg/ml，优选0.1～5.0mg/ml，更优选0.1～1.0mg/ml；
维生素0～50μg/ml，优选0.1～30μg/ml，2～10μg/ml，最优选5μg/ml。
本发明中，所述交联透明质酸钠可以是由非交联透明质酸钠经过化学交联制备而得。
本发明中，优选地，所述交联透明质酸钠复合溶液制剂的ph可以为6～8。
本发明中，优选地，所述水溶性非交联高分子多糖或其盐形式的实例可以包括透明质酸、硫酸软骨素、肝素等，以及它们的盐形式。更优选地，所述水溶性非交联高分子多糖或其盐形式为非交联透明质酸钠。所述非交联透明质酸钠可以是本领域中通常使用或商购的透明质酸钠。优选地，所述透明质酸钠的重均分子量为2×105～2×106道尔顿。
本发明中，所述多肽可以是抗氧化的多肽，例如l-肌肽、谷胱甘肽等。优选地，所述多肽是l-肌肽。
氨基酸是蛋白质的结构单元。甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸在胶原蛋白中含量丰富。本发明中，所述氨基酸可以是人体所需的十八种氨酸中的任意一种或多种。本发明中，所述氨基酸可以选自甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸的一种或多种。优选地，所述氨基酸是选自甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸的一种或多种。最优选地，所述氨基酸由甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸组成。
本发明中，所述维生素可以是水溶性维生素，包括b族维生素和维生素c等。优选地，所述维生素是b族维生素，更优选是维生素b2。
根据另一个方面，本发明提供了上述交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)交联透明质酸钠溶液的制备：将透明质酸钠配制成交联透明质酸钠水溶液；
步骤2)复合溶液的制备：将水溶性非交联高分子多糖或其盐形式、多肽、氨基酸和维生素配制成水溶液；
步骤3)将步骤2)得到的复合溶液与步骤1)得到的交联透明质酸钠溶液混合得到交联透明质酸钠复合溶液制剂。
优选地，本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法还包括在步骤3)之前分别将步骤1)得到的交联透明质酸钠溶液与步骤2)得到的复合溶液进行除菌的步骤。例如，将步骤1)得到的交联透明质酸钠溶液进行湿热灭菌，以及将步骤2)得到的复合溶液进行过滤除菌。
本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法中，优选地，所述交联透明质酸钠溶液的ph可以为6-8。
本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法中，优选地，所述复合溶液的ph可以为6-8。
优选地，本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂包括以下步骤：配制5％～30％(g/g)的透明质酸钠水溶液，加入浓度为0.5％～20％(g/g)的强碱，加入交联剂(优选地，与透明质酸钠的质量比为0.5％～5％)，交联时间为2～40h；交联结束后调节ph值至6.0～8.0，加入缓冲盐溶液，将透明质酸钠含量稀释至1％～5％(g/g)，然后进行湿热灭菌；将水溶性非交联高分子多糖或其盐形式、多肽、氨基酸和维生素配制成水溶液，经过滤除菌后与经湿热灭菌的交联透明质酸钠混合得到交联透明质酸钠复合溶液制剂。其中，优选地，交联透明质酸钠溶液制备所用的强碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾；优选地，稀释所用的缓冲盐溶液包括但限于磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液；优选地，交联透明质酸钠所用的交联剂包括但不限双环氧类，二乙烯基砜，例如，可以使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
优选地，本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法还包括将所述交联透明质酸钠复合溶液制剂经无菌灌装后装于容器(例如，预灌封注射器、西林瓶或卡氏瓶)中的步骤。
本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂的制备方法中，优选地，步骤1)中交联透明质酸钠制备所用的透明质酸钠可以是本领域中通常使用或商购的透明质酸钠。优选地，透明质酸钠的重均分子量为2×105～2×106道尔顿。
本发明的复合溶液制剂的制备方法中，优选地，所述交联透明质酸钠复合溶液制剂的剪切粘度为50～1000mpa·s。
根据再一个方面，本发明提供了上述交联透明质酸钠复合溶液制剂用于制备用于纠正人体皱纹的产品的用途。
本发明的上述用途中，优选地，所述人体皱纹可以包括但不限于，面部皱纹、眼周皱纹、额头纹、颈纹、手部皱纹、妊娠纹等。
具体实施方式
以下提供具体实施例说明本发明，但本发明保护的范围并不受到实施例的限制。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1交联透明质酸钠复合溶液制剂-1的制备
取10.0g透明质酸钠(重均分子量为120万道尔顿)，加入90.0g注射用水中。用玻璃棒搅拌混匀，于室温静置30min。加入5.0g氢氧化钠，用玻璃棒搅拌混匀；然后加入0.2g1,4-丁二醇二缩水甘油醚，于25℃反应16h；然后入2m盐酸62.5ml，并加入注射用水至总重量1000.0g。使用均质机(ika的t25数显型，所配分散刀头为18g)均质30min。转移至2l肖特瓶中，于121℃条件下湿热灭菌15min，得到交联透明质酸钠溶液以备用。
称量透明质酸钠60.0g(重均分子量为120万道尔顿)、l-肌肽8.0g、甘氨酸0.8g、丙氨酸0.8g、脯氨酸1.6g和4ml维生素b2溶液(浓度为5mg/ml),用注射用水溶解，补加到2000.0g，使用0.2μm的聚醚砜材质的过滤器进行过滤，得到复合溶液以备用。
取1000.0g复合溶液加入至备用的交联透明质酸钠溶液中，于旋涡振荡器上振荡10min，然后常温静置8h，每隔1h颠倒混匀10次。
通过以上方法制得交联透明质酸钠复合溶液制剂-1，此复合溶液呈现一种溶液状。其中交联透明质酸含量为5mg/ml，非交联透明质酸钠为15mg/ml，l-肌肽为2.0mg/ml，甘氨酸为0.2mg/ml，丙氨酸为0.2mg/ml，脯氨酸为0.4mg/ml，维生素b2为5μg/ml。
对比实施例1交联透明质酸钠复合溶液制剂-2的制备
取10.0g透明质酸钠(重均分子量为120万道尔顿)，加入90.0g注射用水中。用玻璃棒搅拌混匀，于室温静置30min。加入5.0g氢氧化钠，用玻璃棒搅拌混匀；然后加入0.2g1,4-丁二醇二缩水甘油醚，于25℃反应16h；然后入2m盐酸62.5ml，并加入注射用水至总重量250.0g。使用均质机(ika的t25数显型，所配分散刀头为18g)均质30min。转移至1l肖特瓶中，于121℃条件下湿热灭菌15min，得到交联透明质酸钠溶液以备用。
称量l-肌肽4.00g、甘氨酸0.4g、丙氨酸0.4g、脯氨酸0.8g和2ml维生素b2溶液(浓度为5mg/ml)，注射用水溶解，定容1000.0g使用，0.2μm的聚醚砜材质的过滤器进行过滤，得到复合溶液。
取250.0g复合溶液加入至250.0g备用的交联透明质酸钠溶液中，于旋涡振荡器上振荡10min，然后常温静置8h，每隔1h颠倒混匀10次。
通过以上方法制得交联透明质酸钠复合溶液制剂-2，此复合溶液呈现出一种凝胶状。其中交联透明质酸含量为20mg/ml，l-肌肽为2.0mg/ml，甘氨酸为0.2mg/ml，丙氨酸为0.2mg/ml，脯氨酸为0.4mg/ml，维生素b2为5μg/ml。
对比实施例2非交联透明质酸钠溶液制剂制备
称量透明质酸钠10.0g(重均分子量120万道尔顿)、l-肌肽1.0g、甘氨酸0.1g、丙氨酸0.1g、脯氨酸0.2g和0.5ml维生素b2(浓度为5mg/ml)的复合溶液500ml，待透明质酸钠完全溶解后使用0.2μm的聚醚砜材质的过滤器进行过滤。
通过以上方法制得非交联透明质酸钠复合溶液是溶液状。其中非交联透明质酸含量为20mg/ml，l-肌肽为2.0mg/ml，甘氨酸为0.2mg/ml，丙氨酸为0.2mg/ml，脯氨酸为0.4mg/ml，维生素b2为5μg/ml。
实验实施例1实施例1制备的交联透明质酸钠复合溶液制剂-1和对比实施例1制备的交联透明质酸钠复合溶液制剂-2剪切性能的比较
交联透明质酸钠复合溶液的剪切粘度测量方法：在25℃±0.2℃条件下，采用ta流变仪(型号为dhr-2)在剪切速率从0.001s-1～1000s-1下进行蠕动扫描，记录在剪切速率100s-1下的值作为复合溶液的剪切粘度。
交联透明质酸钠复合溶液制剂-1的剪切粘度为219.3mpa.s，交联透明质酸钠复合溶液制剂-2的剪切粘度为2040.7mpa.s。交联透明质酸钠比重越高，复合溶液制剂的剪切粘度越高。交联透明质酸复合溶液制剂-1的流动性要显著好于交联透明质酸钠复合溶液制剂-2。
实验实施例2实施例1制备的交联透明质酸钠复合溶液制剂和对比实施例2制备的非交联透明质酸钠复合溶液制剂降解周期的比较
取交联透明质酸钠复合溶液制剂-1和非交联透明质酸钠复合溶液制剂各19ml，加入1u/ml玻璃酸酶溶液1ml，于37℃反应，每个样品分别于30min、60min、90min、120min和180min取2ml进行剪切粘度的测定。
剪切粘度测量方法：在25℃±0.2℃条件下，采用ta流变仪(dhr-2)在剪切速率从0.001s-1～1000s-1下进行蠕动扫描，记录在剪切速率100s-1下的值作为复合溶液的剪切粘度。
测量结果见表1。从结果来看，本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂显著延长了降解时间。
表1不同时间点酶解复合溶液的剪切动力粘度
因此，本发明的交联透明质酸钠复合溶液制剂，与常见交联透明质酸钠填充材料相比，粘度更小，流动性更好；与非交联透明质酸钠相比，降解时间更长。本发明的产品，通过皮内注射的方式使用，可用于面部皱纹、眼周皱纹、额头纹、颈纹、手部皱纹、妊娠纹等人体皱纹的纠正。