一种具有医药用途的生物墨及其制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉一种医用生物墨及其制备方法。

技术背景

随着社会的发展，人们生活环境的变化，肿瘤的发病率和死亡率呈明显上升的趋势，严重威胁着人类生命和健康。2014年世界卫生组织预测，到2025年全球癌症新发病人数将突破1900万，2035年将增至2400万，肿瘤将成为21世纪人类的“头号杀手”。而其中90%的肿瘤病人死亡都直接或间接地与肿瘤的转移有关。实体肿瘤，特别是胃癌、乳腺癌、甲状腺癌和结肠癌，主要通过淋巴结进行转移。临床上，为防止肿瘤转移和复发，除了手术切除肿瘤的原发灶之外，还会对前哨或区域淋巴结进行定位清扫。然而淋巴结通常隐藏在脂肪组织中，因此，找到一种合适的示踪剂，对淋巴结进行精确的定位，便成了提高肿瘤治疗疗效的关键。

最早进行尝试的是日本的学者，他们在80年代初期，开发了一种活性炭混悬注射液，用作淋巴结示踪剂。临床试验发现，将活性炭混悬液注射到肿瘤部位后，活性炭会沿着肿瘤部位的淋巴管，迁移至附近的淋巴结，从而将淋巴结染成黑色，实现淋巴结的示踪。

为了改进淋巴结示踪的效果，随后，他们又推出了纳米碳混悬注射液。由于使用的原料40号碳黑，比之前的活性炭粒径要小，加之使用了聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂，使得纳米碳混悬注射液的性能更加稳定，示踪效果也得到了显著的提高。

进入21世纪后，中国的科学家在日本的纳米碳混悬注射液的基础上，对制备工艺进行了进一步的改善。他们同样使用40号炭黑作为原料，聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂，但取而代之的是利用震动研磨分散法和球磨研磨分散法进行分散，相比于日本的分散工艺——三辊研磨技术，大大缩短了分散时间，提高了生产效率。

尽管上述的混悬注射液在临床的淋巴结示踪方面取得了非常好的成绩，但依然还存在着一些缺陷：

1、混悬液中使用的40号碳黑为化工产品，在临床应用中可能会存在一些副作用；

2、目前使用的混悬液只能通过单一的染色进行辨认，缺少其他的成像手段（比如光声成像）进行联合精准定位；

3、混悬液只能用作淋巴结示踪剂，无法提供进一步的治疗。

墨作为一种古老的书写材料，它衍生自天然植物，例如桐油或松枝。长期以来，“以墨入药”被历代名医载入史册。晋代葛洪的《肘后方》载有“姜墨丸”治疗痢疾，唐代孙思邈在《千金方》中有“研浓墨点眼”治疗“飞丝入目红肿”的记载，《本草纲目》中则记载更为详细：“墨气味辛温无毒，主治止血、生肌肤、合金疮、治产后血晕崩中”。而到了清末，胡开文的“徽州八宝五胆药墨”更是盛极—时，广为流传，它因以麝香等珍品入药，以醋为引，与云南白药、漳州片仔癀并称中国三大奇药。根据我们前期的探索研究跟文献报道，发现墨的主要成分为碳纳米粒子，其中单个原始粒子的粒径在20-50nm。由于其具有明亮的黑色，因而可以用作肿瘤淋巴结染色试剂，同时因为墨在近红外光区吸收较强，还可以用于肿瘤淋巴结光声成像和近红外二区光热治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有医药用途的生物墨及其制备方法。

本发明提供的具有医药用途的生物墨，以制墨工艺中使用的烟灰为原料，其组分包括：墨粉纳米粒子、稳定剂（如聚乙烯吡咯烷酮）、ph调节剂调（如枸橼酸钠）和生理盐水。

本发明提供的生物墨可以用于淋巴结活体染色，也可以对淋巴结进行光声成像，从而大大提高了对淋巴结示踪的精准度。此外，由于生物墨具有良好的光热转换性能，在近红外二区激光的照射下，能够使淋巴结局部的温度迅速升高，从而有效抑制淋巴结的转移和生长。即可用作淋巴结示踪剂和近红外二区光热转换试剂。也可以用于制备抑制肿瘤淋巴结的转移和生长的药物。

传统的制墨工艺以动物胶作为稳定剂，通过三辊研磨设备进行分散。而本发明中采用fda批准的药用高分子辅料聚乙烯吡咯烷酮等作为稳定剂，通过超声和水热的方法处理，得到具有生物安全性更好，分散效果突出的生物墨；相比于传统的三辊研磨法，生产工艺流程更简单，制备得到的生物墨也更加稳定。

本发明提供的上述生物墨的制备方法，具体步骤如下：

首先，将稳定剂溶解于生理盐水中；再将墨粉纳米粒子，加入稳定剂的溶液中，超声分散均匀；

然后，将其转移至水热釜中，于50℃-200℃下处理1-10小时；

最后，用调节ph调节剂调节ph值至6.0-8.0，即得到所述的生物墨。

该生物墨中各组分的量为：以每升生物墨计，墨粉纳米粒子为2-200克；稳定剂为2-100克；优选，墨粉纳米粒子为10-50克，稳定剂为10-50克。

本发明中，所述墨粉纳米粒子选自制墨工艺中通常使用的主要原料烟灰。

本发明中，所述墨粉纳米粒子可以选自胡开文牌徽墨、曹素功牌徽墨、李廷珪牌徽墨、绩溪良才徽墨、一得阁牌墨、中华牌墨、红星牌墨、宣和牌墨、玄宗牌墨和开明牌墨中的任何一种。

本发明中，所述稳定剂可以选自聚乙烯吡咯烷酮、吐温-20、吐温-80、透明质酸、羟丙基甲基纤维素、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素、丙烯酸甲酯共聚物和黄原胶中的任何一种。优选稳定剂是聚乙烯吡咯烷酮。

本发明中，所述ph调节剂可以选自枸橼酸钠、枸橼酸钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、盐酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、磷酸、己二酸、富马酸中的任何一种。优选ph调节剂是枸橼酸钠。

本发明中，调节ph值为6.0-8.0，优选调节ph值为7.0。

附图说明

图1为生物墨的透射电镜照片。

图2为生物墨的粒径分布图。

图3为生物墨的紫外-可见吸收光谱。

图4为生物墨的光声谱图。

图5为生物墨的光热效果。

图6为生物墨的细胞毒性试验。

图7为生物墨对淋巴结的染色示踪和光声成像照片。

图8为生物墨对淋巴结的近红外二区光热治疗效果。

具体实施方式

实施例1：生物墨的制备

称取聚乙烯吡咯烷酮3克，溶解于100毫升生理盐水中；再称取墨粉纳米粒子3克，加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，超声分散均匀后，将其转移至水热釜中，于160℃下处理6小时；最后用枸橼酸钠溶液调节ph值至7.0。

将制备得到的生物墨分装于1毫升的安瓿瓶中，灭菌，包装。

实施例2：生物墨的制备

称取聚乙烯吡咯烷酮3克，溶解于100毫升生理盐水中；再称取墨粉纳米粒子1克，加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，超声分散均匀后，将其转移至水热釜中，于200℃下处理2小时；最后用枸橼酸钠溶液调节ph值至7.0。

将制备得到的生物墨分装于1毫升的安瓿瓶中，灭菌，包装。

实施例3：生物墨的制备

称取聚乙烯吡咯烷酮1.5克，溶解于100毫升生理盐水中；再称取墨粉纳米粒子3克，加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，超声分散均匀后，将其转移至水热釜中，于160℃下处理6小时；最后用枸橼酸钠溶液调节ph值至7.0。

将制备得到的生物墨分装于1毫升的安瓿瓶中，灭菌，包装。

实施例4：生物墨的制备

称取吐温-803克，溶解于100毫升生理盐水中；再称取墨粉纳米粒子5克，加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，超声分散均匀后，将其转移至水热釜中，于160℃下处理6小时；最后用枸橼酸钠溶液调节ph值至7.0。

将制备得到的生物墨分装于1毫升的安瓿瓶中，灭菌，包装。

实施例5：生物墨的制备

称取聚乙烯吡咯烷酮3克，溶解于100毫升生理盐水中；再称取墨粉纳米粒子3克，加入聚乙烯吡咯烷酮溶液中，超声分散均匀后，将其转移至水热釜中，于160℃下处理6小时；最后用盐酸溶液调节ph值至7.0。

将制备得到的生物墨分装于1毫升的安瓿瓶中，灭菌，包装。

实施例6：生物墨的表征

使用tecnaig2-20twin型透射电镜对实施例1制备的生物墨进行表征，如图1所示，初始碳纳米粒子的粒径为20-50nm。

取一定量的生物墨进行稀释后，利用malvernnano-zs90型激光粒度仪测量粒径，如图2所示，生物墨的平均团聚粒径为109nm。

取一定量的生物墨溶于生理盐水中，配成50µg/ml的溶液，用紫外分光光度计测试生物墨在600-1200nm波段的吸收情况。如图3所示，本发明生物墨在近红外光区具有较强的吸收。

取一定量的生物墨溶于生理盐水中，配成50µg/ml的溶液，用光声成像系统测试生物墨的光声谱图。如图4所示，本发明生物墨具有较强的光声成像效果。

量取一定量的生物墨溶于生理盐水中，配成100µg/ml、50µg/ml、25µg/ml和12.5µg/ml的溶液，取100µl样品置于96孔板中。用1064nm的激光器照射，同时用红外热成像仪记录样品溶液的温度变化情况。结果如图5所示，在功率为1w/cm²的激光照射下，5分钟内，温度显著升高，例如，当生物墨的浓度为100µg/ml时，样品温度能够从25℃快速升高到70.6℃，而对照组生理盐水则只升高到了30.9℃。

实施例7：生物墨的安全性试验

量取一定量实施例1制备的生物墨溶于生理盐水中，配成400µg/ml、200µg/ml、100µg/ml、50µg/ml、25µg/ml、12.5µg/ml和6.25µg/ml的试剂，然后将这些不同浓度的试剂分别与ct26和hek-293t细胞进行孵育24h，再通过cck-8试验检测细胞的存活率。图6为生物墨的细胞毒性效果图，当浓度达到400µg/ml时，ct26和hek-293t细胞存活率依然在90%以上，说明生物墨无细胞毒性。

实施例8：生物墨对淋巴结染色的效果

首先配制细胞密度为6×10⁷/ml的ct26结肠癌细胞，然后在balb/c小鼠的右下肢脚垫注射接种ct26结肠癌细胞，每只小鼠接种50µl。接种30天后，小鼠的右下肢脚垫长出了一块肿瘤。随后将接种了ct26结肠癌细胞的小鼠分成2组，每组5只。在所有的实验组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl实施例1制备的生物墨。在所有的对照组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl生理盐水。给药2小时后，利用微创手术，将哨位淋巴结暴露出来。

结果如图7所示，在实验组中，哨位淋巴结内由于聚集了大量的墨粉纳米粒子，被染成了黑色，因而能够准确地辨认出淋巴结的具体位置；而对照组中则不能够将淋巴结与周围的正常组织区别开来。

实施例9：生物墨对淋巴结的光声成像示踪

首先配制细胞密度为6×10⁷/ml的ct26结肠癌细胞，然后在balb/c小鼠的右下肢脚垫注射接种ct26结肠癌细胞，每只小鼠接种50µl。接种30天后，小鼠的右下肢脚垫长出了一块肿瘤。随后将接种了ct26结肠癌细胞的小鼠分成2组，每组5只。在所有的实验组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl实施例1制备的生物墨。在所有的对照组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl生理盐水。给药2小时后，利用光声成像系统，对哨位淋巴结进行光声成像。

结果如图7所示，在实验组中，借助光声成像技术，由于哨位淋巴结处的光声信号非常强，因而能够将淋巴结的位置清晰地呈现出来，从而实现淋巴结的精准定位；而对照组中，由于淋巴结处的光声信号较弱，不能够将淋巴结与周围的正常组织区别开来。

实施例10：生物墨对淋巴结的染色/光声成像联合示踪

首先配制细胞密度为6×10⁷/ml的ct26结肠癌细胞，然后在balb/c小鼠的右下肢脚垫注射接种ct26结肠癌细胞，每只小鼠接种50µl。接种30天后，小鼠的右下肢脚垫长出了一块肿瘤。随后将接种了ct26结肠癌细胞的小鼠分成2组，每组10只。在所有的实验组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl实施例1制备的生物墨。在所有的实验组balb/c小鼠的右下肢脚垫的肿瘤处，注射20µl生理盐水。给药2小时后，利用微创手术，将哨位淋巴结暴露出来；同时利用光声成像系统，对哨位淋巴结进行光声成像。

结果如图7所示，在实验组中，哨位淋巴结内由于聚集了大量的墨粉纳米粒子，被染成了黑色，因而能够辨认出淋巴结的具体位置，同时借助光声成像技术，也能够将淋巴结的位置清晰地呈现出来，而通过染色和光声成像的联合使用，使得淋巴结的示踪更加的精准可靠；而在对照组中，则由于缺乏染色，同时淋巴结处的光声信号也较弱，因而不能够将淋巴结与周围的正常组织区别开来。

实施例11：染色/光声成像指导下的近红外二区光热治疗

首先配制细胞密度为6×10⁷/ml的ct26结肠癌细胞，然后在balb/c小鼠的右下肢脚垫注射接种ct26结肠癌细胞，每只小鼠接种50µl。接种30天后，小鼠的右下肢脚垫长出了一块肿瘤。随后将接种了ct26结肠癌细胞的小鼠随机分成5组（每组7只）：生理盐水组、1064nm激光组、生物墨组、生物墨+1064nm激光组和生物墨+808nm激光组。给药2小时后，将小鼠的淋巴结部位暴露在激光器下5分钟，其中1064nm和808nm的激光功率分别设置为1w/cm²和0.33w/cm²。结果如图8所示，生理盐水组、单独的1064nm激光组和单独的生物墨组，以及生物墨+808nm激光组均无法抑制淋巴结的生长，而在生物墨+1064nm激光组中，淋巴结的生长则得到了非常好的抑制。

实施例2-5制备的生物墨与实施例1制备的生物墨具有相似的性状和功能（可参见实施例6-11）。