用于微整形的再生组织基质微粒、制备方法及应用与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种用于组织修复的再生组织基质微粒、及其制备方法和应用。
背景技术：
：近年来，随着社会经济的快速发展，人们对美有着更高追求，极大促进了微创注射再生医学技术的迅猛发展。微创注射技术所需的注射填充剂(又称皮肤填充剂(dermalfiller)、软组织填充剂(softtissuefiller))主要用于创伤、先天性缺损、后天损伤性缺陷、先天性畸形等缺陷的整形美容与修复治疗，包括面部微整形、耳朵微整形、丰胸、关节软组织损伤的填充修复，正颌、正畸修复手术的补充，并具有创伤小、恢复快等独特优势，在创伤重建、颌面部软组织缺陷修复、隆鼻和下巴隆起等方面具有十分广阔的应用前景。充填剂是通过充填真皮或更深组织间隙的容量丢失来矫正皱纹和面部塑形。目前，用于微创注射技术的充填剂包括生物降解类填充剂和非生物降解类填充剂两类。生物降解类填充剂最早出现在1983年，并应用于自体软组织填充，使用自体、异体真皮来修复面部瘢痕。美国fda于2003年12月批准首个非动物源性的透明质酸类抗皱产品，该物质为含有丰富粘多糖的高分子聚合物，并使用交联技术延长了其抗皱时长，保持抗皱效果持续4-12个月。但是使用者在多次使用后出现面部皮肤松弛现象，并随着注射次数增多机体表现的耐受越明显，出现依赖现象，注射频率增大。fda于2006年批准钙羟基磷灰石(caha)用于修复中到重度的皱纹和艾滋病引起的真皮萎缩，由类似于骨骼的球形微粒组成重悬于羧甲基纤维素钠凝胶中，可以使注射部位产生新的凝胶，维持时间在15个月以上。因羟基磷灰石注射后会表现出充填剂的游走或溢出、色素沉着和罕见的色素减退等副作用，在国内未被批准使用。美国fda批准聚乳酸(pla)用于治疗艾滋病相关的真皮萎缩(2004年)和修复中度到重度皱纹(2009年)，它是采用α-羟基酸合成的生物可降解产品，注射入皮肤后引起亚临床炎症反应和胶原纤维增生，最后导致皮肤组织进展性体积增大。这类产品同样存在被代谢吸收的缺陷。非生物降解类填充剂包括聚甲基丙烯酸甲酯微球和液体可注射性硅胶。真皮充填剂维持又可以分为短效、长效、半永久性、永久性四大类。美国常用的真皮充填剂效果维持时间如表所示。表1专利cn1718249a公开以新鲜猪皮为原料，去掉毛皮上的异物，削去皮下组织，经过脱脂、碱液处理、剖层、酶液软化、戊二醛交联、漂白处理、微粒化加工、真空无菌灌装、co60辐照处理得到一种可注射软组织生物填充材料，其属于异种皮粒，难以血管化，注射后产生抗原或者坏死等不良后果。目前常用的填充剂通过增加真皮层组织的容量，从而达到抚平皱纹、改善脸部缺陷、雕塑完美肌肤的目的，维持作用的时间短或由于异种胶原蛋白存在的天然缺陷(降解速度较快，容易出现不均匀)，增加了使用者的经济压力和临床医生的操作难度。技术实现要素：为了解决现有技术的缺陷，本发明目的是提供一种用于微整形的再生组织基质微粒。本发明的第二个目的是提出所述一种用于微整形的再生组织基质微粒的制备方法。本发明的第三个目的是提出所述一种用于微整形的再生组织基质微粒的应用。实现本发明上述目的的技术方案为：一种用于微整形的再生组织基质微粒，所述再生组织基质微粒中dna残留量在2.0ng/mg以下，所述再生组织基质微粒的粒径在1.2mm以下，d50在0.018～1.0mm之间。进一步地，所述再生组织基质微粒中，dna残留量在0.3～0.7ng/mg之间，和/或，所述再生组织基质微粒的玻璃化温度在50～70℃之间。进一步优选地，所述再生组织基质微粒的d95在0.025～1.2mm之间，d10在0.45～20μm之间。本发明还提供了一种用于微整形的再生组织基质微粒的制备方法。所述的再生组织基质微粒的制备方法，包括步骤：1)将异体皮原料投入碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品a；2)将半成品a去除表皮后，投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品b；3)将半成品b剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品c；4)在高速旋转离心力的作用下，用转刀对半成品c进行切割，得到半成品d；5)将半成品d置于d-氨基酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品e；6)将半成品e制成预装注射剂或冻干品。其中，步骤1)中所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述碱的浓度为0.5～5％；优选碱的浓度是1～3％；和/或，所述的异体皮原料投入碱的甘油溶液中，优选在25～35℃下浸泡1～10h并振荡处理。其中，步骤2)所述的表面活性剂是sds或者tritonx-100；所述表面活性剂溶液的浓度为0.1～0.3g/l；超声浸泡条件为：20～45khz，温度为1～20℃，超声1～5min，浸泡1～4h，优选重复超声和浸泡处理2-6次，重复前换新的表面活性剂溶液。优选地，将半成品b用交联剂进行交联，然后进行剪裁；所述的交联剂为质量浓度0.1～0.6％的京尼平溶液，优选交联的时间为2～24h，自然交联溶液的ph值为5～7。经过交联的再生组织基质微粒注射到真皮层后，在组织内不容易降解。其中，步骤3)中半成品b剪裁成的小皮片的大小是(0.3～1)×(0.3～1)cm2；进一步优选(0.3～0.8)×(0.3～0.8)cm2。其中，步骤4)中所述的半成品c由进料口进入速度是50～100g/min，优选50～80g/min。其中，步骤5)所述的d-氨基酸溶液选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种或几种；优选由天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸的浓度分别为0.8～1.4，1.2～1.8，0.4～0.6，4～10.8μmol/l的氨基酸水溶液，按体积比例为1:(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)配制。其中，步骤6)制备冻干品前，将半成品f放入冻干保护剂中，浸泡5-20min，所述的冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或两种的水溶液，所述甘露醇的浓度为3～7g/100ml，海藻糖的浓度为10～20mg/100ml，麦芽糖的浓度为10～20mg/100ml。其中，步骤6)制备冻干品的方法如下：(1)将半成品e在0～10℃温度下置于冻干设备内，保持0.5～2h；(2)降温到-35～-50℃并保持0.5～2h，升温到-20℃并保持0.5～2h，再次降温至-30～-50℃保持0.5～2h；(3)控制冻干设备内真空度为5～10pa；用1～3h将隔板升温到-30℃，控制冻干设备内真空度为1～5pa，维持10～20h；(4)用0.5～2h将隔板升温到0～4℃，并维持8～12h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；(5)用1h将隔板升温到10℃，并维持8～12h，测定压力升，直至压力升小于1pa；(6)用0.5h将隔板升温到20～30℃，并维持6～10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30pa。本发明还提供了一种用于微整形的再生组织基质微粒的应用。所述的再生组织基质微粒在制备治疗先天性组织缺损和后天损伤性造成的组织缺损填充材料中的应用，所述先天性的缺损和后天损伤性造成的组织缺损包括面部褶皱、鼻尖、鼻梁骨、鼻唇沟、太阳穴、唇、下巴、耳垂、胸部处的缺损，男性阴茎短小、早泄，及关节软骨损伤。本发明的有益效果在于：本发明提供了可以快速批量获得的再生组织基质微粒，该再生组织基质微粒粒径分布窄，端粗少，粒径均一，并且本发明的制备工艺保留了再生组织基质的三维框架结构，更易于细胞粘附和迁入，有利于毛细血管的生长，使被填充部位重建血运，恢复生机；可修复因多次注射玻尿酸、取出假体后造成的组织损伤。本发明采用的制备方法可以快速高效脱除细胞，使所得再生组织基质dna残留量更低。(1)本发明提供的再生组织基质是用碱的甘油溶液进行脱除细胞更易于表皮和细胞的脱除，使用碱的量会更低，对再生组织基质的破坏会更低，交联时间更短，交联剂的使用量更低，在同等条件下使得脱除后剩余dna残留更低，更不易发生免疫排斥反应。(2)本发明采用的制备再生组织基质微粒的切割式研磨法，有利于再生组织基质进行粉碎过程中粒径大小的均一、且损失率较低。因采用离心高速研磨方法，利用转刀进行切割、在转刀和环筛之间切割成想要粒径大小的微粒，减少达到想要粒径的微粒在切割室内进行反复切割，减少切割的时间。(3)在超低温的条件下进行切割有利于保持再生组织基质的结构，避免切割过程的高速剪切而发生局部过热而对再生组织基质的烧灼破坏(因为烧灼影响机体细胞对再生组织基质的粘附和再生)。(4)采用本发明的制备方法得到的再生组织基质微粒，粒径均一，粒度分布更为窄，更有利于细胞的粘附、生长，及填充部位的血运重建，具备优良的填充效果。附图说明图1为粒度分析曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中，若无特别说明，所使用的方法均为本领域常规的方法。本发明涉及到的原料或试剂均可市购获得。本发明提出的再生组织基质微粒，其制备方法包括步骤：1)将异体皮原料投入碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品a；2)将半成品a去除表皮后，投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品b；3)将半成品b剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品c；4)在高速旋转离心力的作用下，用转刀对半成品c进行切割，得到半成品d；5)将半成品d置于d-氨基酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品e；6)将半成品e制成预装注射剂或冻干品。本发明真皮来源于自愿捐献者的皮肤。本发明所制备的再生组织基质的保存条件为阴凉干燥处，相对湿度≤45％。以下通过具体的实施例说明本发明的技术方案。实施例1-51)异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在25～35℃浸泡1～10小时振荡处理，得半成品a；2)将半成品a去除表皮后，用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入表面活性剂溶液中，在超声频率20～45khz，超声温度为1～20℃条件下，超声时间1～5min，浸泡1～4h，换新的表面活性剂溶液；重复超声和浸泡的处理，得半成品b(具体地，实施例1是2.5h四次。实施例2是2h四次。实施例3是2.5h二次。实施例4是2h一次。实施例5是1h一次)。3)可选地，将半成品b用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入到0～0.6％的京尼平的水溶液(该浓度的京尼平溶液ph为5～7)中交联，用无菌纯水冲洗1～5h。4)将步骤3)处理后的半成品b剪裁成的小皮片的大小是(0.3～1)×(0.3～1)cm2，以沉浸式方式浸入到液氮中，得到半成品c。5)将半成品c由进料口进入的速度是50-80g/min，在转刀以8000-15000转/min的调频速度高速旋转离心力的作用下，转刀对半成品c进行切割，粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品d。6)将半成品d用无菌纯水冲洗5.0min，后置于d-氨基酸溶液中浸泡3-5min，离心过滤得到半成品e。7)将半成品e置于冻干保护剂中浸泡5-20min，放在5℃置于冻干箱，保持1h，降温到-50℃并保持12h，升温到-20℃并保持1h，再次降温至-50℃保持1h，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5pa；用1h将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1pa，维持12h；用1h将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1h将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5h将隔板升温到25℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30pa，真空无菌灌装，再经电子束辐照灭菌即得再生组织基质微粒成品。实施例1-5均是采用上述实施例步骤得到再生组织基质微粒，各步骤的具体参数见表2。表2实施例1-5中步骤参数列表性能检测dsc检测将样品直接放入测试铝盘中，按照仪器使用说明书，以氮气气氛下，2℃/min升温速度，在温度范围为5-125℃进行扫描，记录样品的吸收峰值对应的温度值。对本发明产品进行了dsc检测，实施例3产品的玻璃化温度为57℃。实施例1-5产品的玻璃化温度在50～70℃之间。表3实施例1-5的dsc分析中玻璃化温度实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5dsc玻璃化温度(℃)5355576165dna残留检测根据《脱细胞异体真皮基质》医疗器械产品技术要求中3.6条款的标准检测，结果见表4，dna残留量在0.3～0.7ng/mg之间。表4实施例1-5的dna残留分析实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5dna残留量(ng/mg)0.30.40.50.60.7马尔文粒度分析仪测定粒径使用马尔文粒度分析仪测定时，d50表示一个样品的累计粒度分布百分数达到50％时所对应的粒径。d50常用来表示粉体的平均粒度。d95一个样品的累计粒度分布百分数达到95％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的微粒占97％。d10一个样品的累计粒度分布百分数达到10％时所对应的粒径。d10和d95常用来表示粉体粗细两端的粒度指标。图1示出了实施例3的粒度分析结果，d50为101μm，d90为533μm，d10为17.4μm，比表面积为137.2m2/kg。对其他实施例产品同样检测，实施例1-5微粒的粒径在1.2mm以下，其d50在0.018～1.0mm之间，d95在0.025～1.2mm之间，d10在0.45～20μm。对比例1dna残留量比较本对比例的操作同实施例1，区别仅在于步骤1)中采用的碱液的溶剂不同，本对比例采用的是氢氧化钠的水溶液。对比例1所得再生组织基质中的dna残余的含量为5.6ng/mg，远超过本发明的技术方案小于0.7ng/mg的含量。对比例2本对比例的操作同实施例1，区别仅在于步骤4)中的操作不同，该对比例的冷冻操作为：步骤4)对再生组织基质的皮片预处理，将皮片预先剪裁成小皮片，在低温冷冻使用超低温冰箱(-80℃)进行超低温冷藏，冷冻后取出；对比例3本对比例3的操作同实施例1，区别仅在于步骤1)中的操作不同，该对比例的剪裁操作为：步骤1)对再生组织基质的皮片预处理，将干皮片预先剪裁成0.2×0.2cm2小皮片，置于液氮中冷冻5min后取出。对比例4本对比例的操作同实施例1，区别仅在于步骤3)中高速旋转粉碎仪的转数不同，该对比例步骤3)中的高速旋转粉碎仪的转速为5000转/min。对比例5本对比例的操作同实施例5，区别仅在于步骤4)和步骤5)参数不同，其制备方法如下步骤：4)将半成品c剪裁成的小皮片的大小是1.3×1.3cm2，以沉浸式方式浸入到液氮中15min，得到半成品d。5)将半成品d由进料口进入速度是120g/min，在转刀以18000转/min的转速高速旋转离心力的作用下，转刀对d进行切割，得到粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品e。对比例6本对比例的操作同实施例1，区别仅在于没有步骤6)将c直接进行步骤7)的操作。对比例1-6结果见下表。表5对比例a-e的粒度分布d10(μm)d50(μm)d95(μm)实施例15638961108对比例223610221504对比例32256821465对比例41023561658对比例5986981835对比例65528691262从表5可以看出，虽然微粒的平均粒度虽然都达到1mm以内，但得到的微粒粒径范围比较宽，均一度差，而依照本发明方法制备的再生组织基质微粒粒度分布更狭窄，粒径更均一，基于对比例a-e粒度分布情况，本发明所提供的实施例1-5在粒径分布和粒径均一程度上显著，填充效果更好。由于对比例a-d；证明本发明所主张的制备方法中，通过条件参数的控制可达到理想的水平。应用实施例1可注射的再生组织基质微粒进行复水使用及方法使用时取上述得再生组织基质微粒，按照1g加入到生理盐水或者1～3ml、ph值为7.2～7.4之间pbs溶液复水15min，即制得可临床使用的再生组织基质植入剂。轻推注射器至少量真皮充填剂从针尖溢出，准备注射，确保真皮充填剂是连续的，重复进针直到达到理想的充填效果。使用时以木偶纹真皮充填治疗为例，使用方法如下：1)麻醉用乙醇清洁和消毒木偶纹区域皮肤，皮下注射利多卡因，等待数分钟至麻醉起效。2)诊疗充填治疗将患者置于60°斜靠位。用乙醇消毒木偶纹区域。操作者位于木偶纹拟治疗侧的同侧。将针头装在预装在实施例12的注射器上，确保针头已经装紧，防止在推注时针头弹出。轻推注射器至少量真皮充填剂从针尖溢出，准备好注射。第一个向内的扇形注射点位于木偶纹下部，将针头紧邻木偶纹内侧皮肤表面平行放置来确定注射点，使针尖位于下唇下1mm，注射点位于针座处。以30°角入针，朝向唇部进针直至没针。退针时稳定、持续地推注，直线注射充填剂到真皮中层至深层。退针但不拨出针头，向内轻微变换角度，再次进针至没针并重复上述步骤直至达到理想的矫正效果。确保注入的真皮充填剂是连续的。这称为向内的扇形注射。第二个向内的扇形注射点如上所述位于第一个注射点上方约1cm处。第三个向内的扇形注射点如上所述位于第二个注射点上方约1cm处。向外的扇形注射点紧邻唇下缘。将针头紧邻下唇下缘皮肤表面平行放置来确定注射点，使针尖位于木偶纹内侧1mm。注射点位于针座处。以30°角入针，向外侧朝嘴角进针，进针至没针，行扇形注射。拇指在口外，食指在口内按压治疗区域，使充填剂产品形成的任何可见或可触及的团块变平滑。如果团块不容易按压塑形，可用水打湿该区域，用手指将其展开。通过按压和推拿来对充填剂产品进行塑形常导致额外的肿胀和淤青。重复上述注射治疗对侧面部。治疗后即刻可见木偶纹明显减轻。3年后随访，矫正效果仍维持，未见吸收。应用实施例2生物相容性分析取环状切除术后幼儿包皮分离成纤维细胞，将原代细胞长满约75％即可传代，传至第3代，将细胞与实施例1与对比例a和对比例e所得的再生组织基质微粒联合体外培养2～3d，倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架材料上的黏附、生长及增殖情况，并计算细胞在材料上的黏附率；xtt比色法检测细胞的生长增殖情况。结果显示实施例1、对比例2和6所得的再生组织基质微粒有显著不同，实施例1成纤维细胞在支架材料上分布均匀，12h内细胞开始伸展、黏附，24-48天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；72h支架上的布满细胞。对比例2成纤维细胞在支架材料上分布均匀，32h内细胞开始伸展、黏附，三四天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；一周支架上的布满细胞。对比例6成纤维细胞在支架材料上分布均匀，24h内细胞开始伸展、黏附，两三天完全伸展变形，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长；一周支架上的布满细胞。而人成纤维细胞细胞与实施例1所得的再生组织基质微粒混合培养后平均黏附率为95.30％，比对比例1-6所得的再生组织基质微粒的黏附率均高21.3个点，比对比例6所得的再生组织基质微粒的黏附率均高16.8个点，并保持正常的生长增殖速度，表明本发明技术方案所得的微粒支架对细胞具有更良好的黏附性；本发明工艺制备的再生组织基质材料与人成纤维细胞复合后相容性更好。临床实施例1.胸部高度改善测试以志愿者为试验对象，进行注射后胸部高度情况的试验研究，考察实施例1-5在试验条件下对胸部上升的影响。具体的操作方法如下所述：选取5名志愿者，分别将2×(70～120)ml实施例1-5的植入剂直接注射胸部(记为临床实施例1-5)，并用软尺测量志愿者的胸围在进行植入剂注射前后变化情况。胸围测量要求志愿者自然直立，双脚分开同肩宽，双肩放松，上肢自然下垂，将带尺上缘经背部肩胛骨下角下缘至胸前围绕一周所测距离。试验结果如下表6所示。表6注射前后胸部尺寸变化注射前胸围尺寸(cm)注射后胸围尺寸(cm)临床实施例18587临床实施例28385临床实施例38084临床实施例48283临床实施例58486从表6中的数据可得，注射实施例1-5的植入剂后，志愿者胸围尺寸情况立即增加，表明了实施例1-5的植入剂可以使胸围均有不同程度的增长，增长2～4cm。使用方法：再生组织基质充填剂进行丰胸采用多点多层次立体式注射丰胸，能让再生组织基质微粒与相应的胸部组织充分的接触在一起。患者平躺，本发明的植入剂针头从腋下或肚脐注射真皮微粒到胸部的胸大肌前和乳腺后，必需均匀分布在乳腺腺体外围和胸肌下空间(每侧约100～150ml)，每一单点移植脂肪微粒小于0.5ml，并禁止注入乳腺体内，边注射边按揉塑形，使颗粒均匀铺开，术后用绷带进行固定保护。2.皱纹改善测试以志愿者为试验对象，进行注射后皮肤皱纹情况的试验研究，考察实施例1-5在试验条件下对皮肤皱纹的影响。具体的操作方法如下所述：选取5名健康的志愿者，分别将2ml实施例1-5的植入剂直接注射手背皮肤上(记为临床实施例6-10)，并肉眼观察注射部位在注射前、注射后的皱纹情况。皱纹情况评分为1～9分，9分为皱纹等级最高，1分为皱纹等级最低，无皱纹。试验结果如下表7所示。表7注射本技术发明产品后皱纹得分情况从表7中的数据可得，注射实施例1-5的植入剂后，注射部位的皱纹情况立即减少，表明了实施例1-5的植入剂能够减少皱纹，让皮肤紧致，恢复年轻状态。3.牙龈试验以志愿者为试验对象，进行牙龈注射后在临床上的表现如减少牙龈沟宽度，增加牙龈高度。考察实施例1-5的植入剂在试验条件下对牙龈萎缩的影响。具体的操作方法如下所述：可注射式植入剂在5位对牙龈萎缩的受试者的试验(记为临床实施例11-15)，考察注射前后牙龈沟的宽度和牙龈的高度。试验结果如下表8所示。表8本发明产品对牙龈槽的作用从表8中的数据可得本植入剂在施予过程后之对牙龈萎缩起到优化的作用。虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进和变型，均应属于本发明的保护范围内。当前第1页12