一种用于治疗烫伤的NS-GAM基因活性支架及其制备方法与流程

背景技术：

深ⅱ度烫伤是临床中的一种常见疾病，其创面愈合过程涉及诸多因子的表达及信号转导通路，是一个非常复杂的过程。虽然从理论上讲各因子的表达是有序且级联的，但在实际的愈合过程中常会出现瘢痕增生或伤口难愈两类非正常愈合现象。严重的甚至会导致创面发生感染，使之演变为更深程度的创面，长期难以愈合。关于深ⅱ度烫伤创面修复传统方式多使用外用药物治疗和敷料治疗，多年的使用经验发现其在治疗同时伴随着诸多的不足和副作用。

近年来，随着基因治疗的发展及组织工程手段的进步，基因治疗逐渐被应用到皮肤的创伤修复领域，并取得一定的研究成果。在此基础上将基因治疗方法与组织工程技术相结合，诞生了新的原位治疗方式，即基因活性支架（gam），其具有多种独特的优势，如具有更高的原位针对性、实现局部较高的dna装载量、完成多种因子协同作用等，已在皮肤、骨、软骨、心脏等多组织的实验中被证明有较好实验效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于治疗烫伤的ns-gam基因活性支架，另一目的是提供该基因活性支架的制备方法。

本发明利用精氨酸-壳聚糖（arg-cs）作为高效的基因载体，与目的基因pdna结合后形成复合粒子arg-cs/pdna，再将该复合粒子包载与羧甲基壳聚糖（ncmc）与海藻酸钠（sa）交联得到的ncmc/sa支架中，从而构建了ns-gam基因活性支架。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于治疗烫伤的ns-gam基因活性支架，该基因活性支架以羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的交联支架搭载精氨酸-壳聚糖基因载体，所述精氨酸-壳聚糖基因载体包载目的基因。

进一步的，所述的羧甲基壳聚糖选用n-羧甲基壳聚糖。

所述用于治疗烫伤的ns-gam基因活性支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）将ncmc溶液与sa溶液混合均匀，经超声处理除泡；冷冻干燥得到固体支架；

（2）将步骤（1）中得到的固体支架再进行交联反应，再进行冷冻干燥处理即可得到交联稳定的ncmc/sa支架；

（3）将基因载体材料arg-cs与质粒进行复合得到arg-cs/pdna复合粒子，将步骤（2）制备ncmc/sa支架浸泡于arg-cs/pdna复合粒子的溶液中，充分浸泡，即可得到ns-gam基因活性支架。

本发明的优点和技术效果：

本发明制得的ncmc/sa支架的各外表面均光滑平整，从扫描电镜（sem）结果可以看出支架内的孔洞大小较均一，平均尺寸在100μm，支架孔隙率为50.9%，贯通性良好。再将arg-cs/pdna包载于ncmc/sa支架中，构建ns-gam基因活性支架，通过扫描电镜结果发现，ns-gam内部的孔径大小约为100μm，与ncmc/sa支架的孔径保持一致。

本发明制得的ncmc/sa通过细胞毒性实验检测其细胞相对增值率均在95%以上，表明ncmc/sa支架无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。乳酸脱氢酶、sem及激光共聚焦实验结果表明ncmc/sa支架非常有助于细胞的贴附和生长，nih3t3细胞可在支架中具有良好3d细胞生长效果。

本发明制备的ns-gam最大质粒负载量为21.9μg/mg。ns-gam基因活性支架在20d内测得的最终体外释放效率为88.5%，具有较好的体外释放活性，在开始10d之内具有较明显的缓释功能，且报告基因和功能基因均具有良好的体外传递和表达效率。

本发明制备的ns-gam对大鼠烫伤后的皮肤具有明显的创面修复作用，炎症反应较缓和，而且能够通过实现有效体内转染促进创伤修复，具有非常显著的促进皮肤深ⅱ度烫伤修复的功能，可产生较理想的良性恢复效果。

附图说明

图1为ncmc/sa支架外观图。

图2为ncmc/sa支架表面扫描电镜图。

图3为ncmc/sa支架截面扫描电镜图。

图4为ncmc/sa通过mtt法测得的细胞相容性结果图。

图5为ncmc/sa通过ldh法测得的细胞相容性结果图。

图6为nih3t3细胞在ncmc/sa支架生长48h的sem图像。

图7为nih3t3细胞在ncmc/sa支架生长48小时的激光共聚焦扫描显微镜图像。

图8为ns-gam支架表面扫描电镜图。

图9为pdna从ns-gam体外释放曲线。

图10为ns-gam不同时间gfp转染结果；a：1天，b：3天，c：5天，d：7天，e：9天。

图11为ns-gam体外转染效率结果图。

图12为vegf和tgf-β1从ns-gam支架中在体外释放的定量检测结果图。

图13为创伤修复实验主要步骤示意图。

图14为术后各时间点的创伤面积比较图；a：对照组；b：ns-gam组。

图15为创面愈合率结果图。*表示同一时间点与对照组存在显著性差异（p＜0.05）。

图16为he染色的组织学图。a：对照组;b：ns-gam组。

图17为胶原蛋白含量结果图。a：对照组;b：ns-gam组。

图18为在不同时间伤口区域的vegf定量检测。*表示同一时间点与对照组存在显著性差异（p＜0.05）。

图19为在不同时间口区域的tgf-β1定量检测。*表示同一时间点与对照组存在显著性差异（p＜0.05）。

图20为不同时间伤口区血流速度结果图。上图：对照组;下图：ns-gam组。

图21为在不同时间伤口区域的血流速度量化图。*表示同一时间点与对照组存在显著性差异（p＜0.05）。

具体实施方式

以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。

实施例1

将ncmc溶解于无菌双蒸水中，室温条件下搅拌溶解，配制成浓度为3%（w/v）的溶液。同样方法，配制浓度为3%（w/v）的sa溶液。ncmc溶液与sa溶液按体积比7:3混合均匀，经超声处理除去溶液中的气泡。将处理好的混合液小心倒入直径3cm的平皿，冷冻干燥法得到干燥的固体支架。将该支架置于1%cacl2溶液中进行交联反应12h，反应结束后用无菌水洗涤多次，除去吸附在支架材料上面多余的cacl2溶液。再次进行冷冻干燥处理，可得交联稳定的ncmc/sa复合支架。

由实施例1制备的ncmc/sa支架呈扁的圆柱形（如图1所示），颜色呈白色，直径大约24mm，高度约6mm。从图中清晰可见支架的各外表面均光滑平整，具有较理想的柔韧性，便于实验操作。ncmc/sa支架的sem观察如图2和图3所示，从图中可看出支架内的孔洞大小较均一，且贯通性良好，经计算其平均尺寸在100μm，支架孔隙率为50.9%。

实施例2

由实施例1中制备的ncmc/sa支架的浸提液按照国标iso10993-5制备。取对数生长期的nih3t3细胞，调整密度为4×10⁴个/ml，接种到96孔板中,在37℃,5%co2条件下孵育24h。吸弃原培养基，分别加入含不同稀释倍数的ncmc/sa支架的浸提液的培养基，其中所含原始浸提液的浓度分别为100%、50%和25%。培养24和48h后，利用mtt法检测支架的细胞安全性，结果如图4所示，在各浸提液浓度范围内，各组细胞相对增值率均在95%以上，表明ncmc/sa支架无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。不同浓度浸提液之间无显著差异，结果具有一致性。

实施例3

取对数生长期的nih3t3细胞，调整密度为4×10⁴，接种到ncmc/sa支架上,在37℃,5%co2条件下用dmem常规培养基分别培养24h和48h。部分样片吸取培养基，1000rpm离心5min，取上清液，利用乳酸脱氢酶（ldh）试剂盒测定乳酸脱氢酶活性（具体方法按说明书操作），结果如图5所示。在24h和48h时，支架中生长的细胞与对照组比较，相对增值率分别为94.7%和100.8%，表明ncmc/sa支架非常有助于细胞的贴附和生长，推测可能与其中的ncmc成分有密切关系，此前研究已表明ncmc对成纤维细胞的生长具有促进作用。生长有nih3t3细胞的ncmc/sa支架经脱水、二氧化碳临界点干燥等处理，采用sem方法观察其表面，结果如图6所示，nih3t3细胞在支架材料表面生长数量较多，可形成较完整的细胞片层，并可见由细胞正常生长代谢分泌产物形成的细胞外基质。接种nih3t3细胞的支架用hoechst33258染料进行染色（具体方法按说明书操作），激光共聚焦显微镜下观察细胞形态和数量，如图7所示，由图可见细胞可进入支架材料内部生长，细胞数量较多且分布均匀，具有良好的3d细胞生长效果。

实施例4

将基因载体材料arg-cs与质粒按n/p=45进行复合，在4℃环境中，10mg干燥的ncmc/sa支架材料浸泡于600ularg-cs/pdna复合粒子的溶液中（其中含800μg质粒），充分浸泡，待复合粒子充分进入支架材料内部。24h后将支架材料取出，浸入500ulpbs缓冲液中，小心冲洗5min以除去游离的复合粒子，重复冲洗2次。根据游离复合粒子的含量计算ncmc/sa支架材料对arg-cs/pdna复合粒子的最大负载量，利用sem观察ns-gam活性支架的形貌。ns-gam的sem图片如图8所示，ns-gam内部的孔径大小约为100μm，与ncmc/sa支架的孔径保持一致，在构建活性支架的过程中未对其内部孔径的大小及贯通性造成改变。从较高放大倍数的图片上可见，部分arg-cs/pdna复合粒子可附着于支架材料孔洞的内壁上。经计算，ns-gam对arg-cs/pdna复合粒子的最大质粒负载量为21.9μg/mg。

实施例5

将实施例1中制备的10mgns-gam基因活性支架4℃条件下浸泡于500ulpbs缓冲液中，缓慢释放20d，每次取出5ul测定其中质粒浓度，并补充新鲜pbs5ul以保持总体积恒定，根据质粒浓度绘制ns-gam基因活性支架的释放曲线。其在20d内的体外释放曲线如图9所示，在开始10d内释放速度较快，累计释放量可达85%；从10d往后的释放速度较为缓慢，累计释放量不到5%；在20d内测得的最终体外释放效率为88.5%，表明该ns-gam基因活性支架具有较好的体外释放活性，尤其在开始的10d之内具有较明显的缓释功能。

实施例6

ns-gam基因活性支架的体外转染效率利用nih3t3细胞进行了pegfp-c1、pgl3-luc、pcdna3.1(+)-mvegf164和pcdna3.1(+)-tgfβ1多种质粒的转染研究。在1d、3d、5d、7d和9d时，ns-gam活性支架体外释放arg-cs/pdna复合粒子的缓释溶液如实施例5方法获得。取对数生长期的nih3t3细胞，调整密度为8×10⁴，接种到24孔板中,在37℃,5%co2条件下孵育24h。吸弃原培养基，分别加入ns-gam活性支架不同时间的缓冲液。培养4h后，吸弃培养基，加入正常dmem含血清培养基培养。细胞转染48h后用倒置荧光显微镜进行观察荧光观察。图10显示的是gfp基因的转染结果，可见其转染效果与复合粒子释放时间密切相关。随着时间的增长，转染效率逐渐提高，在9d时镜下观察到转染gfp的细胞数量较多，荧光亮度也较强。

荧光素酶基因的具体转染方法与gfp相同，转染48h后，吸去培养基，用1mlpbs洗涤一次，加入200μl1×lysisreporterbuffer裂解细胞，4°c12,000g离心3min，取20μl上清液用luciferaseassaysystem检测荧光素酶活性。荧光素发射的荧光信号由酶标仪采集，每组样品的基因转染效率以rlu/(mgprotein)表示。细胞裂解物中的总蛋白浓度用bcaproteinassaykit检测，以牛血清白蛋白（bsa）作为蛋白标准品。luc基因转染的定量测定结果如图11所示，在1d时luc表达酶活为2×10⁶rlu/mg蛋白；而在9d时，其表达酶活为5.7×10⁶rlu/mg蛋白，是第1d时的2.8倍，该结果与gfp基因表达结果相一致。

vegf和tgf-β1基因的具体转染方法与gfp相同，转染48h后收集细胞培养液，4℃条件下10,000rpm离心10min，取上清液，利用elisa法测定蛋白含量，具体操作按vegf和tgf-β1试剂盒测定。各孔对应细胞裂解物中的总蛋白浓度用bcaproteinassaykit检测，以牛血清白蛋白（bsa）作为蛋白标准品。vegf和tgfβ1基因转染效率是通过elisa试剂盒进行定量检测的，具体结果见图12。通过ns-gam活性支架缓释的vegf和tgfβ1基因均可在nih3t3细胞中显著表达，其表达效率随着时间的推移而提高，在第9d时二者的表达量是1d时的3-4倍。从曲线的斜率变化可见，在开始7d时，蛋白的表达效率提高较快，最后2d其表达效率提高速度则相对平缓。该结果充分说明对创伤修复具有功能性作用的治疗基因可通过ns-gam活性支架系统实现有效的体外转染和成功表达。

实施例7

封闭群纯系雄性wistar大鼠40只,体重220±10g,购买于成都简阳动物中心。随机分为2组，每组20只，分别为实验组和对照组。实验组创面采用ns-gam基因活性支架处理，对照组创面以生理盐水处理。单笼饲养，饲以标准颗粒饲料。光照周期为12h，室内通风良好，氨浓度小于20ppm，相对湿度为40%-70%，室温保持在18-22℃，稳定饲养1周待实验。

利用水合氯醛溶液按350mg/kg剂量对大鼠进行腹腔麻醉，局部脱毛并用70%乙醇消毒。利用自制玻璃器皿将大鼠背部皮肤局部（直径2.4cm的圆形）浸入95℃恒温水浴中，持续15s，造成深ⅱ度烫伤，损伤面积为直径3cm的圆形，约是体表面积的8%。术后实验组敷用ns-gam活性支架9d；对照组以无菌生理盐水处理创面。两组创面均采用无菌单层纱布捆扎固定，各大鼠单笼饲养。手术过程为：麻醉-去毛-消毒-烫伤-敷药-包扎，主要手术步骤和术后护理过程如图13所示。烫伤后的大鼠分别单笼饲养，每日对创面部位进行观察拍照。结果如图14所示，由图可见术后各组均无感染化脓等现象出现，但对照组在术后早期（3d）有明显水肿、发红现象，且持续时间较长；在相同时间点，对照组创面面积明显大于ns-gam组创面面积，说明其愈合速度较慢；在创面愈合晚期（21d），ns-gam组创面恢复良好，皮肤表面光滑，而对照组创面尚未完全愈合，且皮肤表面不太光滑。该结果表明使用ns-gam的创面在愈合速度和效果方面均优于对照组。

术后每天对大鼠皮肤创面进行观察拍照，利用imagej软件按下列公式对大鼠创面愈合率进行计算：

创面愈合率（healingrate,hr,%)=(a0-at)/a0×100%，其中a0和at分别代表起始创伤面积和各时间点测量的创伤面积，通过imagej软件计算其创伤愈合率，具体结果如图15所示，在修复早期（5d）对照组和ns-gam组的修复速率没有明显差异，其创面愈合率均在10%以下。修复1周后，ns-gam组的创面愈合率明显升高，在14d时与对照组相比出现显著性差异。ns-gam组在烫伤后22d全部愈合，对照组在30d时才愈合，可见ns-gam可大大加快创面愈合时间，具有良好的促进创伤修复的功能。

术后3d、12d和21d分别处死大鼠，取创面部位全层皮肤样本固定于10%福尔马林中，石蜡包埋切片，分别进行he染色和masson’strichrome染色，倒置显微镜进行镜下观察。图16显示的是皮肤样本的he染色照片，从图中可以看出在3d时对照组皮肤组织靠近上表层烫伤部位处表现出严重的炎症反应和明显的局部组织坏死症状；而在ns-gam组只有较少局部位置出现炎症反应，且炎症反应相对缓和，炎症细胞数量较少。12d时的照片显示ns-gam组的创伤面积明显减小，肉芽组织有所增多。此前有研究认为肉芽组织的形成与创面的永久性愈合关系密切，可以填补创伤造成的缺损，并为新的上皮化奠定基础；对照组则出现了明显的增生现象，可能由于其严重的炎症反应导致的炎性增生所致。21d时ns-gam组的创伤缺损部位已完全愈合，已形成完整的新生上皮层；对照组在该时间仍未形成完整的上皮层，局部可见间断不连续的现象。胶原蛋白是皮肤的真皮层中含量最丰富的蛋白质，与真皮层的结构、弹性和力学性能关系密切，因而胶原蛋白的含量是皮肤深二度烫伤创面恢复情况的一个重要评价指标。胶原蛋白的重塑和成熟度通过masson’strichrome染色来进行观察，具体结果见图17。由图可见，深二度烫伤对皮肤的胶原蛋白造成了较严重的破坏，各组胶原蛋白的修复及重建均是随时间推移而逐步完善的。在12d时ns-gam组可见较多新生胶原蛋白，21d时已生成大量成熟的新生蛋白，且蛋白排列整齐有序；而对照组在12d时新生蛋白数量较少，且交联现象严重，21d时新生胶原蛋白层较薄，排列杂乱无序，局部仍存在交联现象。该结果表明ns-gam基因活性支架对皮肤真皮层胶原蛋白的合成具有促进作用，从而加快皮肤创面的修复。

术后1、3、5、7、9、12、15d分别处死大鼠，取创面部位全层皮肤样本，加入组织裂解液（100mg/ml），用组织匀浆器进行匀浆。匀浆液于4℃条件下10,000rpm离心10min，重复操作2次。取上清液，利用elisa法测定蛋白含量，具体操作按vegf和tgf-β1试剂盒测定。各孔对应细胞裂解物中的总蛋白浓度用bcaproteinassaykit检测，以牛血清白蛋白（bsa）作为蛋白标准品。vegf是创伤后促进血管新生及血管循环侧支新生的主要蛋白因子，其测定结果如图18所示。ns-gam组在各测定时间点vegf表达量均高于对照组，特别在5d、7d和9d时与对照组之间有显著差异。这种差异性与ns-gam基因活性支架对vegf基因的缓释和其在创面部位的表达关系密切，可高效促进创面部位的血管新生。tgfβ1是与创伤修复关系密切的另一蛋白因子，可促进成纤维细胞的增殖、分化，并促进胶原蛋白的合成和沉积等，已有研究报道tgf-β1分泌的升高有助于创伤的修复。创面部位tgfβ1的表达量见图19，ns-gam组在各测定时间点的表达量均高于对照组，在3d和5d时二者具有显著性差异。

为研究各组动物创伤部位血管重建的恢复情况，分别于术后第0、1、3、5、7、9、12、21d采用ldf检测大鼠背部pu。灌注量（perfusionunit，pu）＝测量体积内血细胞的浓度（cmbc）×平均血细胞运动速度（v）。采用腹腔注射水合氯醛的方式麻醉大鼠，将其置于操作台上，用胶布固定，充分暴露其背部创伤部位。将ldf的探头置于大鼠背部创面部位，开始检测，待各项指标趋于平稳时开始记录，计算1min内pu的平均值。由于皮肤组织中的血管均位于真皮层及皮下组织，新生血管对创伤组织的修复有重要影响。因而血流灌注量的高低直接反映了真皮层中血管量的丰富程度，间接说明了深二度烫伤后真皮层的修复程度。如图20和图21所示，正常的皮肤组织的血流灌注量为120mm³/s；在烫伤后1d时，血流灌注量剧烈降低至60mm³/s，仅为正常值的1/2；烫伤后5-12d是血流灌注量恢复最快的时间，其中ns-gam组恢复速度要快于对照组，在7d和9d时二者具有显著性差异。该结果说明ns-gam组新生血管的数量和速度要明显由于对照组，这与ns-gam的活性支架功能和基因缓释机能是密不可分的。