眼后巩膜加固术用生物补片及其制备方法与流程

本发明涉及一种眼科用医疗器械，具体是治疗高度近视的眼后巩膜加固术用生物补片及其制作方法。

背景技术：

患者因遗传和微环境感染因素致眼后巩膜厚度变薄，强度减弱，发生持续性扩张，眼轴不断延长，负屈光度数不断增加呈现高度近视进行性加重；后巩膜的持续扩张可导致视网膜脱离，随着病程的不断进展，患者多在成年后因发生眼底病变而致盲。据统计，中国学生在小学、中学、大学的不同阶段近视眼发生率分别是30%、50%、70%，其中又有3--5%发生高度近视。

目前对高度近视的矫正手段有：佩戴眼镜、激光切削角膜、前房带晶体植入人工晶体；前三者仅可矫正视力，无法防止高度近视的发展、另外激光切削角膜不适合超过600°（-6d）的高度近视，有造成圆锥角膜和在角膜疾患时发生穿孔而致盲的风险。

后巩膜加固术是控制高度近视病程进展的唯一方法，其原理是：将加固材料补片移植固定在后巩膜外表，使后巩膜细胞迁徙到生物补片的网架中生长，相互融合形成厚度增加的新巩膜，后巩膜强度增加，扩张被限制，终止眼轴延长和近视屈光度数增加，保护脉络膜和视网膜，阻止眼底病变的发生和加重。

近年来实验研究发现，后巩膜加固术在术中固定补片时加压缝合，使后巩膜受到前后方向半环状带扣压使眼轴缩短，可用于高度近视性黄斑劈裂和黄斑区视网膜脱落的治疗。

后巩膜加固术用材料分两类：生物材料和非生物材料。生物材料来源于生物体，包括自体材料，异体材料和异种材料。自身材料来源于自身如阔筋膜，取材繁琐且造成患者新的创伤。异体材料和异种异体动物巩膜、硬脑膜等，经过处理后组织相容性好，植入人体后容易降解，张力变小，韧性变小，容易被拉伸延长，影响手术效果；但同种异体组织材料来源稀缺且法规禁止其作为商品进行交易；非生物材料有硅胶，涤纶布，某些高分子材料的凝胶等，这些材料来源广泛，植入人体后不易降解，张力和韧性可靠，不易被拉伸延长，但不能与后巩膜形成融合，新生血管也不能长入，且组织相容性差，会发生慢性无菌性炎症-免疫反应。

中国专利cn102525729b，公开了一种用牛、马、猪的心包或硬脑膜制备人眼后巩膜加固术用生物补片的技术方案；

所述动物的硬脑膜凸凹不平如同核桃皮，血管呈脉络样分布，厚薄不均，难寻合适的表面积用于手术，补片成材率极低；

所述动物的心包组织结构是由胶原纤维与弹性纤维组成，其固有的胶原纤维和弹力纤维呈自然弯曲，可被外力作用延伸扩张，即使交联后，其弹性扩张率仍在10-30%，用于眼后巩膜加固术后容易被扩张的宿主后巩膜拉伸延长，眼轴继续延长、破坏手术效果。

眼后巩膜加固术用生物补片的生物力学要求是：补片在许用强度下的弹性伸长率须≤3%。

目前、后巩膜加固术用生物补片是制约该手术开展的材料瓶颈。

所述动物（牛、马、猪）的心包材料是一种亲水性生物材料，具有纤维定向性，可控制交联度，经过生物工程技术处理、呈现弱抗原性，生物相容性好，植入体内无排异反应，与细胞亲和力高，可刺激细胞增殖、分化和生物降解等优良特性。植入人体后，被降解为氨基酸、短肽成为组建细胞的源材料或通过代谢途径排出体外。（亲水材料对细胞的帖附、生长和营养物质的传递至关重要。）

目前：牛心包在心血管外科用于先心及心血管的修补——（心脏瓣膜、新血管替代）；用于脑膜的修补——（外伤、脑内手术，修补防止皮下与脑组织粘连，防止手术癫痫的发生）；用于眼科整形——（支撑、加固、修复、睑下垂的吊带）；用于普外手术——（腹壁缺损，如腹股沟疝）。

以目前公开的技术方案以动物心包制备生物补片，通过脱细胞洗涤和交联去除了抗原性，增强了材料的韧性、强度；但并未修正材料的某些生物力学指标；如弹性，拉伸率。虽然有优良的生物相容性，但不能满足后巩膜对补片的生物功能性要求，无法保障手术的远期疗效。

对眼后巩膜加固材料的生物力学要求，必须要优于人眼巩膜。

有必要提出新的制备方法，克服上述技术方案中的不足，为后巩膜加固手术提供不弱于天然巩膜属性的眼后巩膜加固术用生物补片，以满足众多患者诊疗高度近视的需要。

京尼平是一种环烯醚萜类杂环化合物，具有羟基、羧基等多个活性官能团，是一种优良的天然交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料用于临床医学诊疗过程，如人造骨骼、组织修复、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛（其毒性是戊二醛的万分之一）和其他常用化学交联剂。也具有除抗原作用，可以与胶原分子中的赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸等残基的游离氨基反应。细胞毒性低，是因为京尼平形成的环形交联比其他的网状交联及线状交联更加稳定。京尼平与氨基酸反应生成蓝色色素，蓝色物质可能由京尼平和甲胺反应产生，由40—44个单体组成，这提示，它可在胶原分子内部形成环状结构的分子交联；京尼平交联胶原较其他交联方法有最大的热收缩温度（ts）、弹性模量、拉伸强度；且植入人体后，不易发生钙化。交联后的生物膜材料韧性、机械强度及抗降解能力等性能与交联度有关，随着交联度的提高，韧性增加，机械强度提高，抗降解能力提高，但随着材料硬度增大其顺应性下降。交联度与交联反应的条件，如温度、ph值、交联剂浓度和交联时间等有关。

技术实现要素：

本发明的目的是为眼后巩膜加固术提供一种不弱于人眼后巩膜生物力学及生物功能要求的异种异体生物补片；同时提出实现上述要求的异种异体生物补片的制备方法。

本发明包括如下步骤：

①取材制备毛坯：a.取新鲜检疫无疾病的成熟牛、猪、马的心包，去除杂质、脂肪、系带，消毒清洗；b.使用洗涤剂去除脂肪，以生理盐水冲洗3次；c.将有破损的、心脏大血管出入口处明显增厚不适合应用的部分减除；d.将上述制备的心包毛坯材料置入消毒液内保存备用。

②脱细胞制备基材：a.将心包毛坯材料浸入脱细胞溶液内，2～8h，使心包内细胞结构被破坏、溶解，b.将上述脱细胞处理后的毛坯材料使用pbs溶液洗涤3次，每次5min；c.上述步骤a.和步骤b.重复三次，得到脱细胞后的细胞膜基材；

③梳整纤维：a.取上述脱细胞心包基材厚度适中部分，制作测试标准样，测得其断裂强度；b.将待处理的心包基材平铺在交联支架上，在毛坯材料的外周以支架为支撑施加外向作用力，该作用力是心包断裂强度的60～95%；要求力值可使心包结构中的胶原纤维和弹力纤维被外力梳整拉伸，呈完全拉伸状态时为佳（最大弹性形变区或接近塑性形变区）；c.保持外向拉力下，在交联支架上固定基材。

④交联制备精材：a.将上述交联支架及心包基材完全浸入交联剂溶液内，晃动处理；b.交联（设备）参数是：温度4～35℃；时间24～168h；晃动角度＞±1°；晃动频率1～100次/min;交联剂溶液ph值5～14范围内；c.交联剂：所述的交联剂是浓度为0.25～2.0%京尼平溶液，溶剂可以是下列液体的一种：1～20%的酒精、去离子水或蒸馏水；d.心包基材与交联剂溶液之比为10～30%（w/v）；e.观察交联过程，心包基材逐渐与交联剂发生化学反应，胶原纤维和弹力纤维之间发生分子间交联和分子内交联，交联过程中，京尼平的活性官能团及心包胶原纤维的氨基酸残基发生交联后可形成一种多聚体深色（紫蓝色）无毒色素；观察颜色均一、稳定、基材质地增加、强度增加，韧性增加；基材内外颜色一致时，交联基本完成；f.交联结束后，将心包由交联支架上取下，大体观察：基材应继续保持与支架上的平整、光滑、柔顺状态，且不再会发生如未进行梳整工序时的回弹、挛缩、形变现象。如此得到交联后心包精材，该精材在耐受许用强度及工作强度时的拉伸延长率≤3%；

所述的ph值调节、可用碳酸氢钠缓冲液对交联剂溶液ph值在5～14之间进行调整，ph值＜8时反应后心包呈紫色，ph值＞10时反应后心包呈（深）蓝色。

⑤交联后处理：a.取交联后完整无裂口、厚薄基本一致的心包精材由交联器内取出，使用蒸馏水水反复清洗3次，每次3～5min；b.使用5～30%甘氨酸溶液对心包精材进行中和反应，以消除残留的交联剂。c.再对心包精材使用蒸馏水进行漂洗3-5次，每次3—5min；

d.按规定制备测试样，测试交联后心包精材的生物力学特性：其断裂强度较未交联时提高（28～68mpa、不同厚度），不低于许可强度20mpa，远大于工作强度12mpa；心包精材的定荷拉伸率＜3%；含水率＞600%。

⑥包装灭菌：a.成型：选取完好、厚薄基本一致的经测试合格的精材裁剪成梭形或条带状的眼后巩膜加固术用生物补片；b.包装：将裁剪后的补片放入含有无菌生理盐水的泡罩容器内进行热合密封包装，包装机参数和密封性能需要工艺验证和确认，包装标识和编码要符合相关法规要求；c.灭菌，将包装完好的生物补片进行灭菌处理；灭菌方式可以是伽马射线、直线加速器、化学剂或环氧乙烷；灭菌设备和工艺参数及最终灭菌效果需经过验证和确认，保证灭菌质量的无菌水平符合法规要求；灭菌后成为眼后巩膜加固术用生物补片。

所述的步骤①取材中，牛心包来源是有3—5岁龄的非疫区饲养经过检疫检验定点屠宰的新鲜牛心包；猪心包是饲养一年以上的非疫区饲养经过检疫检验定点屠宰的新鲜猪心包；

所述的步骤②脱细胞溶液是指：tritonx-100、洗涤剂可以是pbs溶液；脱细胞方法还可以是以超临界co2流体真空设备溶解脱细胞、反复冻融方式；

所述的步骤③梳整方法是：用万能电子材料试验仪，按照规范方法取得待处理牛心包测试样本，测得其断裂强度及延伸率；交联支架是可以夹持且可调节张力的环形或多边形紧固支架，材料是稳定的不与交联剂发生反应的材料制成；张力的调节可以使用拉力传感器或拉力计测得，也可通过断裂拉伸率比对获得；

所述的交联仪器是包含有：基本箱体、内有温度设定的测控电路及加热元件的基本结构，还具有定时器，搅拌或晃动装置且其速率和幅度可设定和调节；

所述的交联剂ph值范围在5.0～14.0之间，可以通过缓冲液进行调整；缓冲液可以是下列额一种或几种：磷酸氢二钠/氢氧化钠；氯化钠/氢氧化钠；碳酸二氢钠/磷酸二氢钾；碳酸钠/碳酸氢钠；

通过改变交联剂溶液ph值，范围在5.0～14.0之间，可对应控制心包被交联后的颜色由蓝色向紫色转变。

本发明与前述技术方案比较，具有以下进步：在心包进行脱细胞后对其测试断裂强度，据此计算出心包接近塑形状态时的拉伸力，然后以此拉伸力对心包外周施加（该拉力），以实现对心包的胶原纤维和弹性纤维的梳整拉伸，使其处于伸展平直状态；又避免拉力不适造成心包被过大的拉力损坏（进入塑性形变区，纤维破坏）；在此状态下予以交联处理，可重新构建的胶原纤维呈顺直状态下的交联结构网，消除心包纤维的自然回弹、挛缩、变性现象，使得交联后的心包更加平整、顺滑、舒适质地感更好，关键是满足的后巩膜的弹性要求，拉伸率小于3%。

本发明的纤维梳整/交联方法还可控制交联后生物材料（心包）的弹性度、拉伸率，以满足不同的生物力学要求。

由于本发明采用了以ph值调节，可以控制交联反应后生物补片的颜色，根据需要更加醒目，手术时与周边组织更易分辨，便于操作。

附图说明

附图1是心包在自然状态下组织切片结构图；

附图2是心包脱细胞后组织切片结构图；

附图3是心包纤维经过梳整且交联后纤维组织切片在普通光镜下的组织结构图。

具体实施方式

参照附图、典型的本发明实施例包括如下步骤：

①取材制备毛坯

a.取材：鲜检疫无疾病的健康成熟牛、猪、马或羊的心包，去除杂质、脂肪、系带，消毒清洗；

b.选材：将心包破损处、明显增厚的心脏大血管出入口边缘处不适合应用的部分减除；

c.去脂：使用洗涤剂去除心包内的脂肪，然后以生理盐水冲洗3次；此时触摸心包有涩涩感，无滑脱感，成为心包毛坯。

d.消毒：将上述制备的心包毛坯材料置入消毒液内保存备用。

所述的洗涤剂可以是下列的一种或几种的混合应用：去污剂、清水、洗洁精稀释液

所述的消毒剂可以是：化学或生物制剂的一种或多种配伍：如0.5%过氧乙酸、庆大霉素生理盐水溶液、青霉素/链霉素生理盐水溶液、新洁尔灭溶液等；

附图1是经过上述步骤处理后的心包毛坯材料的组织切片图：普通光学显微镜下可见心包膜材中有束状胶原纤维呈弯曲波浪状分布、其间有大量成纤维细胞核存在。

②脱细胞制备基材

a.将心包毛坯浸入脱细胞溶液内，2～8h，使心包内细胞结构被完全破坏、溶解，

b.将上述脱细胞处理后的毛坯使用pbs溶液洗涤3次，每次5min；洗脱细胞残留碎片；

c.上述脱细胞步骤a.洗涤步骤b.重复三次。得到脱细胞后的心包基材。

附图2是经过脱细胞处理后，普通光学显微镜下可见心包组织切片中大量胶原纤维束呈自然弯曲状态，纤维束间空隙内未见到完整的细胞核组织。

③梳整基材纤维

a.取脱细胞后的心包基材适中的部分，做测试样本，测得其断裂强度并记录；

b.将上述心包基材平铺在交联支架上，以支架为支撑对基材外周施加外向作用力，该作用力是心包基材断裂强度的60～95%；要求力值是使心包结构中的胶原纤维和弹力纤维被作用力梳整呈完全拉伸状态时为佳（即使纤维超越弹性形变区接近或进入塑性形变区）；

c.在交联支架上固定基材、以保持外向拉力。

所述的断裂强度是将基材按测试要求剪裁成规则的测试样本、采用电子万能材料试验台测试的；

所述的交联支架是采用与交联剂不发生化学反应的材料制成的圆形或多边形的中空支架，可将基材固定、并可对基材施加向外作用力，该作用力可以被拉力传感器或拉力计监测。通过调节该作用力，可控制基材的弹性拉伸率。

④交联制备精材

a.将上述交联支架及固定后基材完全浸入脱细胞热溶液内，晃动条件下交联；

b.交联（设备运行）参数是：温度4～35℃，时间24～168h；交联支架或交联剂晃动角度＞±1°；晃动频率1～50次/min;交联剂溶液ph值5～14；

c.交联剂：所述的交联剂是浓度为0.25～2.0%京尼平溶液，溶解京尼平的溶液可以是以下液体的一种：1～20%的酒精溶液、生理盐水、无菌去离子水或蒸馏水；交联剂的ph值可在6～14.0范围内使用缓冲液进行调整；

d.被交联物质（心包基材）与交联剂溶液之比为10～30%（w/v）；

e.观察交联过程：心包基材与交联剂发生化学反应，胶原纤维和弹力纤维之间发生分子间交联和分子内的交联，交联过程中，京尼平的活性官能团及心包胶原纤维的氨基酸残基发生交联后可形成一种多聚体深色（紫蓝色）无毒色素；观察基材的颜色均一、稳定、基材质地增加、强度增加，韧性增加；当基材内、外、全层颜色一致时，交联基本完成；

f.交联结束后，将心包由交联支架上取下，大体观察：基材应继续保持与支架上的平整、光滑、柔顺状态，且不再发生如未进行梳整工序时的回弹、挛缩、形变现象。如此得到交联后心包精材，该精材在耐受许用强度20mpa时的拉伸延长率≤3%；

所述的ph值调节，可以使用碳酸氢二钠/氢氧化钠缓冲液对交联剂溶液进行；将交联剂溶液的ph值控制在8～14之间。ph值＜8时交联后心包精材呈蓝色，ph值＞8时交联后心包精材呈紫色。

⑤交联后处理：

a.漂洗：将交联后心包精材由交联机内取出，用蒸馏水水反复漂洗3次，每次3～5min；

b.中和：使用5～30%甘氨酸溶液对心包精材进行中和反应，以消除残留的交联剂。

c.清洗：再对心包精材使用蒸馏水进行漂洗3-5次，每次3—5min；

d.测试：取规定测试样，测试交联后心包精材的生物力学指标：其断裂强度较未交联时明显提高（28～68mpa），不小于许用强度20mpa，远大于工作强度12mpa；心包精材的断裂拉伸率＜5%；定荷拉伸率≤3%；含水率＞600%。

附图3是经过梳整、交联处理后的牛心包膜材组织切片，在普通光学显微镜下观察，可见胶原纤维呈束状顺直分布，纤维束间隙缩小，其间无细胞成分存在。组织学结构支持上述测试数据和结果。

⑥成型包装灭菌

a.成型：选取完好、厚薄基本一致的经测试合格的精材裁剪成梭形或条带状的眼后巩膜加固术用生物补片；

b.包装：生物补片放入含有无菌生理盐水的泡罩容器内进行热合密封包装，包装机参数和密封性能需工艺验证和确认，包装材料外部标识和编码应符合相关法规要求；

c.灭菌：将包装完好的生物补片进行灭菌处理；灭菌方式可以是伽马射线、直线加速器、化学剂或环氧乙烷；灭菌设备和工艺参数及最终灭菌效果需经过验证和确认，保证灭菌质量的无菌水平符合法规要求；灭菌后成为眼后巩膜加固术用生物补片。

所述的步骤①取材中，牛、马心包来源是有3—5岁龄的非疫区饲养经过检疫检验合格在定点屠宰的新鲜牛心包；猪心包是非疫区饲养一年以上经过检疫检验合格并在定点屠宰的新鲜猪心包。

所述的步骤②脱细胞溶液是指：以下溶液的一种或几种；tritonx-100，超临界co2流体。

所述的交联设备是包含有温度设定、温度传感器及测控电路及加热元件的基本结构，还具有定时器，搅拌或晃动装置且其速率和幅度可设定调节。

所述的交联剂是：药用级京尼平呈白色结晶粉末，纯度98%。

所述的交联剂ph值范围在5～14之间，可以通过缓冲液进行调整；缓冲液可以是下列的一种或几种：磷酸氢二钠/氢氧化钠；氯化钠/氢氧化钠；碳酸二氢钠/磷酸二氢钾；碳酸钠/碳酸氢钠。

通过改变交联剂溶液ph值，范围在5-14之间，可对应控制心包被交联后的颜色由紫色向蓝色转变。