盐酸小檗碱在抑制胰腺癌中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及盐酸小檗碱在抑制胰腺癌中的应用。

背景技术：

胰腺癌是临床常见的恶性肿瘤，其恶性程度高、致死率高、预后差，因其起病隐匿，大多数患者被诊断时已经处于中晚期。目前胰腺癌5年生存期大约只有5％，在全世界范围内的死亡率很高，中国的死亡率为90.8％，美国的死亡率为78.5％，加拿大的死亡率为95.0％。根据中国流行病学调查提示，胰腺癌是中国排名第七的致死性肿瘤疾病。目前，临床上除了手术切除外，放疗及化疗都只能有限的延长胰腺癌患者生存期，且只有10～15％的患者在明确诊断后有手术指征，大多数患者在诊断时已经无法进行手术根治切除。人们尝试通过各种手段来提高化疗疗效，在提高患者的生存期的同时，我们也发现越来越多的放化疗带来的毒副作用影响患者的生存质量。因此，现在急需研究发展出新的治疗手段，提高患者生存期的同时，降低治疗的毒副作用。

近年来，越来越多研究人员把注意力放到了中国传统的中医药领域中，期望从中医药中找到新的天然化合物提供新的药物资源。

黄连(coptischinensisfranch.)，在中医理论指导下已有两千多年临床应用的历史，是名符其实的具有悠久历史的中草药，黄连最早自于《神农本草经》，其主要功效包括清热燥湿，泻火解毒，多被用于治疗湿热症，尤其长于治疗湿阻中焦，寒热互结的呕吐痞满吞酸。黄连的主要有效成分是盐酸小檗碱，属于异喹啉生物碱，也是黄连干燥处理后最丰富的生物碱(5.20～7.69％)。现代药理研究发现，盐酸小檗碱具有多种抗肿瘤作用，对于肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病等都有抑制作用，但由于盐酸小檗碱是季铵盐结构，亲脂性差，难以通过细胞的脂质膜在体内较难达到有效需要浓度，盐酸小檗碱体内抗肿瘤效果不如其体外明显，这使得盐酸小檗碱在慢性病治疗中的应用变得非常具有挑战性，目前鲜有关于盐酸小檗碱抑制胰腺癌的体内实验结果的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明需要解决的技术问题是现有技术中对胰腺癌的有效治疗方案少，治疗的主要手段是化疗，化疗在提高患者的生存期的同时也带来了较大的毒副作用，患者生存期短，预后差，影响患者的生存质量。

由此，本发明以天然产物黄连中的活性成分—盐酸小檗碱为研究对象，提供盐酸小檗碱在抑制胰腺癌中的应用。通过体内实验方法和体外实验方法探讨盐酸小檗碱对胰腺癌的抑制和对抗增殖作用，以期进一步推广到临床，应用盐酸小檗碱作为胰腺癌患者的辅助治疗手段。

可选地，所述体内实验方法是选择免疫抑制裸鼠和正常的老鼠建立胰腺癌原位移植瘤模型，观察盐酸小檗碱对胰腺癌原位移植瘤的影响。本发明将盐酸小檗碱应用于上述成瘤后的小鼠中，可见盐酸小檗碱干预后原位瘤的生长速度明显降低，小鼠生存率显著提高。

进一步可选地，所述盐酸小檗碱的使用剂量为5～500mg/d。优选地，所述盐酸小檗碱的使用剂量为20～50mg/d。

与目前临床上一个成人0.3～0.9g每日的使用量相比，通过本发明中建立的胰腺癌原位移植瘤模型，我们发现：在低剂量时，盐酸小檗碱即呈现出良好的抑制胰腺癌活性。

可选地，所述体外实验方法是mtt法，检测盐酸小檗碱对胰腺癌细胞的体外增殖的抑制作用。盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞后，对胰腺癌细胞增殖有明显的抑制作用，且呈剂量与时间依赖性。

由以上技术方案可知，本发明提供了盐酸小檗碱在抑制胰腺癌细胞中的应用，可用于制备相关的药物中，在低剂量下，对胰腺癌即呈现出良好的抑制作用。此外，盐酸小檗碱来源丰富，价格低廉，安全性高，由此使用盐酸小檗碱作为治疗胰腺癌的手段，可以降低治疗胰腺癌的成本，以及减少因治疗带来的毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠生物荧光素酶发光成像结果图；

图2是本发明实施例1的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小动物成像roi测量结果；

图3是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的体重；

图4是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的肝脏h&e染色结果示意图；

图5是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的肿瘤h&e染色结果示意图；

图6是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肝脏图；

图7是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肿瘤图；

图8是本发明实施例1的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的生存曲线图；

图9是本发明实施例1的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠胰腺原位移植瘤重量分析图；

图10是本发明实施例2的第一组小鼠给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肝脏图；

图11是本发明实施例2的第一组小鼠给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肿瘤图；

图12是本发明实施例2的第一组小鼠给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的体重；

图13是本发明实施例2的第一组小鼠对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠胰腺原位移植瘤重量分析图；

图14是本发明实施例2的第二组小鼠给药干预42天后，对照组、更高浓度盐酸小檗碱组三组小鼠取出的肝脏图；

图15是本发明实施例2的第二组小鼠给药干预42天后，对照组、更高浓度盐酸小檗碱组三组小鼠取出的肿瘤图；

图16是本发明实施例2的第二组小鼠给药干预42天后，对照组、更高浓度盐酸小檗碱组三组小鼠的体重；

图17是本发明实施例2的第二组小鼠对照组、更高浓度盐酸小檗碱组三组小鼠胰腺原位移植瘤重量分析图；

图18是本发明实施例2的第二组小鼠给药干预42天后，对照组、更高浓度盐酸小檗碱组三组小鼠的生存曲线图；

图19是本发明实施例3中不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株panc-124、48、72小时后，抑制胰腺癌细胞株增殖的生存曲线；

图20是本发明实施例3中不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株miapaca224、48、72小时后，抑制胰腺癌细胞株增殖的生存曲线；

图21是本发明实施例3中不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株panc0224、48、72小时后，抑制胰腺癌细胞株增殖的生存曲线；

图22是本发明实施例3中不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株sw199024、48、72小时后，抑制胰腺癌细胞株增殖的生存曲线。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

实施例1：

本实施例通过免疫抑制裸鼠胰腺原位移植瘤实验，观察盐酸小檗碱对胰腺癌原位移植瘤的影响。

1、制备胰腺癌小鼠模型

实验动物：

spf级别免疫抑制裸鼠(balb/cann-nu(nude))，鼠龄为4～6周，雌性，体重18～20g，购自香港大学动物实验中心(laboratoryanimalunit)，饲养于独立通风系统的m2小鼠笼。动物使用及伦理通过香港大学动物伦理委员会(committeeontheuseofliveranimalsinteaching&research)许可culatrno.4077-16。实验操作者获得香港特别行政区政府动物执照(animallisence)，编号：(16-634)indh/ha&p/8/2/3pt.88。所有动物实验操作方案符合实验动物护理及使用指南。

具体实验方法：

将胰腺癌细胞株(kp3l)原位注射到胰脏上的裸鼠中。以下描述用于原位植入胰腺肿瘤的剖腹手术的方式：

(1)小鼠称重并麻醉，每只小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物0.2ml，其中，氯胺酮和甲苯噻嗪剂量分别为100mg/kg和10mg/kg；

(2)依次用酒精、碘伏、酒精、碘伏消毒手术部位。

(3)确认小鼠疼痛反射消失后，从中线左侧约1厘米切开皮肤和腹膜约1.5厘米，暴露脾脏并用干棉签稳定其位置；

(4)将邻近脾脏的胰腺尾部定位并暴露，然后将20μl胰腺癌细胞悬液注射到胰腺；

(5)注射器将在胰内保持30～60秒，直到基质凝胶固化；

(6)将组织放回到腹腔中，腹壁用可吸收缝合线关闭，皮肤用不可吸收丝线关闭；

(7)再次用酒精和碘伏擦洗再次封闭的手术部位，保持裸鼠处于温暖和干燥的状态；

(8)术后使用美洛昔康1～2mg/kg给药量的镇痛药，24小时采用7～10天；每日监测并记录术后护理卡片。

2、在接种胰腺癌细胞株成瘤后，将小鼠随机分为三组，分别为对照组、盐酸小檗碱低剂量组和盐酸小檗碱高剂量组。

3、小鼠成像

在手术后7日起每周一次通过腹膜内注射30mg/kg荧光素给小鼠进行成像研究。在注射前，将氯胺酮/甲苯噻嗪分别以100mg/kg和10mg/kg的剂量腹腔内注射给小鼠，然后给予荧光素，使用动物用体内成像系统(srimaestrotm2)成像，动物模型建立一周后，腹腔注射给药(对照组：生理盐水，低剂量组：5mg/kg，高剂量组：10mg/kg；每只小鼠一次不超过0.2ml药物溶液)，每周给予三次，持续5周。

4、小鼠成像roi测量。

5、将给药干预42天后的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠进行称重。

6、通过注射苯巴比妥(150-200mg/kg，i.p)在实验结束时将动物处死，解剖取出肝脏，观察肝脏形态并用hematoxylinandeosin(h&e)染色；取出胰腺原位移植瘤称重，并用h&e染色，统计分析盐酸小檗碱干预后两组瘤重变化及计算抑瘤率。

上述实验结果具体分析如下：

图1为对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠生物荧光素酶发光成像结果图。结果显示：胰腺原位移植瘤术后第七日，通过活体生物荧光素酶发光成像方法发现，对照组与盐酸小檗碱低剂量组及高剂量组的成瘤率均为100％，盐酸小檗碱组与对照组之间的原位瘤生长速度存在显著差异，盐酸小檗碱干预组原位瘤生长速度明显低于对照组。

图2为对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小动物成像roi测量结果。结果显示：

对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组1.33e+07±2.34e07p/sec/cm²/sr；低剂量组1.41e+07±2.55e+07p/sec/cm²/sr；高剂量组1.23e+07±2.22e+07p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

给药干预1周后三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组1.94e+07±3.05e+07p/sec/cm²/sr；低剂量组2.67e+07±3.94e+07p/sec/cm²/sr；高剂量组2.57e+07±4.15e+07p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

给药干预2周后三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组4.15e+07±6.58e+07p/sec/cm²/sr；低剂量组4.68e+07±7.47e+07p/sec/cm²/sr；高剂量组3.80e+07±6.04e+07p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

给药干预3周后三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组4.49e+07±6.92e+07p/sec/cm²/sr；低剂量组4.87e+07±7.41e+07p/sec/cm²/sr；高剂量组6.29e+07±9.48e+07p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

给药干预4周后三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组4.24e+07±8.27e+07p/sec/cm²/sr；低剂量组4.56e+07±7.63e+07p/sec/cm²/sr；高剂量组7.33e+07±1.14e+08p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

给药干预5周后三组luminescenceivis显像roi(mean±sd)分别为：对照组6.91e+07±1.02e+08p/sec/cm²/sr；低剂量组8.89e+07±1.29e+08p/sec/cm²/sr；高剂量组6.67e+07±9.88e+07p/sec/cm²/sr。数据结果统计分析提示三组体重统计学差异显著(p<0.01)。

图3为给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的体重。结果显示：

给药干预1周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组17.811±1.014g(9/9；100％)；低剂量组18.670±1.579g(10/10；100％)；高剂量组17.740±0.962g(10/10；100％)。

给药干预2周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组17.456±0.789g(9/9；100％)；低剂量组18.510±1.501g(10/10；100％)；高剂量组17.420±1.044g(10/10；100％)。

给药干预3周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组17.631±1.157g(8/9；88.89％)；低剂量组18.094±1.981g(9/10；90％)；高剂量组17.295±1.022g(10/10；100％)。

给药干预4周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组18.138±1.153g(8/9；88.89％)；低剂量组18.689±1.815g(9/10；90％)；高剂量组17.260±1.012g(10/10；100％)。

给药干预5周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组17.288±1.427g(8/9；88.89％)；低剂量组17.789±2.016g(9/10；90％)；高剂量组16.590±1.081g(10/10；100％)。

给药干预6周后三组体重(存活动物数量/总动物数量；生存率％)：对照组17.500±2.331g(4/9；44.44％)；低剂量组17.383±1.961g(6/10；60％)；高剂量组16.856±2.074g(9/10；90％)。数据结果统计分析提示三组体重无显著统计学差异。

图4为给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的肝脏h&e染色结果示意图，图5为给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠肿瘤h&e染色结果示意图，图6为给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肝脏图，图7是本发明实施例1的给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肿瘤图。由图4～图7可知，对照组肝脏形态改变，肝转移瘤可能，盐酸小檗碱干预两组肝脏组织形态肉眼下无显著差异；而三组小鼠胰腺原位移植瘤瘤体积存在显著差异(p<0.01)，盐酸小檗碱低剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组小于低剂量组。由此可知，盐酸小檗碱干预组的裸鼠胰腺原位移植瘤的生长速度明显低于对照组。

图8为对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的生存曲线图。结果显示：盐酸小檗碱高剂量组显著优于对照组(p<0.01)，干预42天后对照组盐酸小檗碱低剂量组及高剂量组生存率分别为：44.444％、56.667％和90.000％。

图9为对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠胰腺原位移植瘤重量分析图。结果显示：对照组与盐酸小檗碱低剂量组及高剂量组胰腺原位移植瘤重分别为：526.18±144.64mg、286.50±90.36mg、257.52±85.46mg；盐酸小檗碱低剂量组及高剂量组的抑瘤率分别为：54.4495％(p<0.01)、48.9423％(p<0.01)。根据以上可知，盐酸小檗碱即使在低剂量时对胰腺癌也具有显著的抑制作用。

综上，盐酸小檗碱对裸鼠胰腺癌原位移植瘤的影响实验研究提示，在盐酸小檗碱干预42天后，三组胰腺原位移植瘤瘤体积存在显著差异(p<0.01)，盐酸小檗碱低剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组小于低剂量组；三组之间的生存曲线比较，盐酸小檗碱高剂量组显著优于对照组(p<0.01)。据此，参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》中的实验动物与人剂量换算标准，成人体重按60kg来计算，我们发现成人一日口服剂量为24mg(低剂量)～48mg(高剂量)时就能达到对胰腺癌的良好抑制效果，而现在otc使用小檗碱用药剂量为每次0.1～0.3g，每日三次，也就是0.3～0.9g/d。由此可知，盐酸小檗碱在低剂量时即具有抗胰腺癌作用。

实施例2：

为了可以更好的模拟人体内的情况，本实施例选择spf级别小鼠c57bl/6(雌性，4～6周龄)建立胰腺癌模型，接种小鼠胰腺癌细胞panc02-luciferase1×10⁶个/只，评价盐酸小檗碱对胰腺癌原位移植瘤的生长的影响。

1、制备胰腺癌小鼠模型

具体实验方法：

按基质胶与1×10⁸个细胞每毫升的panc02-luciferase细胞体积比为1：1的比例配置细胞悬液原位，然后将细胞悬液原位注射到小鼠的胰脏上。以下描述用于原位植入胰腺肿瘤的剖腹手术的方式：

(1)小鼠称重并麻醉，每只小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物0.2ml，其中，氯胺酮和甲苯噻嗪剂量分别为100mg/kg和10mg/kg；

(2)依次用酒精、碘伏、酒精、碘伏、消毒手术部位。在手术麻醉下确认小鼠疼痛反射消失(从右到左，尾巴压迫)；

(3)从中线左侧约1厘米切开皮肤和腹膜约1.5厘米。暴露脾脏并用干棉签稳定其位置；

(4)邻近脾脏的胰腺尾部将被定位并暴露，并将20μl胰腺癌细胞悬液注射到胰腺。注射器将在胰内保持30～60秒，直到基质凝胶固化；

(5)将组织放回到腹腔中，腹壁用可吸收缝合线关闭，皮肤用不可吸收丝线关闭；

(6)再次用酒精和碘伏擦洗再次封闭的手术部位，保持小鼠处于温暖和干燥的状态；

(7)术后使用美洛昔康1～2mg/kg给药量的镇痛药，24小时采用7～10天；每日监测并记录术后护理卡片。

2、在接种胰腺癌细胞株成瘤后，随机分为两组：

第一组：对照组(生理盐水)和盐酸小檗碱组(盐酸小檗碱低剂量组：5mg/kg；盐酸小檗碱高剂量组：10mg/kg)，隔天口服灌胃给药；

第二组：对照组(生理盐水)和盐酸小檗碱组(50mg/kg和100mg/kg)。

3、将给药干预42天后的对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠进行称重。

4、通过注射苯巴比妥(150-200mg/kg，i.p)在实验结束时将动物处死，解剖取出肝脏，观察肝脏形态；取出胰腺原位移植瘤称重，统计分析盐酸小檗碱干预后两组瘤重变化及计算抑瘤率。

上述实验结果具体分析如下：

图10是给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肝脏图。结果显示：对照组肝脏形态改变，肝转移瘤可能，盐酸小檗碱干预两组肝脏组织形态肉眼下无显著差异；

图11是给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠取出的肿瘤图。结果显示：三组小鼠胰腺原位移植瘤瘤体积存在显著差异(p<0.01)，盐酸小檗碱低剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组显著小于对照组(p<0.01)，盐酸小檗碱高剂量组小于低剂量组，由此可知，盐酸小檗碱干预组的裸鼠胰腺原位移植瘤的生长速度明显低于对照组；

图12是给药干预42天后，对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠的体重。结果显示：盐酸小檗碱干预不对小鼠体重产生影响，三组间无统计学差异；

图13是对照组、盐酸小檗碱低剂量干预组、盐酸小檗碱高剂量干预组三组小鼠胰腺原位移植瘤重量分析图。结果显示：盐酸小檗碱干预显著降低小鼠原位移植瘤重量，p<0.01。

实施例1中的盐酸小檗碱对裸鼠胰腺癌原位移植瘤的影响实验研究提示，盐酸小檗碱在低剂量时即具有抗胰腺癌作用。根据第一组小鼠的实验结果(即图10～图13)可知，在本实施例c57bl/6小鼠中鉴定出类似的结果，并且通过口服强饲法施用的盐酸小檗碱也抑制肿瘤生长而不影响体重；

根据第二组小鼠的实验结果(即图14～图18)可知，即使更高剂量的盐酸小檗碱，在临床上可达到浓度，其在体内移植胰腺癌小鼠模型中有一定的抑瘤作用，但缺乏统计学意义。

实施例3：

本实施例通过体外实验，观察盐酸小檗碱对胰腺癌细胞株增殖，迁移等的抑制作用。

细胞增殖实验(mtt法)具体实验方法：

(1)配制mtt溶液，取100mg的mtt粉末并用20mlpbs溶解，配为的终浓度为5mg/ml溶液；

(2)将mtt完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光，保存于4℃避光保存两周内，或-20℃保存；

(3)用0.25％的胰酶消化对数期的胰腺癌细胞，重悬，计数；

(4)调整细胞浓度1×10⁵个细胞每毫升；

(5)铺于96孔板中，每个孔加入100μl的1×10⁵个细胞每毫升细胞悬液，即1×10⁴个细胞每孔；

(6)将96孔培养板置于培养箱培养过夜；

(7)第二天对板中的胰腺癌细胞分别给予盐酸小檗碱：0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μm，处理24、48、72小时，每个浓度设立6个副孔；

(8)分别于20、44、68小时，于每孔加入10μl的mtt检测工作液；

(9)避光，放入培养箱继续培养4小时；

(10)用酶标仪检测在595nm处的吸光度；

(11)以上实验重复3遍，分别计算每个时间点的抑制率，并绘制图。

上述实验中选用以下4种胰腺癌细胞：panc-1、miapaca2、panc02、sw1990。

上述实验结果具体分析如下：

图19为不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株panc-124、48、72小时后，抑制不同胰腺癌细胞株增殖的生存曲线。结果显示：在胰腺癌panc-1细胞中，盐酸小檗碱干预24、48、72小时后，ic50分别为260.7μm、53.97μm、11.66μm；盐酸小檗碱干预48小时后ic10和ic20分别为1.312μm和5.173μm。

图20为不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株miapaca224、48、72小时后，抑制不同胰腺癌细胞株增殖的生存曲线。结果显示：在胰腺癌miapaca2细胞中，盐酸小檗碱干预24、48、72小时后，ic50分别为40.87μm、27.87μm、20.32μm；盐酸小檗碱干预48小时后ic10和ic20分别为3.414μm和7.424μm。

图21为不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株panc0224、48、72小时后，抑制不同胰腺癌细胞株增殖的生存曲线。结果显示：在胰腺癌sw1990细胞中，盐酸小檗碱干预24、48、72小时后，ic50分别为52.29μm、11.74μm、8.387μm；盐酸小檗碱干预48小时后ic10和ic20分别为0.655μm和1.9μm。

图22为不同浓度盐酸小檗碱干预胰腺癌细胞株sw199024、48、72小时后，抑制不同胰腺癌细胞株增殖的生存曲线。结果显示：在小鼠胰腺癌sw1990细胞中，盐酸小檗碱干预24、48、72小时后，ic50分别为180.3μm、53.37μm、46.39μm；盐酸小檗碱干预48小时后ic10和ic20分别为10.723μm和19.775μm。

综上可知，盐酸小檗碱对胰腺癌细胞增殖的抑制作用呈明显的时间依赖性和剂量依赖性。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。